\2. Визначення активності амінотрансфераз.

Принцип методу. Амінотрансферази – ферменті які вміщують у якості коферментів фосфопірідоксамін, каталізують зворотній перенос аміногруп з амінокислот на α – кетокислоти. Визначення концентрації α – кетокислот, які утворюються при трансамінуванні лежить в основі дінітрофенілгідразінового методу визначення активності трансаміназ.

Техніка роботи. Визначення аспартатамінотрансферази (АсАТ). В пробірку вносять 0,5 мл субстратно-буферної суміші для визначення АсАТ, витримують у термостаті при t =37оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37оС 60 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідразіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин.

Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються при λ = 560нм. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ). В пробірку вносять 0,5

мл субстратно-буферної суміші для визначення АлАТ, витримують у термостаті при t =37оС протягом 5 хвилин, додають 0,1 мл сироватки та інкубують при t =37оС 30 хвилин. Потім додають 0,5 мл розчину дінітрофенілгідрозіну та витримують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі. Додають 5 мл 0,4 М розчину NaOH, перемішують та залишають на 10 хвилин. Вимірюють оптичну щільність проб, які досліджуються. Контрольні проби обробляють так, як дослідні, але сироватку додають після інкубації проб.

Розрахунок активності ферментів проводять по калібровочному графіку. При будові калібровочного графіку на осі ординат відкладають значення оптичної щільності, а на осі абсцис - вміст ПВК.

Фізіологічні рівні: для АсАТ – 0,1-0,5, для АлАТ – 0,1-0,7 мкмоль ПВК на 1 мл сироватки за 1 годину інкубації при t =37оС.

ТЕМА 18. ДОСЛІДЖЕННЯ ПРОЦЕСІВ ДЕТОКСИКАЦІЇ АМІАКУ ТА БІОСИНТЕЗУ СЕЧОВИНИ

Актуальність теми.

Розуміння біохімічних процесів, які лежать в основі знешкодження аміаку, а також правильне трактування зміни концентрації сечовини в крові та сечі, вкрай необхідне практикуючому лікарю для правильної постановки діагнозу, оцінки стану хворого та динамічного спостереження за якістю призначеного лікування. Зміна вмісту сечовини є важливим показником кінцевого етапу білкового обміну. В нормі з сечею виділяється в сеpедньому 25-30 г сечовини на добу. Пpи печінкової недостатності синтез сечовини послаблюється, тому ії концентpацiя в кpовi зменшується.

Пpи ниpковiй або серцево-судинній недостатностi видiлення сечовини з сечею зменшується, а piвень в кpовi - пiдвищується, внаслiдок чого pозвивається уpемiя - - отpуєння оpганiзму пpодуктами азотистого обмiну. Кiлькiсть сечовини в кpовi збiльшується також пpи посиленні катаболізму бiлкiв (пpоменева хвоpоба, злоякiснi утворення, iнтоксикацiї, лихоманка та iн.). Аналіз є обов'язковим пpи обстеженні та оцінки стану хворих з патологією нирок та печінки.

Мета та вихідний рівень знань.

Загальна мета.

Вміти аналізувати зміни концентрації сечовини в крові та інтерпретувати отримані результати. Освоiти унiфiкований метод кiлькiсного визначення сечовини в кpовi. Вивчити етапу біосинтезу сечовини.

Конкретні цілі:

35

1. Трактувати метаболічні закономірності утворення та знешкодження аміаку, циркуляторного транспорту аміаку, біосинтезу сечовини.

2. Аналізувати зміни в системах транспорту та знешкодження аміаку при генетичних аномаліях ферментів метаболізму аміаку.

Вихідний рівень знань-вмінь: знати хімічну структуру сечовини та речовин які приймають участь в процесах знешкодження аміаку.

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1.Оцінювати за біохімічними показниками порушення процесів знешкодження аміаку при вроджених та набутих вадах метаболізму.

2.Підготувати схеми в електроному варіанті:

а) орнітиновий цикл знешкодження аміаку; б) взаємозв’язок процесу утворення сечовини з дезамінуванням, переамінуванням амінокислот та енергетичним обміном.

Алгоритм лабораторної роботи.

Кількісне визначення вмісту сечовини в крові з діацетилмонооксимом.

Принцип методу: сечовина утворює з діацетилмонооксимом комплекс рожевочервоного кольору. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації сечовини в крові.

36

Кип’ятити 10 хвилин на водяній бані всі пробірки, після охолодження колориметрувати проти контролю при λ=540 нм (зелений світлофільтр), кювета 5 мм.

Розрахунок:

Сечовина = ЕстЕд .. ×16,65 = ммоль/л, де Ед. – екстинкція дослідної проби,

Ест. – екстинкція стандартної проби (в 1 мл 16,65 ммоль/л сечовини) Концентрація сечовини у сироватці крові 3,3-8,3 ммоль/л Екскреція з сечею 20-30 г/доб

ТЕМА 19. ДОСЛІДЖЕННЯ ШЛЯХІВ ВИКОРИСТАННЯ АМІНОКИСЛОТ В БІОСИНТЕТИЧНИХ ПРОЦЕСАХ (БІОСИНТЕЗ ГЛУТАТІОНУ, КРЕАТИНУ ТА

ПОРФІРИНІВ).

Актуальність теми.

Креатинін – це кінцевий продукт обміну креатинфосфату тканин. Підвищена екскреція із сечею креатиніну спостерігається у хворих з лихоманкою, гострими інфекціями, при цукровому діабеті. Креатинін – азотистий шлак, але завдяки азотвидільній функції нирок кров від нього очищається. При патології нирок, що супроводжується порушенням азотвидільної функції, а також при гострій серцевій недостатності, креатинін накопичується в крові, а виділення його із сечею знижується. Тому кількісне визначення креатиніну в крові та сечі є одним із обов’язкових аналізів при хворобах нирок. Креатинфосфат застосовують в клініці для лікування хворих з серцево-судинною недостатністю.

В результаті обміну в організмі гемоглобіна, міоглобіна, цитохромів та інших гемопротеїдів, до складу яких входять тетрапірольні простетичні групи, відбувається утворення пігментів – порфіринів. Існують спадкові порушення синтезу порфіринів – порфірії. Залежно від місця прояву специфічного ферментного дефекту, розрізняють еритропоетичні та печінкові порфірії. Основними клінічними проявами порфірій є підвищення чутливості до світла, неврологічні порушення.

Мета та вихідний рівень знань

Загальна мета.

Засвоїти метод кількісного визначення креатиніну в сечі, вміти оцінити результати аналізу. Знати кольорову реакцію на креатин з пікриновою кислотою, вміти розраховувати результат аналізу.

Вивчити процес синтезу порфіринів. Вміти використовувати знання про спадкові порушення обміну порфіринів.

Конкретні цілі:

1.Пояснювати біохімічні механізми утворення креатину та креатиніну.

2.Аналізувати клінічне значення порушень обміну креатину та креатиніну.

3.Трактувати роль глутатіону в обміні органічних пероксидів.

4.пояснювати біохімічні принципи регуляції обміну порфіринів, виникнення та розвитку спадкових порушень синтезу порфіринів – порфірій.

37

Вихідний рівень знань-вмінь: вміти писати будову амінокислот – попередників синтезу креатину та глутатіону; вміти писати будову попередників пірольних кілець порфіринів (гліцину, сукциніл-КоА). Знати будову порфіринів.

Оpiєнтувальна каpтка для самостiйного вивчення студентами навчальної лiтеpатуpи пpи пiдготовцi до заняття.

5.2.Реакції біосинтезу протопорфірину IX; утворення гему.

5.3.Регуляція синтезу порфіринів.

5.4.Спадкові порушення обміну порфіринів (ензимопатії): еритропоетична порфірия, печенкові порфірії, неврологічні порушення, фотодерматити.

Індивідуальна самостійна робота студентів. Підготувати реферат на тему:

1.Сучасні біохімічні методи дослідження функції нирок.

2.Біологічна роль системи глутатіона в антиоксидантному захисті.

3.Скласти схему синтезу гема та вказати на ній ферменти, порушення синтезу яких призводить до розвитку порфірій.

4.Скласти порівняльну схему еритропоетичних та печінкових порфірій (вид порфірії, дефект ферменту, плазма крові, сеча, кал, домінуючий синдром).

Алгоритм лабораторної роботи. Кільнісне визначення креатиніну в сечі.

Принцип методу: креатинін при взаємодії з пікриновою кислотою у лужному середовищі утворює забарвлені сполуки, інтенсивність забарвлення яких пропорційна концентрації креатиніну в сечі.

Екскреція креатиніну: ♂- 1,0-2,0 г/доб ♀- 0,8-1,8 г/доб

Хід роботи:

У колбу об’ємом 100 мл наливають 1 мл сечі, 1 мл NaOH, 1,5 мл розчину пікринової кислоти, перемішують і залишають на 10 хвилин. Потім доводять об’єм до 100 мл дист. водою. Паралельно виконують контроль: 1 мл Н2О, 1 мл NaOH, 1,5 мл пікринової кислоти, перемішують та доводять об’єм до 100 мл дист. водою.

38