Лабораторна робота № 6 Визначення сечовини в сироватці крові та сечі за кольоровою реакцією з діацетилмонооксимом

Мета: Опанувати уніфікований колориметричний метод визначення сечовини у біологічних рідинах, розрахувати кількість сечовини в сироватці крові та сечі і зробити клініко-діагностичний висновок (стор. 62).

Принцип методу: Сечовина утворює з діацетилмоно-оксимом при наявності тіосемікарбазиду і солей феруму в кислому середовищі забарвлені речовини, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту сечовини в сироватці крові та сечі.

Прилади та матеріали: фотометр аналітичний медичний МЕФАН–8001, штатив з пробірками, градуйовані піпетки, пробки з алюмінієвою фольгою, реактив № 1 – розчин діацетилмонооксиму і солей феруму, реактив №2 – розчин тіосемікарбазиду і солей феруму, еталон сечовини (16,65 ммоль/л), розчин з масовою часткою трихлораце­татної кислоти 5 %, розчин з масовою часткою H₂SO₄ 10 – 15 %, (або розчин з масовою часткою HCl 25 %), дос­лід­жувана сироватка крові, досліджувана сеча (розводиться перед аналізом у 50 або 100 разів).

Готування робочого реактиву

Ампули з реактивами № 1 і  № 2 розкривають під тягою, їхній вміст кількісно переносять у мірну колбу на 100 мл і доводять до мітки дистильованою водою. Перемішують, переливають у посуд і зберігають у холодильнику при температурі 0 – 5 ⁰С.

Еталон сечовини готовий до роботи.

Хід визначення

У хімічних пробірках готують серію розчинів відповідно до таблиці 7.

Таблиця 7

Вміст робочих розчинів

Інгредієнти, мл	Проба 1	Проба 2	Еталон	Контроль
Робочий реактив	1,0	1,0	1,0	1,0
Розчин H2SO4	1,0	1,0	1,0	1,0
Сироватка крові	0,01	–	–	–
Розведена сеча		0,01	–	–
Еталон сечовини		–	0,01	–
Дистильована вода		–	–	0,01

Пробірки закривають пробками з алюмінієвою фольгою і вміщують у киплячу воду на 10 хвилин. Потім про­бірки охолоджують і по закінченні 15 хвилин вимірюють екстинкцію досліджуваних проб та еталона проти конт­рольного розчину за довжини хвилі 540 нм (зелений світлофільтр). Правила роботи на фотометрі МЕФАН–8001 приведені у розділі 2.1.4.

Розрахунок кількості сечовини в сироватці крові виконують за формулою:

де С – концентрація сечовини, ммоль/л; E_досл. – екстинкція досліджуваної проби; Е_ст. – екстинкція стандартної проби;  – концентрація сечовини в стандартній пробі, 16,65 ммоль/л.

Розраховують кількість сечовини в сечі за цією ж формулою з урахуванням коефіцієнта розведення.

Норма вмісту сечовини в сироватці крові: 2,5 – 8,3 ммоль/л; у сечі: 330 – 580 ммоль/л.

Примітка. Якщо вміст сечовини в крові понад 23 ммоль/л, пробу слід розвести дистильованою водою і провести аналіз повторно. Через нестійкість забарвленого комплексу сечовини з діацетилмонооксимом і залежності кольору від умов нагрівання, калібрувальний графік в цій методиці будувати не рекомендується. При визначенні вмісту сечовини в сечі, починаючи з розміру екстинкції 0,13 – 0,15, потрібно збільшити розведення сечі.