11. Особенности культивирования анаэробных бактерий

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микробов от токсического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бескислородных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (10 – 150мВ). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс – индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окрашивает среды в синий, а резазурин – в розовый цвет, что указывает на непригодность таких сред для культивирования облигатных анаэробов. Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризированы. Добавление даже 0,05% агара повышает их вязкость и уменьшает аэрацию.

Анаэробный тип энергетического метаболизма во много раз менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть богаче питательными субстратами и витаминами. В практических лабораториях для выделения анаэробов из патологического материала чаще всего используют среду для контроля стерильности крови (СКС), среду Китта-Тароцци, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона – Блера, среду Шедлера и др. Эти свежеприготовленные питательные среды должны быть использованы для посева в течение 2-х часов.

Методы создания анаэробных условий. Создание анаэробных условий достигается с помощью физических, химических, биологических и смешанных методов.

Физические методы. Основаны на выращивании микроорганизмов в безвоздушной среде, что достигается:

1. посевом в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества; В качестве редуцирующих веществ обычно используют кусочки (око­ло 0,5 г) животных тканей (печень, мозг, почки, селе­зенка, кровь). Эти ткани связывают растворенный в сре­де кислород и адсорбируют бактерии. Чтобы уменьшить содержание кис­лорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10-15 мин, а затем быстро охлаждают и заливают сверху небольшим количеством сте­рильного вазелинового масла. В качестве легко окисляемых веществ ис­пользуют глюкозу, лактозу и муравьинокислый натрий. Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта-Тароцци, которая используется для накопления ана­эробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддер­жания роста выделенной чистой культуры анаэробов.

2. посевом микроорганизмов в глубину плотных питательных сред. Посев микроорганизмов в глубину плотных сред производят по мето­дам Вейнберга и Виньяль-Вейона.

Метод Вейнберга. 1-2 капли материала со среды Кита-Тароцци вносят в пробирку с МПБ для разведения. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, предварительно расплавленным и прокипяченным в течение 20 мин и остуженным до 50°С, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды, при этом агар застынет и зафиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток. Инкубируют в анаэробных условиях. Через сутки отбирают колонии, на уровне колонии пробирку распиливают, колонию отсасывают пипеткой и переносят в среду Китта-Троцци для накопления и идентификации.

Метод Виньяль-Вейона состоит в механической защите посевов ана­эробов от кислорода воздуха. Проводиться в пастеровских пипетках. Пастеровские пипетки представляют собой длинные трубки (20-25 см) диаметром около 5 мм, приготовленные из легкоплавкого стекла. Один конец пипетки открыт, а другой вытянут в виде капилляра и запаян. Исследуемый материал разводят полужидким агаром с небольшим содержание глюкозы, затем из каждого разведения насасывают агар в стерильную пастеровскую пипетку, предварительно обломив запаянный конец капилляра, и избегая попадания пузырьков воздуха. Затем капилляр запаивают и пипетки помещают в термостат. Так создаются благоприятные условия для роста самых строгих анаэробов. Через 24-48 часов в среде можно обнаружить ясно видимые колонии бактерий в виде пушинок, комочков ваты, зерен чечевицы и т.д. Для выделения отдельной колонии трубку над­резают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии, ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в про­бирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде.

3. механическим удалением воздуха из сосудов, в которых выращи­ваются анаэробные микроорганизмы; Удаление воздуха производят путем его механического откачивания их специальных приборов - анаэростатов, в которые помещают чашку с посевом анаэробов. Переносной анаэростат представляет собой толсто­стенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой (с резино­вой прокладкой), снабженный отводящим краном и вакуумметром. Пос­ле размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса.

4. заменой воздуха в сосуде каким-либо индифферентным газом. Замену воздуха индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, С0₂) можно производить в анаэростатах путем вытеснения его газом из баллона.

Приборы и среды для культивирования анаэробов:

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабженный манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор – стеклянный лабораторный сосуд с притертой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Газ-пак (Generbag anaer). Для создания анаэробных условий используются газогенератор­ные пакеты с реагентами - GasPak, GasPak Plus (газогенераторный пакет с палладиевым катализатором) и другие.

Винтовой зажим с герметичной прокладкой

Катализатор

Газогенераторный пакет

Чашки Петри

Рис. 8 Газогенераторные пакеты

Система Generbag anaer состоит из воздухонепроницаемых емкостей, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород (рис. 8). При применении GasPak Plus необходимо увлажнить таблетку боргидрида натрия, при этом выделяется водород и в присутствии палладиевого катализатора он соединяется с кислородом с образованием воды. Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и закрыть пакет. Инкубация при 37°С.

Анаэробный бокс – прозрачная плексиглассовая камера со шлюзом, отверстиями для рук с рукавами, заканчивающимися резиновыми перчатками. В нем создаются стерильные условия, его заполняют газовой смесью и поддерживают температуру 37°С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон (МПБ), 0,5% глюкозы и 0,15% агара. На дно пробирки для адсорбции О₂ помещают кусочки вареной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с 6-7 мл расплавленного и охлажденного до 40-45⁰ полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Химические методы. Основаны на поглощении кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (анаэростате, эксикаторе) такими веще­ствами, как пирогаллол или гидросульфит натрия.

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде.

2. Можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na₂S₂0₄и 16 мл 50% КОН.

3. Использование веществ - редуцентов, к которым относятся тиогликолевая кислота или тиогликолат натрия (0,01-0,02%), аскорбиновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), муравьинокислый натрий (0,25-0,75%) и др.

Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газонепроницаемых пластиковых пакетах). Для образования водорода и двуокиси углерода, необходимых для роста облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активируются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида натрия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с образованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия.

Биологические методы

1.Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают исследуемый материал, а на другую - культуру аэробного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру “чудесной палочки” (Serratia marcescens), которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроорганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.

2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта – Тароцци. К тому же в печеночной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цистеин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.

3. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных, однако в настоящее время этот метод используется достаточно редко.

Комбинированные методы основаны на сочетании физических, хи­мических и биологических методов создания анаэробиоза, и используются в большинстве практических лабораторий. Для работы с наиболее чувствительными к молекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику (метод Хангейта). Принцип метода заключается в использовании лишенных кислорода питательных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.