Файловый архив студентов. Файловый архив студентов.
1327 вузов, 5487 предметов.
/ Регистрация
FAQ Обратная связь Вопросы и предложения
Добавил:
asman00000@mail.ru Работаю на МРТ, учусь на стоматолога,делитесь со мной файлами в ТГ ozzii05 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Медицинский Университет "РЕАВИЗ"
Предмет:
Биология
Файл:
Тейлор, Грин, Стаут 3 том [2013].pdf
Скачиваний:
0
Добавлен:
05.09.2026
Размер:
19 Мб
Скачать
☆
►Содержание►
220 Глава 25
Рис. 25.2. Некоторые обычно используемые рестриктазы. EcoRI, HindIII и BamHI делают зигзагообразные (ступенчатые) разрезы в ДНК, оставляя «липкие концы». Липкий конец, образованный, к примеру, EcoRI, может соединиться с другим липким концом, образованным EcoRI. HindII и HpaI оставляют тупые концы. Более детально представлены схемы для EcoRI и HpaI.
Этот неспецифичный метод выделения генов называют методом дробовика. Наиболее трудная задача при его использовании — найти фраг мент, который несет нужный ген; эта проблема обсуждается в разд. 25.1.3.
Прерывистые гены
Использование обратной транскриптазы или хи мический синтез гена имеют преимущество над методом дробовика, поскольку получаемый при этом ген не является «прерывистым». Прерыви стые гены содержат один или несколько участ
Рис. 25.3. Использование рестриктаз для разрезания ДНК и получения рестрикционных фрагментов разной дли ны. На этом рисунке участок ДНК, который содержит два гемоглобиновых гена разных приматов, обрабатыва ли двумя рестриктазами. Фермент 1 обозначен знаком человека на два фрагмента, а фермент 2 — на пять фрагментов. Длины этих фрагментов, а также фрагмен тов, полученных при совместной обработке обоими ферментами, позволяют локализовать положение разрезов (сайтов рестрикции) относительно друг друга. На основе этих данных строят «рестрикционную карту», кото рая изображена на схеме. Чем больше рестриктаз используется для построения карты, тем более детальной она получается. Обратите внимание на то, что чем ближе родство между видами, тем более сходны их ДНК и расположение в них сайтов рестрикции. [Схема построена на основе рис. 7–4, с. 294, Molecular biology of the cell, 3rd ed., B. Alberts et al. (1994) Garland.]
▼
, фермент 2 — знаком p. Фермент 1 разрезает ДНК
Рис. 25.4. Гельэлектрофорез, используемый для разде ления фрагментов ДНК различной длины. Фрагменты образуются при разрезании ДНК одной или нескольки ми рестриктазами. Самые большие фрагменты дви жутся медленнее всех, так как им гораздо труднее пройти через поры в геле. На фотографии они распо ложены поблизости от стартовых лунок в геле.
Рис. 25.5. Транскрипция и трансляция гена, содержа щего интрон. Участки, окружающие интрон, называ ются экзонами. Гены могут содержать много интро нов. Белки кодируются только экзонами.
222 Глава 25
ков ДНК, называемых интронами, которые не ко дируют аминокислотную последовательность белка. Функция интронов до сих пор не ясна. Известно лишь, что если эукариотический ген, содержащий интроны, поместить в бактерию, то бактерия синтезирует бесполезный белок, по скольку у бактерий нет ферментов для удаления интронов из мРНК. Как интроны удаляются из мРНК, показано на рис. 25.5.
25.1.3. Этап 2. Встраивание генов в вектор
Как уже объяснялось выше, в качестве векторов чаще всего используют плазмидную ДНК или фаговую ДНК. Сначала рассмотрим схему встра ивания в плазмидную ДНК. В принципе та же процедура применяется и в случае фаговой ДНК.
Плазмидная ДНК
Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бакте рий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и цент рифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остает ся в жидкой фазе над осадком. Перед обработ кой рестриктазами плазмидную ДНК очищают (рис. 25.1).
Если для выделения донорной ДНК (на пример, методом «дробовика») использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикци онные фрагменты донорной ДНК, среди кото рых есть и фрагмент с нужным геном, смешива ют затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец –ААТТ будет соединяться с комп лементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных свя зей, но после добавления фермента, называемо го ДНКлигазой, образуются фосфодиэфирные связи.
Если в качестве донорной ДНК используется кДНК или синтетический ген (см. выше два пер вых метода выделения генов), то для встраива ния ДНК в вектор следует действовать по схеме, представленной на рис. 25.6. Та же процедура не обходима, если при использовании метода «дро бовика» применялся фермент, образующий тупые концы.
Рис. 25.6. Добавление липких концов к фрагменту ДНК, имеющему тупые концы, перед встраиванием ДНК в вектор с целью создания рекомбинантной мо лекулы ДНК.
Фаговый вектор
Преимуществом фагов как векторов является возможность клонирования б'ольших фрагмен тов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой це ли используют фаг O (рис. 2.20). Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клони ровать. Эта часть не нужна для репликации фаго вой ДНК в бактериальной клеткехозяине, поэтому клонирование не нарушается. Схемати чески эта процедура представлена на рис. 25.7.
Прикладная генетика 223
рии хорошо изучена, а также потому, что она быстро растет (время удвоения составляет около 30 мин). Для генной инженерии получен спе циальный мутант E. coli, выживающий только в особых лабораторных условиях. Поэтому он не способен заразить человека, если случайно попадет в окружающую среду вместе с чужерод ными генами, которые он содержит.
При использовании плазмидного вектора препарат плазмиды добавляют в пробирку, содержащую культуру E. coli. Туда же вносят ионы кальция (обычно в виде хлорида кальция) и клетки подвергают короткому тепловому шо ку. В результате в клеточной мембране E. coli бы стро образуются поры, через которые плазмиды проникают внутрь клетки. Процесс введения но вой ДНК в бактериальную клетку называется трансформацией.
Фаговые векторы вводят в клетки путем ин фицирования бактериального газона, растущего на чашках с агаризованной средой (разд. 12.8).
25.1.5. Этап 4. Клонирование ДНК
Рис. 25.7. Включение ДНК в фаговый вектор.
Часто в ней используют донорную ДНК, полу ченную методом «дробовика».
25.1.4. Этап 3. Введение вектора в хозяйскую клетку
На данном этапе фаговый или плазмидный век тор вводят в бактериальную клетку, в которой он сможет размножаться (клонировать себя и чуже родную донорную ДНК, которую он содержит). Как правило, для этих целей используют бакте рию Escherichia coli — обычного обитателя ки шечника человека. Кишечная палочка выбрана для этой цели потому, что генетика этой бакте
Однаединственная фаговая частица, содержа щая рекомбинантную молекулу ДНК, может ме нее чем за один день образовать более 10 тичных копий самой себя и этой молекулы. Клетки E. coli, содержащие плазмиды, обычно высевают на питательный агар в чашках Петри. Здесь клетки делятся каждые 30 мин, со време нем образуя видимые колонии. При этом появ ляется такое же число копий требуемой ДНК, как и при использовании фаговых векторов, и к тому же при делении бактерий в них синтези руются сотни копий плазмиды. С помощью этих двух способов за короткое время получают мил лиарды клонов. Теперь прежде чем проводить дальнейшее клонирование, нужно провести от бор трансформированных бактерий.
12
иден
Отбор трансформированных бактерий
Рассмотрим ситуацию, когда в качестве векто ра были использованы плазмиды. Когда плаз мидную ДНК смешивают с бактериальной культурой, возникают две проблемы. Вопер вых, не все бактерии трансформируются (полу чают плазмиды). Вовторых, не все плазмиды несут чужеродную донорную ДНК. Эти про блемы искусно обходят, используя плазмиды,
224 Глава 25
Рис. 25.8. Плазмидный вектор, содержащий ген ус тойчивости к антибиотику ампициллину. Благодаря присутствию такого гена мы имеем возможность на среде с ампициллином отбирать клетки, несущие плазмиду. Клетки, не содержащие плазмиду, на такой среде погибают.
которые обладают двумя особыми свойствами (рис. 25.8).
1. Плазмиды несут ген устойчивости к опре деленному антибиотику. Если в питатель ную среду, на которой выращивают бактерии, добавить этот антибиотик, то размножаться и формировать колонии смогут только трансформированные клет ки (те, которые содержат плазмиды).
2. Плазмиды несут ген, кодирующий фер мент Eгалактозидазу, причем этот ген до полнительно содержит несколько сайтов рестрикции, которые не влияют на функ цию гена. EГалактозидаза — это фермент, расщепляющий лактозу на галактозу и глюкозу. При действии данного фермента на бесцветное вещество Xgal образуется продукт голубого цвета. Если чужеродная ДНК встроена в сайт рестрикции внутри гена, то ген не будет работать. Поэтому, если бактерии, которые выросли в присут ствии антибиотика, выращивать затем на среде с Xgal, то колонии, не содержащие донорной ДНК, будут окрашены в голубой цвет. Бактерии же, образующие бесцвет ные колонии, содержат донорную ДНК,
и их можно отбирать для последующего клонирования.
25.1.6. Отбор бактерий, содержащих нужный ген
Если на первом этапе клонирования использо вался метод «дробовика», то бактерии, вклю чившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клониру ются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, назы вается библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиноч ный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде биб лиотек.
Использование зондов
Нужную бактерию отбирают с помощью зонда, как это показано на рис. 25.9. Зонд можно ис пользовать, если известна полная или частичная последовательность ДНК, которую требуется найти. Если же известна аминокислотная после довательность белка, который кодируется дан ным геном, то по ней можно предсказать после довательность нуклеотидов (по крайней мере, очень близкую к ней). В качестве зондов исполь зуют короткие фрагменты ДНК и РНК, которые комплементарны участку нужного гена и поэто му связываются с ним. Например, зонд АГТЦЦА найдет и присоединится с помощью водородных связей к последовательности ТЦАГГТ. Зонды могут быть очень короткими (15—20 нуклео тидов) или более длинными. Обычно зонд изго тавливают из нуклеотидов, меченных радио активным элементом с ДНК радиоактивность является маркером, который выявляют методом радиоавтографии (рис. 25.9).
32
Р. При связывании зонда
Прикладная генетика 225
Рис. 25.9. Скрининг библиотеки с помощью ДНКзонда с целью обнаружения клона.
226 Глава 25

25.2. Использование бактерий, полученных с помощью методов генной инженерии

25.2.1. Инсулин человека
Инсулин — это белковый гормон, который обра зуется в поджелудочной железе и играет жизнен но важную роль в регуляции содержания сахара в крови (разд. 17.6.6). Недостаток инсулина слу жит одной из причин сахарного диабета — забо левания, которым страдает примерно 3% населе ния Земного шара. Повышенное содержание сахара в крови (обусловленное недостатком инсулина) приводит к тяжелым последствиям. Болезнь стала излечимой, начиная с 1921 г, когда два канадских исследователя Бантинг (Banting) и Бест (Best) впервые выделили гормон. До этого больные страдали от тяжелых изнурительных симптомов, приводящих к неминуемой смерти. Сейчас более 2 млн. больных диабетом во всем мире пользуются для лечения инсулином (рис. 25.10), а его продажа на мировом рынке оценивается в несколько сотен миллионов фун тов стерлингов ежегодно.
Ежедневные инъекции инсулина, выделен ного из поджелудочных желез свиней или круп ного рогатого скота, стали стандартной
Рис. 25.10. Девочкаподросток, страдающая диабе том, делает себе инъекцию инсулина.
Рис. 25.11. Схема процесса производства инсулина человека с использованием генной инженерии.
Прикладная генетика 227
процедурой для больных диабетом. Однако, из за небольших различий в аминокислотном составе инсулина человека и других видов мле копитающих, а также изза наличия следовых количеств примесей, у некоторых пациентов развиваются аллергические реакции к инсули ну животных. Идеальное решение проблемы стало возможным с разработкой методов ген ной инженерии. Ген инсулина человека встраи вают в бактериальную клетку, а затем такие клетки размножают в ферментере с целью полу чения больших количеств белка. Схема проце дуры, обычно используемой для производства инсулина человека, приведена на рис. 25.11.
И, наконец, главная проблема, которая до сих пор не обсуждалась, — как «включить» инте ресующий нас ген внутри бактерии, т. е. как за ставить его экспрессироваться. Известно, что для экспрессии любого гена должны быть акти вированы определенные, расположенные по соседству с ним участки ДНК, которые называ ются промоторными участками. Если новый ген встроен в середину уже существующего гена, то добиться его экспрессии легко, поскольку он включается вместе с геном хозяина. В качестве такого хозяйского гена в E. coli обычно использу ют ген Eгалактозидазы (рис. 25.8).
Метод был разработан компанией «Eli Lilly» и в 1982 г. инсулин человека под торговой мар кой «humulin» стал первым полученным с по мощью генной инженерии фармацевтическим продуктом, разрешенным к применению.
смертельных случаев в 1970е гг. использование экстрактов гипофиза умерших людей для лече ния карликовости было запрещено. Позднее компания «Genentech» в Калифорнии разрабо тала технологию получения гормона роста с по мощью бактерий с встроенным в их хромосому человеческим геном, отвечающим за синтез это го белка. Регулярные инъекции такого «генно инженерного» гормона больным детям восста навливают их рост почти до нормального уровня.
Схема производства гормона роста в прин ципе аналогична схеме получения инсулина, представленной на рис. 25.11. Кодирующая ДНК (ген), введенная в бактерию, представ ляет собой комплементарную ДНК (кДНК), полученную на матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы, как было описано в разд. 25.1.1. Перед встраиванием в вектор к кДНК присоединили еще одну ДНКпос ледовательность, кодирующую так называ емый «сигнальный пептид». Его роль чрез вычайно важна. Именно он, будучи соеди ненным с гормоном роста, действует как ключ, отпирающий «ворота» клетки. В результате произведенный бактерией гормон оказывается в окружающей среде, что существенно облег чает его очистку. После выхода из клетки сигнальная последовательность удаляется бак териальным ферментом и остается чистый гормон.
25.2.2. Гормон роста человека
Гормон роста — это небольшой белок, который вырабатывается гипофизом и действует на все ткани организма. Недостаток этого гормона в детстве приводит к карликовости; при этом тело человека остается маленьким, но имеет нор мальные пропорции. В отличие от инсулина, ко торый не обладает строгой специфичностью, гормон роста строго специфичен для того вида млекопитающих, в котором он вырабатывается. Вот почему лечение карликовости долгое время было основано на использовании гормона роста, выделенного из гипофиза умерших людей. По лученные таким образом препараты могли быть случайно загрязнены инфекционным белком, вызывающим болезнь Крейтцфельда–Якоба (такой же белок, повидимому, является при чиной коровьего бешенства). После некоторых
25.2.3. Бычий соматотропин (БСТ)
Бычий соматотропин (БСТ) — это гормон, близ кий гормону роста человека. Он тоже вырабаты вается в гипофизе и стимулирует клеточное деление у животных. Ген, кодирующий этот гормон, был встроен в геном бактерии тем же способом, что и гены инсулина и гормона роста. Благодаря этому БСТ в настоящее время получа ют в промышленных количествах в процессе ферментации.
Инъекции даже небольших доз БСТ коровам увеличивают продукцию молока на 25%, а массу скота, выращиваемого на мясо — на 10–15%. Несмотря на то, что при этом растут затраты на корм, суммарная прибыль увеличивается. Фер меры могут либо продавать больше молока, или (если они ограничены квотами) производить то же его количество, но дешевле (поскольку требу ется меньше коров). По утверждению произво
228 Глава 25
дителей бычьего соматотропина — фирмы «Monsanto» (США) — предварительные испыта ния не выявили изменений в поведении, состоя нии здоровья или способности к репродукции опытной группы животных. Вскоре после пре кращения инъекций масса коров и их удойность возвращались к исходному уровню.
При реализации программы исследований БСТ в Великобритании было разрешено прода вать населению смесь молока от коров, получав ших и не получавших гормон. Это было сделано вопреки протестам со стороны владельцев супермаркетов и общества потребителей. Более того, Министерство сельского хозяйства отказа лось давать сведения о том, где именно прово дились испытания. Все эти факты вызвали бурное возмущение и протесты населения. При менение БСТ в странах Европейского Союза было запрещено. Некоторые, вызвавшие наи более острую дискуссию вопросы и факты при ведены ниже.
1. Приведет ли использование БСТ к сниже нию цен на молоко? Весьма вероятно, что выгоду от его применения получат только промышленники и фермеры.
2. Не окажет ли БСТ вредного воздействия на здоровье человека? Поскольку этот гор мон химически родствен гормону роста человека, не исключено, что его следовые количества в молоке будут влиять на рост людей.
3. Для чего нужно применять БСТ, если в странах Европейского Союза уже наблю дается перепроизводство молока и мяса?
4. Есть данные о том, что коровы, получаю щие БСТ, более восприимчивы к болез ням и нуждаются в поддержке их иммун ной системы. Применяемые для этого препараты могут попасть в мясо или молоко. Установлено, что высокоудойные коровы более подвержены маститу. Не давние исследования показали, что забо леваемость маститом у коров, которым вводили БСТ, может возрастать почти на 80%.
5. БСТ не разрешено применять в странах Европейского Союза. Общество потреби телей Великобритании поддержало запрет на использование БСТ.
6. С конца 1993 г. применение БСТ разре шено в США.
8. Лабораторные крысы, которым скармли вали БСТ в относительно высоких дозах, не проявляли какихлибо признаков забо леваний.
9. Долговременные испытания на людях не проводились; не изучалось также влияние гормона на беременных или кормящих матерей.
Вы можете самостоятельно обдумать и взве
сить аргументы за и против применения БСТ.
25.2.4. Удаление нефтяных разливов
Примеры использования микроорганизмов для переработки отходов уже приводились в гл. 12. Они касались очистки сточных вод и превраще ния органических отходов в полезные продукты, такие как сахар, спирт и метан. Эти методы мож но усовершенствовать с помощью генной инже нерии.
Еще одно важное направление в биотехноло гии — создание с помощью генной инженерии бактерий, способных очищать нефтяные разли вы. У нас до сих пор нет эффективного метода, который не имел бы вредных последствий для окружающей среды. В настоящее время прово дятся испытания сконструированного с по мощью генной инженерии штамма Pseudomonas, который способен разрушать углеводороды, присутствующие в нефти. Подходящие гены есть в плазмидах природных штаммов Pseudomonas, но ни один такой штамм не содержит все четыре плазмиды. Недавно гены всех четырех типов бы ли введены в один «суперштамм».
Такие бактерии можно распылять на поверх ности, загрязненной нефтью, однако изза того, что Pseudomonas — аэробный микроорганизм и нуждается в кислороде, бактерии работают только на границе фаз нефть–вода и естественно лучше приспособлены для уничтожения тонких пленок, нежели объемных разливов. Еще одна особенность штаммов Pseudomonas, сконструи рованных методами генной инженерии, — их низкая эффективность при работе в холодных климатических условиях. Именно это обстоя тельство помешало использованию бактерий Pseudomonas при ликвидации крупной аварии на Аляске в 1989 г.
Прикладная генетика 229

25.3. Генная инженерия эукариотических объектов

Эукариотические организмы можно изменять с помощью генной инженерии так же, как и бак терии. Организмы, которые генетически пере строены с использованием методов генной инженерии, принято называть трансгенными.
Получение трансгенных организмов пред ставляет собой альтернативу традиционным методам селекции животных и растений. Это новое перспективное направление сельского хо зяйства. Улучшение сортов растений или пород животных традиционными методами — дли тельный процесс, который во многом основан на вероятностных событиях, происходящих при кроссинговере в мейозе и при случайной сегре гации хромосом в ходе полового размножения. Например, для того чтобы создать новый сорт злаков, требуется 7–12 лет. Генная инженерия дает возможность добавлять в организм новые гены, «конструировать» растения и животных с нужными человеку свойствами. Трансгенные растения и животные, подобно бактериям в ферментерах, могут стать «живыми фабриками» по производству полезных продуктов, и не толь ко пищевых. Важнейшая цель сельского хозяй ства — увеличить производство пищевых про дуктов в развивающихся странах. Есть надежда, что новые технологии помогут миллионам людей справиться с голодом. Однако использо вание трансгенных растений и животных влечет
за собой ряд этических и экологических про блем (рис. 25.12).
Ниже перечислены некоторые ключевые задачи селекции сельскохозяйственных расте ний и животных, которые можно решить альтернативным путем, создавая трансгенные организмы:
1) повышение продуктивности;
2) улучшение качества продукта (например, растительного масла, жира и белка);
3) повышение устойчивости к вредителям и бо лезням — гены устойчивости можно пере носить из одних видов в другие;
4) повышение устойчивости к стрессовым воз действиям внешней среды, таким как засуха, холод, жара, скученность (для животных); закисленность, засоленность, заболочен ность почв (для растений). Гены, контро лирующие стрессовые ответы, можно вы делять и переносить из одного организма в другой;
5) повышение скорости роста, т. е. времени от рождения (или посадки) до зрелости; ареал распространения некоторых сель скохозяйственных культур можно, по видимому, расширить за счет уменьше ния времени их роста;
6) повышение устойчивости к гербицидам (разд. 25.4.4).
Рис. 25.12. Заголовки статей в «Таймс», «Сан» и «Ивнинг Стандарт», посвященных проблемам генной инженерии.
Соседние файлы в предмете Биология
Помощь Обратная связь Вопросы и предложения Пользовательское соглашение Политика конфиденциальности