2.2. Правила проведення фотометрії та розрахунок результатів досліджень

В роботі з фотометричною апаратурою слід дотримуватись умов вимірювання, що рекомендуються методикою виконання досліджень. Таких умов, як правило, три: товщина робочого шару кювети, довжина світлової хвилі і спосіб розрахунку результатів аналізу. Для вимірювання за допомогою фотоколориметрії застосовують оптичні кювети з товщиною робочого шару 5 мм або 10 мм, рідше 3 мм.

Довжина світлової хвилі, яка зазначається в методиках, визначається фізико-хімічними властивостями розчинів. Візуальними проявами таких властивостей може бути прозорість і забарвлення розчинів.

Якщо в методиці не вказані товщина робочого шару кювети і довжина світлової хвилі, то можливо підібрати їх самостійно. Для вибору довжини світлової хвилі проводять вимірювання на всіх довжинах хвиль, що можливо встановити у приладі. Зупиняються на тій довжині, що дає найбільшу екстинкцію. Чим вище значення екстинкції, тим менше буде ціна однієї позначки шкали екстинкції та величина можливих випадкових помилок в самому процесі вимірювання.

Існують наступні способи розрахунків результатів досліджень в клінічній біохімії: 1) використання умовних одиниць; 2) розрахунки за стандартними (еталонними) розчинами; 3) розрахунки за калібрувальним графіком; 4) розрахунки за коефіцієнтом перерахунку (за фактором).

Умовні одиниці (у.о.) – це примітивний варіант визначення результатів аналізу. Найчастіше це безпосередньо одиниці екстинкції розчинів. В деяких лабораторних методиках екстинкцію, одержану при вимірюванні, множать на 100, 1000 або інший коефіцієнт. Після перетворення отримують показники, які більш зручні для роботи або для порівняння. Використовують умовні одиниці в методиках, що найдавніше використовують у лабораторіях, наприклад, для визначення сіромукоїдів, сіалових кислот, ліпопротеїдів.

Розрахунки результатів досліджень за стандартними (еталонними) розчинами. Стандартні розчини обробляють паралельно з серією досліджуваного біологічного матеріалу в тих же умовах, що й досліджуваний матеріал. Їх використовують в тих випадках, коли мова йде про складні методики, що дають значні похибки. Стандартні розчини нівелюють всі можливі відхилення, але недоліком їх використання є підвищений розхід реактивів і робочого часу, що пов'язано з необхідністю регулярної постановки стандартних проб.

Стандартні розчини мають строго визначену концентрацію певної речовини. Готують їх з реактивів кваліфікації чистоти "х.ч." Зазвичай в біохімічних наборах разом з ре­активами знаходиться і стандартний розчин речовини, що визначають. Наприклад, стандартні розчини є в наборах для визначення глюкози, сечовини, холестерину. Концентрація речовини в стандартному розчині повинна бути близька до фізіологічно нормальних значень відповідного компоненту в біологічних рідинах. Наприклад, концентрація стандартного розчину холестерину 5,2 ммоль/л, що знаходиться в межах фізіологічної норми холестерину в крові.

Розрахунок результатів досліджень, що виконується за стандартними розчинами, проводять за простою арифметичною пропорцією:

Е_ст – С_ст

Е_д – С_д С_д = С_ст · Е_д/Е_ст,

де Е_ст – екстинкція стандартного розчину, Е_д – екстинкція діагностичної проби, С_ст – концентрація стандартного розчину, С_д – концентрація діагностичної проби.

Розрахунки результатів досліджень за калібрувальним графіком є зручним варіантом розрахунків, що не потребує зайвих витрат робочого часу та реактивів, як при постановці стандартних проб. Використання калібрувальних графіків доцільно тільки в методиках зі стабільними умовами проведення та добрим підпорядкуванням результатів вимірювання основному закону фотометрії. Калібрувальні графіки будують для кожного фотометру окремо і неприпустимим є їх використання для іншого приладу, навіть у випадку використання однотипних приладів. Періо­дично, звичайно не рідше одного разу на рік, калібрувальні графіки слід перевіряти, а при необхідності – будувати заново.

Будують калібрувальні графіки одноразово при дослід­женні серії калібрувальних розчинів певного складу. Серія складається з 3 – 5 стандартних розчинів, які відрізняються між собою концентрацією у порядку пропорційного збільшення її величини. Діапазон концентрацій повинен охоплювати, як значення фізіологічної норми, так і найбільш імовірні межі патології для досліджуваного компоненту біологічних рідин. З кожного стандартного розчину проби беруть у паралелях для запобігання можливих неточностей піпетування. Для кожної концентрації треба одержати не менше трьох результатів значень екстинкції. Для побудови графіку розраховують середнє арифметичне значення екстинкції. Будують калібрувальний графік на міліметровому папері. Вибирають масштаб значень концентрації й екс-тинкції таким чином, щоб калібрувальна крива проходила під кутом 45^о або наближалась до цього значення. Для зручності в роботі на основі калібрувального графіку складається калібрувальна таблиця, де навпроти кожного значення екстинкції вказується відповідна їй концентрація досліджуваного компоненту (лабораторна робота № 4).

Вимоги до оформлення калібрувальних графіків.

1.  Вказується точна назва методу дослідження і за­водський номер фотометру, до якого побудовано графік.

2.  Вказується довжина світлової хвилі, товщина робочого шару (товщина кювети), вихідні дані для побудови графіку та дата його побудови.

3.  Графік підписує спеціаліст, який його виконав.

Розрахунки результатів досліджень за допомогою коефіцієнту перерахунку (фактора перерахунку). Даний варіант розрахунку найбільш простий і швидкий. Розра­хунки виконують за формулою:

С_д = F · Е_д ,

де С_д – концентрація досліджуваного компоненту, F – коефіцієнт перерахунку, Е_д – екстинкція досліджуваної реакційної суміші.

Застосування коефіцієнту перерахунку, як і калібрувального графіка, обмежується методикам з добрим підпорядкуванням результатів вимірювань основному закону фотометрії. Коефіцієнт перерахунку є специфічною величиною для кожного окремого тесту. Як правило, коефіцієнт перерахунку вказується в методиці, але краще його розрахувати самостійно. При цьому враховуються особливості проведення реакції та технічні можливості вимірювальної апаратури лабораторії. Щоб вивести коефіцієнт перерахунку, проводять дослідження стандартних розчинів необхідної речовини у відповідності з методичними вимогами, аналогічними для біологічного матеріалу, або використовують побудований калібрувальний графік. Коефіцієнт перерахунку обчислюють за формулою:

F = .

Коефіцієнти перерахунку вимагають періодичної перевірки, звичайно, не рідше одного разу на рік, при необхідності виводять заново.

Сьогодні актуальність розрахунків даного типу зростає. Це пов'язано з комп'ютеризацією сучасних фотометрів, а також з використанням у роботі КДЛ біохімічних автоаналізаторів. В апаратурі такого рівня коефіцієнт перерахунку вводиться у пам'ять комп'ютера і при вимірюванні екс-тинкції досліджуваного розчину концентрація компоненту розраховується і видається автоматично.

Розрахунки при проведенні кінетичних методів застосовують при дослідженні ферментативної активності біоматеріалу. При їх використанні визначають швидкість ферментативної реакції шляхом серії послідовних вимірювань екстинкції досліджуваної реакційної суміші через однаковий проміжок часу. Аналіз проводять безпосередньо в фотометрі, у термостатованих кюветах, при сталій температурі (37 ^оС). Розраховують середнє значення зміни екс-тинкції з часом: ΔЕ/Δt. Це співвідношення є характеристикою кінетики ферментативної реакції.

Кінцева формула для розрахунку активності ферменту (А) у кінетичному методі:

А = ,

де R – коефіцієнт, який розраховується з додаткових параметрів, що обумовлені в кожній конкретній методиці (об'єм реакційної суміші, товщина фотометричних кювет, молярний коефіцієнт екстинкції реагенту).