Визначення активності α-амілази в біоматеріалі

α-Амілаза – фермент, що здійснює гідролітичне роз­щеплення полісахаридів (крохмалю, глікогену й інших продуктів, що містять три та більше залишків глюкози) до декстринів і мальтози. Процес розпаду полісахаридів – стадійний:

крохмаль → еритродекстрини → ахродекстрини →

мальтотетроза → мальтоза → глюкоза.

Кінцевий продукт дії амілази (глюкоза) не дає кольорової реакції з йодом.

Найбільш багаті на амілазу підшлункова та слинні залози. Амілаза секретується в кров головним чином із цих органів. Плазма крові людини містить амілази двох ізозимних типів: панкреатичну (р-тип), яка секретується під­шлунковою залозою, і слинну (S-тип), яка секретується слинними залозами. Вважають, що в здорових людей у сироватку крові входять дві ізоамілази р-типу і три – S-типу. У кожному з цих типів амілаз є декілька ізоформ. Ізоамілази слини поділяють на два сімейства (у залежності від їхньої молекулярної маси й електрофоретичної рухливості). З сечею виділяється в основному р-амілаза, що є однією з причин більшої інформативності про функціональний стан підшлункової залози. Вважають, що 65 % амілазної активності сечі обумовлено панкреатичною амілазою, у той час як 60 % амілолітичної активності сироватки забезпечується амілазою слинних залоз. При гострому панкреатиті вона збільшується в сироватці до 89 % і в сечі до 92 % без зміни показників амілаз слинних залоз. У здорових людей вміст слинної та панкреатичної амілази в крові приблизно однаковий, у сечі ж вміст панкреатичної амілази в 2 рази більший, ніж амілази слинних залоз.

Амілолітичну активність мають кишечник, печінка, нирки, легені, тонка кишка, жирова тканина. Проте далеко не всі з перерахованих органів є продуцентами амілази. Фермент пов'язаний як із білками плазми крові, так і з фор­меними її елементами. Можливо, це є формою депонування і транспорту ферменту.

Методи вивчення активності α-амілази в біологічних рідинах (сироватці, сечі, поті) поділяються на дві основні групи:

1. Сахарифікуючі – базуються на дослідженні сахарів, що утворюються з крохмалю (глюкози і мальтози).

2. Амілокластичні – базуються на визначенні залишку нерозщепленого крохмалю за ступенем інтенсивності його забарвлення з йодом. Молекули декстринів, що мають 30 гексозних залишків, дають з йодом синє забарвлення розчину; молекули з 8 – 2 залишків – червоне; молекули з вхідними 4 – 5 гексозними залишками не забарвлюють реактив.

Амілокластичні методи більше специфічні і чутливі, ніж сахарифікуючі.

Лабораторна робота № 10 Визначення активності α–амілази зі стійким крохмальним субстратом. Метод Каравею

Мета: Дослідити активність α-амілази за реакцією розщеплення полісахаридів, за отриманими результатами зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 91).

Принцип методу: α-амілаза гідролізує розщеплення крохмалю з утворенням кінцевих продуктів, які не дають кольорової реакції з йодом. Про активність α-амілази судять за вимірюванням зменшення концентрації крохмалю.

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2, водяний термостат, субстратно-буферний розчин, 0,2 г крохмалю, основний розчин йоду, робочий розчин з молярною концентрацією еквівалентів йоду 0,01 моль/л, досліджувана сироватка крові.

Готування робочих розчинів

1. Субстратно-буферний розчин. 13,3 г безводного нат­рій гідрогенфосфату і 4,3 г бензойної кислоти кип'ятять у 250 мл дистильованої води. Суспендують 0,2 г розчинного крохмалю в невеличкій кількості холодної води і вводять у киплячу суміш. Кип'ятять 1 хвилину, охолоджують і доводять водою до 500 мл.

2. Основний розчин йоду. 30 г калій йодиду розчинити в 250 мл дистильованої води, внести 12,7 г кристалічного йоду і довести об’єм до 1000 мл (можна використовувати розчин Люголю).

3. Робочий розчин йоду. 25 г калій фториду внести в колбу, додати 350 мл дистильованої води, внести 50 мл основного розчину йоду і довести об’єм до 500 мл. Якщо в робочий розчин не додавати калій фториду, то його необхідно готувати перед кожним дослідом.

Хід визначення

У дві колби об’ємом 25 мл (досліджувана та контрольна) відмірюють по 2,5 мл крохмального субстрату. Дослід­жувану пробу прогрівають у термостаті при температурі 37 ⁰С протягом 5 хвилин, після чого до неї додають 0,1 мл сироватки або відфільтрованої сечі. Вміст пробірок перемішують та інкубують протягом 7,5 хвилин при температурі 37 ⁰С. Відразу ж після прогрівання досліджуваної проби в обидві колби додають по 2,5 мл робочого розчину йоду, обсяг реактивів доводять до 25 мл дистильованою водою і негайно заміряють екстинкцію розчинів за довжини хвилі 630 – 690 нм (червоний світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 10 мм проти дистильованої води (розд. 2.1.1).

Розрахунок активності α-амілази виконують за формулою:

,

де  – кількість крохмалю в мг, який гідролізований 1 мл біологічної рідини за 1 годину інкубації при 37 ⁰С, Е_контр. – екстинкція контрольної проби, Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби, К – коефіцієнт розведення; 2 – кількість крохмалю, введеного в досліджувану і контрольну проби, (мг); 80 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл біологічної рідини і 1 годину інкубації.

Норма активності α–амілази

в сироватці крові : 12 – 32 г/(год. · л).

Лабораторна робота №11

Визначення активності α–амілази

зі стійким крохмальним субстратом.

Метод Каравею (модифікований)

Мета: Дослідити активність α-амілази за реакцією розщеплення полісахаридів, за отриманими результатами зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 91).

Принцип методу: α-амілаза гідролізує розщеплення крохмалю з утворенням кінцевих продуктів, які не дають кольорової реакції з йодом. Про активність α-амілази судять за вимірюванням зменшення концентрації крохмалю.

Прилади та матеріали: колориметр фотоелектричний концентраційний КФК-2, водяний термостат, субстратно-буферний розчин, 0,2 г крохмалю, основний розчин йоду, робочий розчин йоду – розчин з молярною концентрацією еквівалентів І₂ 0,01 моль/л, досліджувана сироватка крові.

Хід визначення

У звичайну хімічну пробірку вносять 1 мл розчину крохмалю, субстрат прогрівають 5 хвилин у водяному термостаті при температурі 37 ⁰С, після чого до нього додають 0,02 мл сироватки. Пробу знову вміщують рівно на 5 хвилин у термостат. Контрольну пробу проводять так саме, як і досліджувану, але сироватку в неї не вносять. Потім у всі пробірки (досліджувані і контрольні) доливають по 1 мл робочого розчину йоду і по 8 мл дистильованої води, пробірки добре збовтують і розчини негайно фотометрують за допомогою фотоколориметру за довжини хвилі 630 – 690 нм (червоний світлофільтр) у кюветі з товщиною шару 10 мм (розд. 2.1.1). Розчин порівняння – дистильована вода.

Розраховують активність ферменту (А_ам.) в грамах розщепленого крохмалю на 1 л сироватки за 1 годину інкубації при температурі 37 ⁰С за формулою:

,

де 240 = 0,4 ∙ 600; 0,4 – кількість крохмалю (мг), внесеного в досліджувану та контрольну проби; 600 = 50 ∙ 12; (50 – коефіцієнт перерахунку на кількість крохмалю в г, яка гідролізована 1 л сироватки; 12 – коефіцієнт перерахунку з 5 хвилин на 60 хвилин), Е_контр. – екстинкція контрольної проби, Е_досл. – екстинкція досліджуваної проби.

Норма активності –амілази в сироватці крові – 12 – 32 г/(год. · л).