6.6.2. Иммунофлюоресцирующие сыворотки

Содержат иммуноглобулины, к которым посредством прочной

химической связи присоединен флюорохром. При этом

флюоресцирующие антитела сохраняют – способность

взаимодействовать со специфическим антигеном, а флюорохром

способность к свечению. Образовавшийся комплекс обнаруживается

в люминесцентном микроскопе.

Этапы приготовления:

– выбор животных-продуцентов;

– выбор антигена;

– гипериммунизация животных по определенной схеме;

– выделение из нативной сыворотки глобулинов;

– освобождение иммуноглобулинов от солей;

– маркирование специфических антител флюорохромом;

– стандартизация готовых сывороток.

Примеры сывороток:

– Антисыворотка для прямого Кунса – содержит

флюоресцирующие антитела к антигенам определенного вида

бактерий, риккетсий, вирусов, используют для сероидентификации

выделенного возбудителя. Сейчас широко используются

флюоресцирующие брюшнотифозные, дизентерийная, коли- и

сибиреязвенная, чумная, холерная, туляремийная, бруцеллезная,

риккетсиозные и некоторые вирусные антисыворотки.

– Антисыворотки для непрямого метода Кунса – АГС

(антиглобулиновые сыворотки), содержащие флюоресцирующие АТ

к диагностическим сывороткам, применяются для изучения и

выявления бактериальных и вирусных антигенов, для обнаружения и

титрования антител к ним, в диагностике неинфекционной патологии,

для выявления соотношения различных классов иммуноглобулинов

при аутоиммунных заболеваниях.

– Антикомплементарная (против глобулинов морской свинки)

меченая сыворотка – содержит флюоресциирующие антитела к

комплементу морской свинки.

80

6.6.3. Меченные ферритином сыворотки для постановки

иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

Ферритин – белок, содержащий до 23 % железа, хорошо

контрастирующий и поэтому применяющийся в качестве метки.

После обработки мечеными АТ изучаемых объектов (вирусов,

бактерий, срезов инфицированных клеток) они становятся

электронноплотными и могут быть выявлены при электронной

микроскопии. Чаще всего эта реакция применяется в вирусологии.

6.6.4. Меченые ферментом сыворотки для постановки

иммуноферментного анализа (ИФА)

Метод основан на использовании в качестве метки АТ

ферментов, способных разлагать субстрат и приводить к образованию

окрашенных продуктов.

Наиболее распространенный вариант ИФА – твердофазный,

когда антиген либо антитело фиксированы на твердом носителе,

например, в лунках планшеток из полистирола. Например, для

выявления антигена в прямом методе ИФА на стенках лунок

фиксируют антимикробные антитела. Если искомый антиген

присоединяется к антителам, то он также оказывается

фиксированным. После инкубации и отмывки связавшийся антиген

выявляют с помощью меченых антимикробных антител.

Конъюгированные с ферментом АТ сохраняют способность

соединяться с гомологичным АГ. Интенсивность окраски хромогена

соответствует количеству образовавшихся комплексов АГ-АТ.

Для проведения твердофазной ИФА необходимы

полистироловые планшеты, имеющие лунки с плоским дном и

автоматические пипетки. Для количественного учета используют

спектрофотометр – регистратор экстинции при длине волны 492 нм.

ИФА характеризуется весьма высокой чувствительностью и

быстротой получения результатов (в течение 4-6 часов). Каждое

разведение ставят параллельно в двух лунках.

Наиболее распространенными ферментами-метками являются

пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Препараты из меченых

антител называют конъюгатами. После соединения конъюгата с

антигеном в смесь добавляют субстрат (Н2О2 или фосфатид) и

хромоген. Субстрат расщепляется ферментом (Н2О2 пероксидазой с

81

образованием активного кислорода, который окисляет хромоген) и

изменяет цвет продукта реакции (например, с прозрачного до

желтого, если хромоген ортофенилендиамин, или коричневого – если

хромоген аминосалициловая кислота) разной степени интенсивности.

Эта интенсивность может учитываться с помощью специальных

приборов (фотоэлектроколориметры) или визуально. Применяются

также автоматические анализаторы (ридеры).

При определении в ИФА антител (например, серодиагностика

ВИЧ-инфекции) на носителе фиксируют известные антигены –

непрямой метод ИФА. Затем вносится исследуемая сыворотка. Для

выявления образовавшихся комплексов антиген + антитело вносится

антиглобулиновая сыворотка, меченая ферментом. Обязательно

несвязанный конъюгат трижды отмывают буфером. Затем в лунку

вносят 0,1 мл смеси раствора субстрата и хромогена и выдерживают