литература для всех / zolotov_yu_a_red_osnovy_analiticheskoy_khimii_v_2_knigakh_kn

Каталитические методы в отличие от некаталитических неселектив­ ны. Можно, варьируя условия проведения реакции (концентрация реаген­ тов, pH, природа растворителя), используя активаторы и различные мас­ кирующие вещества, добиться того, что катализатором в индикаторной реакции будет только одно соединение — определяемый компонент. Но и в этом случае большое число веществ, взаимодействующих с катализато­ ром или другими компонентами реакции, может заметно менять скорость процесса и тем самым мешать проведению анализа. При определении соединения-катализатора в многокомпонентных смесях обычно отделяют определяемый компонент от мешающих веществ и основы анализируемо­ го объекта. Развиваются также методы анализа, сочетающие различные методы отделения с каталитическим методом определения. Примером могут служить экстракционно-каталитические методы, в которых опреде­ ляемый катализатор предаарительно выделяют экстракцией, или сорбци- онно-каталитический метод, в котором индикаторные каталитические реакции проводят на сорбентах различной природы (бумага, силикагель, пенополиуретан и т. д.).

Среди каталитических методов высокую чувствительность и селек­ тивность имеют ферментативные методы, основанные на использова­ нии реакций, катализируемых ферментами — биологическими катализатора­ ми, ускоряющими химические процессы в живых организмах (см. разд. 9.4). Часто в этих случаях используют ферментные электроды (см. гл. 10).

Кинетические методы при условии строгого соблюдения условий проведения анализа не уступают другим методам по точности, достаточ­ но экспрессии, легко поддаются автоматизации. В практике аналитиче­ ской химии эти методы применяют при анализе смесей близких по свой­ ствам органических соединений (некаталитический вариант); определе­ ния микроколичеств металлов первого переходного ряда и группы плати­ новых металлов, ряда анионов ( Г , С Г, Вг“ ) (каталитический метод). Органические вещества, особенно токсичные и лекарственные препараты, определяют как по их собственному каталитическому действию, так и их активирующему либо ингибирующему действию на металлыкатализаторы. Каталитические методы используют в анализе промыш­ ленных, биологических объектов и объектов окружающей среды.

9.4. Биохимические методы

Среди современных методов химического анализа важное место зани­ мают биохимические методы. Все более широкое использование этих мето­ дов связано, во-первых, с возможностями решения с их помощью ряда акту-

110

альных задач аналитической химии и, во-вторых, с тем, что с развитием био­ логии, биохимии, методов разделения и очистки веществ все более доступ­ ными и дешевыми становятся средства для проведения такого анализа.

К б и о х и м и ч е с к и м м е т о д а м относят методы, основанные на использовании процессов, происходящих с участием биологических компонентов (ферментов, антител и т. п.). Аналитическим сигналом при этом чаще всего являются либо начальная скорость процесса (см. разд. 9.3), либо конечная концентрация одного из продуктов реакции, определяемая любым инструментальным методом (спектрофотометрическим, люми­ несцентным, электрохимическим и т. д.). Рассмотрим сущность и области применения биохимических методов.

Среди разновидностей биохимических методов химического анализа (иммунохимических, ферментативных, РНК и ДНК-зондов и др.) наибо­ лее часто используют ферментативные и иммунохимические.

Ферментативные методы основаны на использовании реакций, ката­ лизируемых ферментами — биологическими катализаторами, отли­ чающимися высокой активностью и избирательностью действия.

Многие ферменты — комплексы, состоящие из нескольких молекул белка (субъединиц), соединенных между собой нековалентными связями. Установлено, что белковая часть фермента (апофермент) может быть связана с небелковыми компонентами (кофакторами); такой комплекс называется холоферментом.

Активным центром фермента называют участок молекулы, на котором происходит превращение субстрата (вещества, катализируемого фермен­ том). Иногда выделяют участок, связывающий субстрат, и каталитический участок, содержащий каталитически активные группы белка или кофакто­ ры (часто эти участки совпадают).

Для многих ферментов, состоящих из субъединиц, характерно наличие так называемых регуляторных участков, которые взаимодействуют с вещест­ вами, влияющими на активность фер­ мента, т. е. его эффекторами — ак­ тиваторами, повышающими актив­ ность, или ингибиторами, понижаю­ щими активность фермента (рис. 9.34).

Ферменты обладают рядом уникальных свойств, которые выде-

111

ляют их на фоне обычных органических катализаторов гомогенного типа. Прежде всего это необычайно высокая каталитическая активность.

Так, добавка незначительной концентрации фермента (1(Г9 -1(Г 7 М) ус­ коряет превращение субстрата в 10*-101 2 раз. Другое не менее важное свойство ферментов — избирательность (специфичность) их действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения. Специфичность определяется способностью фермента превращать только данный тип субстратов в определенных реакциях и условиях. Эти свойст­ ва ферментов обусловлены сложной структурой макромолекул белка и сложным механизмом их действия. Механизм этот заключается, в частно­ сти, в сорбции субстрата на ферменте и образовании ими активного ком­ плекса в результате гидрофобных, полярных и ионных взаимодействий; в этом комплексе происходит сближение и ориентация реагирующих групп фермента и субстрата. Взаимодействие между ферментом и сорбирован­ ным субстратом имеет полифункциональный характер, при котором мо­ лекула субстрата подвергается атаке сразу нескольких каталитических групп активного центра фермента, что и обусловливает, в частности, его высокую каталитическую активность.

Важным свойством ферментов, которое необходимо учитывать при практическом их использовании, является стабильность, т. е. способ­ ность сохранять каталитическую активность в течение достаточно дли­ тельного времени. При хранении и особенно в ходе ферментативной ре­ акции фермент может частично или полностью терять свою каталитиче­ скую активность (инактивироваться).

Одним из эффективных способов стабилизации ферментов является их иммобилизация, т. е. перевод в водонерастворимое состояние путем связывания с носителем или модифицирование водорастворимыми поли­ мерами с полным или частичным сохранением ферментами каталитиче­ ской активности. Разработаны физические и химические способы иммо­ билизации ферментов. К физическим способам иммобилизации относят­ ся: адсорбция на нерастворимых носителях; включение в поры геля или полимера; пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы полупроницаемой перегородкой (мембраной). Хи­ мическая иммобилизация осуществляется за счет создания ковалентных связей между белком и носителем с участием «сшивающих» агентов (на­ пример, глутарового альдегида).

Повышение стабильности ферментов вследствие иммобилизации значительно облегчает их хранение, транспортировку, применение в экс­ педиционных условиях, а возможность многократного использования иммобилизованных ферментов значительно снижает стоимость фермен­ тативных методов анализа.

112

Ферментативными методами можно определять субстраты, актива­ торы, обратимые и необратимые ингибиторы ферментов. Пределы обна­ ружения определяемых веществ зависят не только от каталитической ак­ тивности фермента, но и от других характеристик используемой индика­ торной реакции.

Простейшая односубстратная реакция описывается обычно схемой Михаэлиса — Ментен

* -1

где Е — фермент; S — субстрат; ES —промежуточный комплекс фермен­ та с субстратом (комплекс Михаэлиса); Р — продукт. При [Е] « [S] 0 на­ чальная стационарная скорость образования продукта описывается урав­ нением

страта ограничена константой Михаэлиса ( Кт ). Нижняя граница опре­

деляемых концентраций субстрата определяется величиной v0, которая

может быть зафиксирована с помощью используемого для наблюдения

ние высокоактивного фермента (большое значение кт ) и повышение его

концентрации в реакционной смеси может существенно снизить предел обнаружения субстрата.

Несколько другие кинетические закономерности следует учитывать при оп­ ределении тех веществ, которые являются эффекторами ферментов.

Обратимые неконкурентные ингибиторы, взаимодействуя с ферментом, об­

где1—ингибитор; Л", =[Е1]/([Е]-[1]) — константа ингибирования.

Можно показать, что верхняя граница определяемых концентраций обрати­ мых ингибиторов зависит от величины Кх. Аналогичные ограничения существу­ ют и при определении обратимых активаторов ферментов.

Разработано большое число высокочувствительных и селективных ферментативных методов определения субстратов и эффекторов фермен­ тов — неорганических (ионов металлов, анионов) и органических (N-, S-, Р-, О-содержащих) соединений. Методы определения эффекторов менее селективны, но часто более чувствительны, чем методы определения суб­ стратов.

Втабл. 9.15 приведены некоторые примеры определения субстратов

иингибиторов ферментов.

Та б л и ц а 9.15. Примеры использования ферментов для определения их субстратов (I) и ингибиторов (П)

Ферментативные методы широко применяют при анализе разнооб­ разных объектов — медицинских (биологических жидкостей, крови, тка­ ней живых организмов); пищевых продуктов; фармацевтических препа­ ратов; для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов в производстве. Эти методы используют для определения ток­ сичных органических и неорганических соединений в объектах окру­ жающей среды — сточных и природных (речных, морских, подземных и др.) водах, почвах, листьях растений и т. д.

114

Иммунохимические методы анализа

Иммунохимические методы анализа (ИХА) основаны на специфиче­ ском связывании определяемого соединения — антигена соответствую­ щими антителами (специфическими белками крови, образующимися в результате иммунологических процессов, направленных на удаление из организма антигенов — генетически чужеродных тел). Иммунохимическая реакция в растворе между антителами и антигенами — сложный процесс, протекающий в несколько стадий. В иммунохимическом анализе принципиально возможно использование только первой стадии, которой является обратимое образование комплекса состава 1 :1 .

Классические методы иммунохимического анализа основаны на об­ разовании осадка антителами в присутствии антигена. При этом за проте­ канием этого процесса обычно наблюдают визуально и обнаруживают или полуколичественно определяют относительно высокие концентрации антигена. Эти методы длительны и трудоемки.

‘Определение малых концентраций комплекса антиген—антитело, образовавшегося в растворе, становится возможным, если в один из исходных компонентов реакционной системы (антиген или антитело) ввести метку, которая легко детектируется соответствующим высо­ кочувствительным инструментальным методом. Поскольку комплекс; между определяемым соединением (антигеном) и специфическим ан­ тителом образуется строго стехиометрично, экспериментально уста­ навливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, непосредственно связана с концен­ трацией антигена.

Для проведения такого анализа необходимо эффективное отделе­ ние комплексов от свободных компонентов. Эта задача достаточно легко решаема, если антиген либо антитело иммобилизовать на твер­ дом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и разделить иммунные комплексы и свободные компоненты. Возможность прочного связывания на носителе антигенов или анти­ тел с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов привела к созданию твердофазных иммунохимических методов, широко используемых в настоящее время в хими­ ческом анализе.

Чаще всего в ИХА используют изотопные, флуоресцентные, ферментные, парамагнитные метки, которые повышают чувствитель­ ность иммунохимических методов в миллионы раз и сокращают время анализа.

Радиоиммуиологический метод анализа (РИА) был предложен в коице 50-х годов XX в. Возможность определять метку (изотоп 1 2 5 1) в

очень малых концентрациях позволила достичь высокой чувствительно­ сти анализа (до пкг/мл) при высокой избирательности и экспрессности. За разработку этого метода его авторы Р. Йалоу и С. Берсон были удостоены Нобелевской премии в 1977 г. Недостатками этого метода являются огра­ ниченный срок жизни радиоактивной метки; относительно дорогое обо­ рудование для регистрации радиоактивности; возможность радиоактив­ ного заражения окружающей среды при проведении серийных анализов. В качестве альтернативы радиоактивным меткам было предложено ис­ пользовать флуоресцентные метки и ферменты.

Иммуноферментный анализ (ИФА) является в настоящее время одним из наиболее активно развивающихся направлений аналитической биохимии. В этом методе высокая чувствительность определения фер­ ментной метки (менее 10' 1 2 М) сочетается с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Достижению высокой чувствительности ИФА способствует использование для регистрации активности фермен­ тов различных инструментальных методов — спектрофотометрических, флуориметрических, хеми- и биолюминесцентных, электрохимических.

Использование твердых носителей для иммобилизации антител с по­ следующим специфическим связыванием определяемого соединения на сорбенте и идентификацией образовавшихся иммунокомплексов с помо­ щью меченных ферментами компонентов лежит в основе методов твер­ дофазного (гетерогенного) иммуноферментного анализа.

Метод гомогенного ИФА без использования твердой фазы основан на различии каталитических свойств ферментной метки в свободном виде и в иммунном комплексе. В настоящее время термин «гомогенный имму­ ноанализ» применяют к любой системе иммуноанализа, в которой специ­ фическая реакция взаимодействия антигена с антителом и регистрация глубины ее протекания осуществляются в гомогенном растворе.

Отсутствие стадии разделения свободного и меченого определяемого со­ единения привело к сокращению времени проведения анализа до нескольких минут. Это позволило разработать диагностические иммуноферменгные тестсистемы для экспресс-определения биологически активных соединений в хи­ мической токсикологии, фармакологии, эндокринологии.

Иммунохимические методы, основанные на использовании меченых реагентов, широко применяют для определения биологически активных соединений самой разнообразной структуры — от низкомолекулярных гормонов до высокомолекулярных вирусов и целых клеток. Внедрение гомогенного варианта ИФА в область клинической биохимии содейство­ вало созданию высокочувствительных методов определения гормонов, наркотических и лекарственных веществ. Большим преимуществом этого метода является возможность использования малых объемов анализируе­ мой пробы (5— 50 мкл) и отсутствие стадии пробоподготовки.

116

Иммунохимические методы анализа все активнее внедряются в ана­ литическую практику и используются в различных областях медицины, сельского хозяйства, микробиологической и пищевой промышленности, при анализе объектов окружающей среды.

Вопросы

§9.1

I.Почему в гравиметрическом анализе важны и термодинамический, и кинети­ ческий аспекты процесса осаждения?

;2. Какие свойства осадка определяют его пригодность в качестве осаждаемой

j.формы?

г3. Как обеспечить эффективную и быструю коагуляцию коллоидов прн получе­ нии аморфного осадка?

4.Как влияет относительное пересыщение раствора на форму получающегося рсадка?

5.Каково соотношение скоростей агрегации частиц и ориентации молекул при получении аморфного и кристаллического осадков?

6.Назовите наиболее эффективные приемы очистки осадков от примесей.

7.Чем определяется скорость фильтрования осадков?

8.Какие примеси с наибольшей вероятностью будут содержать следующие осадки: а) иодат бария, полученный добавлением к иодату калия избытка хло­ рида бария; б) хлорид серебра, полученный добавлением к раствору ацетата и хлорида натрия нитрата серебра; в) сульфат свинца, полученный медленным добавлением нитрата свинца к сульфату натрия и, наоборот, добавлением сульфата натрия к нитрату свинца (в каком осадке натрия больше)?

9.Какие примеси удаляются при прокаливании осадка?

10.Всегда ли переосаждение эффективно для очистки осадка?

II. Какая пара соединений может образовать гриммовские кристаллы: BaS04 —

KMn04; BaS04 — PbS04; BaS04 — SrS04 ?

12.Назовите наиболее эффективные приемы получения крупнокристаллических осадков оксалата кальция.

13.Укажите основные причины потерь при промывании кристаллических и

аморфных осадков.

14. Почему адсорбция MgHP04 на осадке MgNH4 P 0 4 не влияет на результаты

определения магния?

15.Как осадить железо (III) в присутствии алюминия?

16.Почему при осаждении гидрата оксида алюминия аммиаком следует добав­ лять метиловый красный?

17.Почему при осаждении диметилглиоксимата никеля при определении никеля в стали добавляют винную кислоту?

18.Какая осаждаемая форма при определении кальция предпочтительнее:

CaS04, СаСОэ , СаС2 0 4 ■Н2 0 , CaF2 ?

117

§9.2

1.Какова роль кривых титрования?

2.В каких координатах строят кривые в разных методах титрования?

3.Обязательно ли совпадение точки эквивалентности и конечной точки титро­ вания?

4.Назовите факторы, влияющие иа вид кривой титрования (величина скачка, положение точки эквивалентности, наклон ветвей).

5.Можно ли оттитровать в водном растворе прямым способом борную кислоту, соли аммония, ацетат-ион?

6 . Сколько скачков на кривых титрования щавелевой, серной, этилендиамннтетрауксусной, угольной н фосфорной кислот гидроксидом натрия; карбоната натрия, фосфата натрня и гидразина соляной кислотой?

7.Почему скачок титрования борной кислоты увеличивается в присутствии гли­ церина?

8 . Укажите на кривых титрования области буферного действия, а также точку с максимальной буферной емкостью.

9.Как оттитровать угольную кислоту по второй ступени, фосфорную кислоту по третьей ступени?

10.Какие приемы используют для титрования кислот и оснований с константами менее 1 0 '®?

11.Какие приемы используют для титрования смеси электролитов с близкими константами?

12.Приведите примеры симметричных и асимметричных кривых окислительно­ восстановительного титрования.

13.Назовите окислители и восстановители, применяемые для предварительного окисления и восстановления титруемых веществ.

14.Объясните роль защитных смесей при титровании железа (II) перманганатом калия в присутствии хлорид-иона.

15.Почему иодид калия нельзя использовать для прямого титрования меди?

16.Напишите реакции, протекающие при титриметрическом определении: а) белиль­ ной извести, нитратов, железа (ГП), пероксида водорода, брома, хлора, хрома (VI), хрома (III), сульфидов, сульфитов иодометрически; б) пероксида водорода, нитратов, диоксида марганца, кальция (II), марганца (II) перманганатометри­ чески.

17.Как повысить селективность комплексонометрического титрования?

18.Почему в комплексонометрии столь большое значение имеет pH раствора?

19.Как определить сульфат- и оксалат-иоиы, используя ЭДТА?

20.В каких случаях кривая осадительного титрования симметрична, в каких — асимметрична?

21.Как связана величина рКа адсорбционного индикатора с интервалом pH оса­ дительного титрования?

22.Почему теоретические и экспериментальные кривые титрования ие всегда совпадают?

23.В каких случаях применяют обратное титрование?

118

24.Приведите примеры специфических индикаторов.

25.При каких условиях возможно раздельное титрование окислителей или вос­ становителей в смесн?

26.Почему при перманганатометричеоком титровании оксалат-ионов необходи­ мо нагревание раствора?

27.Можно ли определить перманганатометрически Fe (И) и Ti (III) в смеси?

28.Почему нельзя оттитровать тиосульфат натрия дихроматом калия прямым способом?

29.В каких условиях определяют арсенат-ион и арсенит-ион иодометрически?

30.Почему при иодометрическом определении меди (II) необходим избыток иодида калия?

31.Почему нельзя оттитровать кальций (II) раствором ЭДТА с эриохромовым черным?

32.Какова стехиометрия комплексонатов кальция, никеля, молибдена (VI)?

33.Почему комплексонометрическое титрование алюминия проводят методом обратного титрования?

34.Назовите критерии, которым должны отвечать титранты в комплексометрии.

35.Объясните причины высокой реакционной способности комплексонов.

36.Какова роль констаит диссоциации в характеристике тигрантов в комплексонометрии?

37.Что определяет выбор способа титрования?

38.Назовите преимущества комплексонометрического титрования по сравнению с комплексометрическим.

39.Какие характеристики комплексонов и комплексонатов используют при вы­ боре оптимальных условий титрования?

40.Как влияют свойства металлоиндикаторовна оптимальные условия титрования?

41.Назовите факторы, влияющие на величину скачка на кривой комплексометри­ ческого титрования.

42.Как влияют состав н pH буферного раствора на результаты комплексономет­ рического титрования?

§9.3

1.Каковы принципы, положенные в основу кинетических методов в их катали­ тическом и некаталитическом вариантах?

2.Перечислите требования, предъявляемые к индикаторным реакциям.

3.Какие способы используют чаще всего в кинетических методах для наблюде­ ния за скоростью индикаторной реакции?

4.Какой из трех способов — тангенсов, фиксированного времени и фиксиро­ ванной концентрации — является самым: а) точным; б) простым; в) удобным для автоматизации?

119