Добавил:
asman00000@mail.ru Работаю на МРТ, учусь на стоматолога,делитесь со мной файлами в ТГ ozzii05 Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Тейлор, Грин, Стаут 3 том [2013].pdf
Скачиваний:
0
Добавлен:
05.09.2026
Размер:
19 Мб
Скачать
210 Глава 24
щее число лекарственных препаратов, пищевых консервантов и пестицидов.
24.9.2. Хромосомные мутации
Хромосомные мутации могут быть результатом изменения числа хромосом или их структуры. Некоторые типы хромосомных мутаций изменя ют действие нескольких генов и оказывают на фенотип гораздо более глубокое воздействие, чем генные мутации. Изменения числа хромо сом обычно происходят в результате ошибок при мейозе, но они возможны и при нарушениях митоза. Эти изменения выражаются либо в анэу плоидии — утрате или добавлении отдельных хро мосом, либо в эуплоидии (полиплоидии) — добав лении целых гаплоидных наборов хромосом.
Анэуплоидия
Анэуплоидия может выражаться в появлении в дочерних клетках добавочной хромосомы (n + 1), (2n + 1) и т. д. или в нехватке какойлибо хромосомы (n – 1), (2n – 1) и т. д. Анэуплоидия может возникнуть, если в анафазе I мейоза гомо логичные хромосомы одной или нескольких пар не разойдутся. В этом случае оба члена пары на правляются к одному и тому же полюсу клетки, и тогда разделение гомологичных хромосом в анафазе II может привести к образованию гамет, содержащих на одну или несколько хро мосом больше или меньше, чем в норме (рис. 24.31). Это явление известно под названием нерасхождения. Когда гамета с недостающей или лишней хромосомой сливается с нормальной гаплоидной гаметой, образуется зигота с нечет ным числом хромосом: вместо какихлибо двух гомологов в такой зиготе их может быть три или только один.
Зигота, в которой число хромосом меньше диплоидного, обычно не развивается, но зиготы с лишними хромосомами иногда способны к развитию. Если это происходит у животных, то из таких зигот в большинстве случаев развивают ся особи с резко выраженными аномалиями. Среди наиболее часто встречающихся хромо сомных мутаций, возникающих у человека в ре зультате нерасхождения хромосом, — одна из форм трисомии, называемая синдромом Дауна (2n = 47). Такое состояние, названное по фами лии врача, описавшего его впервые в 1866 г., вы зывается нерасхождением хромосом 21й пары. Эта мутация описана в разд. 25.7.6.
Рис. 24.31. Нерасхождение хромосом при образовании гамет и результаты слияния аномальных гамет с нормальными гаплоидными клетками. Это приводит к различным типам полисомии, при которой число хромосом может быть равно 2n + 1 (трисомия), 2n + 2 (тетрасомия), 2n + 3 (пентасомия) и т. д.; или же 2n – 1 (моносомия), — в зависимости от числа гомологичных хромосом, не разошедшихся нор мальным образом (см. также рис. 25.34).
Возможно также нерасхождение мужских и женских половых хромосом, которое приводит к анэуплоидии, влияющей на вторичное поло вые признаки и фертильность, а иногда и на ум ственные способности (разд. 25.7.7 и 25.7.8).
Эуплоидия (полиплоидия)
Гаметы и соматические клетки с увеличенным числом хромосом, кратным их гаплоидному чи слу, называют полиплоидными. Приставки три, тетра и т. д. указывают, во сколько раз увеличе но число хромосом, т. е. степень плоидности: 3n — триплоид, 4n — тетраплоид, 5n — пента плоид и т. д. У растений полиплоидия встречает ся гораздо чаще, чем у животных. Например, из 300 000 известных видов покрытосеменных при мерно половина — полиплоиды. Относительная
Изменчивость и генетика 211
редкость полиплоидии у животных объясняется тем, что увеличение числа хромосом значитель но повышает вероятность ошибок при образова нии гамет в мейозе. Что касается растений, то большинство из них способно к вегетативному размножению, а поэтому они могут воспроиз водиться и в полиплоидном состоянии. Поли плоидные организмы часто обладают благо приятными признаками — более крупными раз мерами, выносливостью, устойчивостью к забо леваниям. Это их свойство называют гибридной мощностью (разд. 27.4.2). Большинство наших культурных растений — полиплоиды, образую щие крупные плоды, запасающие органы, цвет ки или листья.
Существуют две формы полиплоидии —
аутополиплоидия и аллополиплоидия.
АУТОПОЛИПЛОИДИЯ. Аутополиплоидия может воз
никнуть как естественным, так и искусствен ным путем в результате увеличения числа хро мосомных наборов у данного вида. Например, если произойдет репликация хромосом (в ин терфазе) и хроматиды нормально разойдутся (в анафазе), но цитоплазма не разделится, то об разуется тетраплоидная (4n) клетка с большим ядром. Такая клетка затем делится и дает тетра плоидные дочерние клетки. Количество цито плазмы в этих клетках возрастает, чтобы сохра нилось постоянное ядерноплазменное отноше ние, и это ведет к увеличению общих размеров растения или какойнибудь его части. Аутопо липлоидию можно вызвать с помощью алкалои да колхицина, выделяемого из клубнелуковицы безвременника (Colchicum). В концентрации по рядка 0,01% колхицин подавляет образование веретена деления, разрушая микротрубочки, так что хромосомы не расходятся во время анафазы. Колхицин и близкие к нему вещества использо вали для создания ценных сортов таких культур, как табак, томаты и сахарная свекла. Аутопо липлоиды могут быть так же плодовиты, как диплоиды, если они содержат четное число хро мосомных наборов.
У животных иногда наблюдается видоизме ненная форма полиплоидии, при которой об разуются отдельные полиплоидные клетки и ткани. Этот процесс, называемый эндомитозом, состоит в репликации хромосом, не сопровож дающейся разделением клетки. Гигантские хромосомы в клетках слюнных желез дрозофи лы и тетраплоидные клетки в печени человека возникают в результате эндомитоза.
АЛЛОПОЛИПЛОИДИЯ. Аллополиплоидия возникает
в случае удвоения числа хромосом у стерильного гибрида, в результате чего он становится фертильным. Гибриды F
получаемые при скре
1,
щиваниях между разными видами, обычно сте рильны, так как их хромосомы не могут образо вывать гомологичные пары во время мейоза. Это явление называют гибридной стерильностью. Од нако если число хромосом становится кратным их исходному гаплоидному числу, например,
+ n2), 3 (n1+ n2) и т. д. где n1и n2 — гапло
2 (n
1
идные числа хромосом у родительских видов, то возникает новый вид, который дает фертильных гибридов при скрещивании с такими же поли плоидами, но стерилен при скрещивании с од ним из родительских видов.
Для большинства аллополиплоидных видов характерно диплоидное число хромосом, которое представляет собой сумму диплоидных чисел ро дительских видов. Например, Spartina anglica (2n = 122) — фертильный гибридный аллополи плоид, полученный в результате скрещивания
Spartina maritima (stricta) (2n= 60) со Spartina alterni flora (2n = 62). Гибрид F
, полученный от
1
скрещивания между этими двумя видами, стерилен и получил название Spartina townsendii (2n = 62). Большинство аллополиплоидных расте ний отличается по своим признакам от обоих ро дительских видов; среди них многие из весьма ценных культур, выращиваемых человеком. На пример, вид пшеницы Triticum aestivum (2n = 42), из которого получают муку, был выведен путем скрещиваний и отбора на протяжении 5000 лет. В результате скрещивания пшеницыоднозернян ки (2n = 14) с неидентифицированным диплоидом (2n = 14) был получен новый вид пшеницы — эм мер (2n = 28). Пшеницу эммер скрещивали с еще одним дикорастущим видом (2n = 14), в результате чего была создана форма Triticum aestivum (2n = 42), которая представляет собой гексаплоид (6n) исходной пшеницыоднозернянки. Другой пример межвидовой гибридизации — скрещива ние редьки с капустой — будет описан в разд. 27.9.
У животных аллополиплоидия почти неизве стна, так как у них межвидовые скрещивания происходят редко. В результате полиплоидии ге нофонд не получает новых генов (разд. 27.4.2), но возникают новые комбинации генов.
Структурные изменения хромосом
При кроссинговере во время профазы I мейоза происходит реципрокный обмен генетическим
212 Глава 24
I
Рис. 24.32. Схематические изображения инверсии и транслокации и их влияния на расположение генов A — G. I Образование петли в профазе мейоза, вы званное инверсией. II. Участок хромосомы, несущий гены C, D и E, оторвался и присоединился к хромосо ме, несущей гены K, L и M.
материалом между гомологичными хромосома ми. Это ведет к изменению последовательности аллелей в родительских группах сцепления, в ре зультате чего получаются рекомбинанты, но без потери какихлибо генных локусов. Сходные эффекты возникают при таких хромосомных пе рестройках, как инверсии и транслокации. При перестройках других типов — делециях и дупли кациях — число генных локусов в хромосомах
Рис. 24.33. Схематическое изображение делеции и дупликации и их влияния на расположение генов A—G. В обоих случаях образуются петли.
II
изменяется, и это может оказать глубокое влия ние на фенотипы. Структурные изменения в хромосомах, связанные с инверсиями, делеция ми, дупликациями, а в некоторых случаях и транслокациями, можно наблюдать под микро скопом, когда в профазе I мейоза гомологичные хромосомы приступают к конъюгации. Гомоло гичные хромосомы образуют синапсы (конъю гируют; разд. 23.3), а в тех участках, которые за тронула перестройка, одна из гомологичных хромосом образует петлю или же перекручивает ся. Какая из хромосом образует петлю и как рас положатся ее гены зависит от типа перестройки.
Инверсия возникает в результате вырезания какоголибо участка хромосомы, который пово рачивается на 180°, а затем вновь встраивается на прежнее место. При этом никаких изменений ге нотипа не происходит, но возможны фенотипи ческие изменения (рис. 24.32). Это свидетельст вует о значении последовательности генов в данной хромосоме — так называемый эффект по ложения гена.
При транслокации от одной из хромосом от рывается участок, присоединяющийся либо к другому концу той же хромосомы, либо к одному из концов другой, негомологичной, хромосомы (рис. 24.31). И в этом случае в фенотипе может проявиться эффект положения. Реципрокная транслокация между негомологичными хромо сомами может привести к образованию двух но вых пар гомологичных хромосом. В тех случаях, когда при синдроме Дауна сохраняется нормаль ное диплоидное число хромосом, причиной это го служит транслокация сверхкомплектной хро мосомы 21 на одну из более крупных хромосом, обычно номер 15.
Самая простая форма хромосомной мута ции — делеция, или нехватка, т. е. утрата хромо сомой какогонибудь участка, промежуточного или концевого, в результате чего в хромосоме недостает некоторых генов (рис. 24.33). Деле ция может произойти в одной из двух гомоло гичных хромосом; в таких случаях аллели, на ходящиеся в другой, нормальной, хромосоме, экспрессируются, даже если они рецессивные. Если же делеция затронула одни и те же локусы в обеих гомологичных хромосомах, это обычно ведет к летальному исходу.
Иногда какойлибо участок хромосомы удва ивается, так что возникает дупликация — повто рение набора генов, локализованных в этом уча
Изменчивость и генетика 213
стке. Дополнительный набор может оказаться включенным в ту же хромосому, располагаться на одном из ее концов или же присоединяться к какойнибудь другой хромосоме (рис. 24.33).
24.9.3. Генные мутации
Что такое генная мутация?
Внезапные спонтанные изменения фенотипа, которые не связаны с хромосомными абер рациями (что подтверждается данными микро скопических исследований), можно объяснить только изменениями в структуре отдельных ге нов. Генная или точковая мутация (поскольку она относится к определенному генному локусу) — результат изменения нуклеотидной последова тельности молекулы ДНК в определенном участ ке хромосомы. Такое изменение последователь ности оснований в одном гене воспроизводится при транскрипции мРНК и может привести к из менению последовательности аминокислот в полипептидной цепи, образующейся в результа те трансляции на рибосомах.
Типы генных мутаций
Существуют различные типы генных мутаций, связанные с добавлением, выпадением или пе рестановкой оснований в данном гене. Они про являются в форме дупликаций, вставок, делеций, инверсий или замены оснований. Во всех случаях они приводят к изменению нуклеотидной после довательности, а часто и к образованию изме ненного полипептида. Например, делеция вызывает сдвиг рамки считывания, последствия которого описаны в разд. 23.7.
Последствия генных мутаций
Генные мутации, возникающие во время форми рования гамет, передаются всем клеткам потом ков и могут оказывать влияние на дальнейшую судьбу вида. Соматические генные мутации, происходящие в организме, наследуются только теми клетками, которые образуются из мутант ной клетки в результате митоза. Они могут ока зать воздействие на тот организм, в котором они возникли, но со смертью данной особи исчезают из генофонда популяции. Соматические мута ции, вероятно, возникают очень часто и остают ся обычно незамеченными, но в некоторых слу чаях при этом образуются клетки с повышенной
скоростью роста и деления. Эти клетки могут дать начало опухолям — либо доброкачественным, которые не оказывают влияния на другие ткани, либо злокачественным, паразитирующим на дру гих тканях (рак, меланомы, саркомы).
Эффекты генных мутаций чрезвычайно раз нообразны. Б'ольшая часть мелких генных мута ций фенотипически не проявляется, поскольку они рецессивны, однако известен ряд случаев, когда изменение всего лишь одного основания в генетическом коде оказывает глубокое влияние на фенотип. Одним из примеров служит серпо видноклеточная анемия — заболевание, вызывае мое у человека заменой одного основания в одном из генов, ответственных за синтез гемоглобина. Более подробно это заболевание и его причины описаны в разд. 25.7.2.
24.9.4. Значение мутаций
Хромосомные и генные мутации оказывают раз нообразные воздействия на организм. Во многих случаях эти мутации летальны и нарушают раз витие; у человека, например, около 20% бере менностей заканчиваются самопроизвольным выкидышем в сроки до 12 нед при этом у половины абортусов выявляются хромосомные аномалии. Если в результате некоторых хромо сомных мутаций определенные гены оказывают ся рядом, то иногда их совместный эффект может привести к появлению какоголибо бла гоприятного признака. Кроме того, сближение некоторых генов делает менее вероятным их раз деление в результате кроссинговера, а в случае благоприятных генов это создает преимущества.
Генная мутация может привести к тому, что в определенном локусе окажется несколько ал лелей. Это увеличивает гетерозиготность данной популяции, делает более разнообразным ее гено фонд и ведет к усилению внутрипопуляционной изменчивости. Перетасовка генов как результат кроссинговера, независимого распределения, случайного оплодотворения и мутаций может повысить непрерывную изменчивость, но ее эволюционная роль часто оказывается преходя щей, так как возникающие при этом изменения могут быстро сгладиться. Что же касается генных мутаций, то некоторые из них увеличивают дис кретную изменчивость, и это может оказать на популяцию более глубокое влияние. Большин ство генных мутаций рецессивны по отношению к «нормальному» аллелю, который успешно
214 Глава 24
выдержал отбор на протяжении многих поколе ний. Будучи рецессивными, мутантные аллели могут оставаться в популяции на протяжении многих поколений, пока им не удастся встре титься, т. е. оказаться в гомозиготном состоянии и проявиться в фенотипе. Время от времени мо гут возникать и доминантные мутантные аллели, которые немедленно проявляются в фенотипе (разд. 27.5, Biston betularia).
Материал, изложенный в этой главе, дает представление о происхождении внутрипопуля ционной изменчивости и о механизмах наследо вания признаков, но он не объясняет, каким образом могло возникнуть поразительное разно образие живых организмов, описанное в гл. 2. Попытка ответить на этот вопрос составляет содержание трех следующих глав.
2
2
5
5

ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

о второй половине XX столетия биоло гия вступила в свой «Золотой век». За
В
ры ДНК в 1953 г. до появившейся не так давно возможности расшифровать генетический код человека, на стыке генетики и молекулярной биологии сформировалась новая могуществен ная отрасль науки — биотехнология. Ее значе ние отражает хотя бы тот факт, что в США именно на биотехнологию расходуется почти половина средств, выделяемых на академиче ские исследования. Биотехнология находит применение в промышленности, медицине, сельском хозяйстве и многих других областях. Ее достижения могут быть направлены на благо людей, но могут принести человечеству и неис числимые беды. С той же проблемой в первой половине XX века столкнулись физики, когда с открытием строения атома появилась возмож ность использовать ядерную энергию как в мир ных, так и в разрушительных целях. Фрэнсис Крик и Морис Уилкинс, которые вместе с Джеймсом Уотсоном получили Нобелевскую премию за расшифровку структуры ДНК, были физиками, и до того как занялись биологией, работали над созданием оружия. Накопленный опыт заставил этих ученых очень внимательно относиться к этическим аспектам своих иссле дований. Вот почему, когда в конце 70х гг. поя вились сомнения в этичности и безопасности генной инженерии, Крик и Уилкинс приоста новили свою работу. Вы — будущие биологи и тоже когданибудь будете нести ответственность за решения, принятые в ходе обсуждения новых
время, прошедшее от открытия структу
спорных вопросов, которые непременно будут возникать по мере углубления наших познаний в области молекулярной генетики. Чем большей информацией мы владеем, вырабатывая собст венную точку зрения, и чем больше людей гото во обсуждать эти проблемы, тем с большей веро ятностью принятые нами решения окажутся правильными.
Генная инженерия
В первой части этой главы речь будет идти о генной инженерии. Это самый мощный метод, имеющийся в арсенале прикладной генетики и биотехнологии. С его помощью можно изучать и изменять генетические инструкции, закоди рованные в хромосомах растений и животных. Люди получили возможность модифицировать на пользу себе другие организмы и (в перспекти ве) лечить наследственные болезни (генная тера пия). Главные вехи в развитии генной инжене рии представлены в табл. 25.1.

25.1. Генная инженерия бактерий

Основные методы генной инженерии были раз работаны в начале 70х гг. Суть этих методов — введение в организм нового гена. Такой ген может быть синтезирован заново, а может быть перенесен из другого организма. Если в геном бактерии встроить ген, кодирующий какой либо белок, бактериальная клетка превращается в живую фабрику по производству этого белка.
216 Глава 25
Таблица 25.1. Главные вехи в развитии генной инженерии. (По The encyclopaedia of molecular biology, J. Kendrew, 1994, Blackwell Science.)
1960e–1970e Выделены и впервые использованы для анализа структуры ДНК рестрикционные ферменты
1972–1973 Разработаны методы клонирования, включающие получение рекомбинантных ДНК. Клонирован
1974 Впервые осуществлена экспрессия чужеродного гена в бактериальной клетке
1977 Впервые прочитан генетический код организма (нуклеотидная последовательность полного
1978 Получен соматостатин человека с помощью бактерий, несущих искусственный ген. Позднее в том
1982 В Великобритании и США одобрено использование генноинженерного инсулина (Humulin фир
1981/1982 Получены первые трансгенные животные (мыши)
1983 Получены первые трансгенные растения
1985 Получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные (кролики, свиньи и овцы)
1986 Впервые осуществлен контролируемый перенос в окружающую среду организмов, модифици
1989 Впервые запатентовано трансгенное животное — онкомышь
1990 Начаты работы по проекту «Геном человека». Впервые в США успешно применена генная
1990–1992 Получены первые трансгенные зерновые культуры (кукуруза и пшеница)
1992 В США и Европейском Союзе введены правила, регулирующие использование генетически моди
1993 В Великобритании стали использовать генную терапию муковисцидоза и тяжелого комбиниро
1994 На рынок США поступили трансгенные томаты
1996 На рынок Великобритании поступили трансгенные томаты.
1997 Осуществлено клонирование животного из одиночной клетки. Овца Долли выращена из
(рестриктазы)
первый ген (бактериальный)
генома). Этим организмом был бактериофаг IХ174, длина его генома составляет 5375 п.н.
же году в бактериях с искусственного гена был синтезирован инсулин человека
мы Eli Lilly)
рованных методами генной инженерии
терапия муковисцидоза и тяжелого комбинированного иммунодефицита (разд. 25.7.11)
фицированных организмов (ГМО). Прочитана полная нуклеотидная последовательность хромо сомы (хромосома III дрожжей)
ванного иммунодефицита
отдельной клетки вымени
В качестве примера рассмотрим перенос в клетку бактерии генов, кодирующих инсулин человека, гормон роста человека и бычий соматотропин (БСТ) (разд. 25.2.1–25.2.3).
25.1.1. Обзор
Получить копию любого гена в настоящее вре мя — задача совсем нетрудная. В некоторых случаях для этого требуется всего одна исход ная копия. Получение множества идентичных
копий называют клонированием. В качестве клонирующего вектора (т. е. переносчика ДНК, которую нужно клонировать) традици онно используют плазмиды или бактерио фаги. Плазмиды — это небольшие кольцевые фрагменты ДНК, обнаруженные в некоторых бактериях. Они отделены от основной (хромо сомной) ДНК, и могут реплицироваться не зависимо от нее (разд. 2.3.1). Бактериофаги (или, для краткости, фаги) — это вирусы, которые могут вводить свою ДНК в бактери
Прикладная генетика 217
альную клетку, где эта ДНК реплицируется (рис. 2.19). Фрагменты ДНК, которые необхо димо клонировать, соединяют либо с плаз мидной, либо с фаговой ДНК. Полученная «конструкция», состоящая из ДНКфрагмен тов различных организмов, называется реком бинантной ДНК. Если такую ДНК ввести в бак териальную клетку, то с каждым циклом деле ния увеличивается и число копий рекомби нантной ДНК. Встроенный в бактериальный геном чужеродный ген может использоваться для получения в промышленных количествах полезного белка, например такого, как инсу лин человека, который в норме не произво дится бактериальной клеткой.
Процесс клонирования схематически изо бражен на рис. 25.1 и более детально описывает ся ниже. Встраивание новых генов в эмбрионы растений и животных с целью создания так на зываемых трансгенных организмов (организмов, которые могут передавать эти гены потомству) является более трудной задачей. Эта тема будет обсуждаться в разд. 25.3–25.5.
Генную инженерию бактерий можно подраз делить на пять этапов.
Этап 1. Выделение копии нужного гена из
всех остальных генов организма.
Этап 2. Встраивание нужного гена в вектор. Этап 3. Использование вектора для введе
ния нужного гена в реципиентную клетку.
Этап 4. Отбор клеток, в которые вошла
чужеродная ДНК (донорная ДНК).
Этап 5. Клонирование гена.
Приведенная выше очередность этапов — самая простая. Однако в некоторых случаях по рядок действий может быть иным; например, в вектор может быть встроена и клонирована целая группа (или библиотека) генов и лишь затем выделен нужный ген.
25.1.2. Этап 1. Получение копии
нужного гена
Это самая трудная часть процесса. Например, в геноме человека (геном — это вся ДНК в клет ке) насчитывается около 3 млрд. нуклеотидов и
~
100 000 генов (по последним данным
~ Типичный ген имеет несколько тысяч пар нук
~
30 000).
~
леотидов в длину, так что даже найти конкрет ный ген не так просто. Для получения копии ге на используют три метода:
1) с помощью обратной транскриптазы по лучают копию гена на матрице его мРНК;
2) синтезируют искусственный ген;
3) используют метод «дробовика» («shot gun»), включающий разрезание ДНК рестрикционными ферментами (рестрик тазами) и поиск фрагмента, содержащего нужный ген.
Методику генной инженерии мы проиллюст рируем сначала на примере использования двух первых методов, которые прямо ведут к цели, т. е. позволяют выделить нужный ген. Затем мы рассмотрим третий метод.
Использование обратной транскриптазы
Несмотря на то, что в диплоидной клетке есть только две копии каждого гена (одна — в хромо соме, которая получена от матери, другая — в хромосоме, полученной от отца), активно функционирующий ген обычно образует тыся чи комплементарных молекул мРНК (разд.
23.8). Чаще всего известно, в каких клетках дан ный ген активен. Например, ген, кодирующий инсулин, активен в Eклетках поджелудочной железы. Ретровирусы содержат фермент, кото рый может синтезировать на молекуле РНК комплементарную копию ДНК. Получение ДНК на матрице РНК — это процесс, который противоположен нормальной транскрипции, когда РНК синтезируется на матрице ДНК, поэтому фермент назвали обратной транскрипта зой. Он стал ценным инструментом генной ин женерии. (Сами ретровирусы используют этот фермент для того, чтобы превратить собствен ный геном, состоящий из РНК, в ДНК, которая способна инфицировать новые клетки; разд.
2.4.5.) Если известно, в каких клетках активен интересующий нас ген, выделить из этих клеток мРНК несложно. Когда эта задача выполнена, мРНК с помощью обратной транскриптазы превращают в ДНКкопию нужного гена (рис.
25.1). Полученную таким способом ДНК назы вают комплементарной ДНК, или кДНК, незави симо от того, является она одноцепочечной или двухцепочечной.
218 Глава 25
Рис. 25.1. Генная инженерия. Схема процедуры, разработанной для клонирования генов. Детали объясняются в тексте.
Прикладная генетика 219
Синтез гена
Последовательность оснований в гене можно определить либо непосредственно, либо исходя из аминокислотной последовательности белка, кодируемого этим геном. Затем можно сконст руировать ген из нуклеотидов (напомним, что каждое основание является частью одного нук леотида), соединив их друг с другом в правиль ном порядке. Сейчас таким способом удается конструировать только короткие гены, однако с усовершенствованием методов синтез любого гена станет рутинной процедурой. Этот метод был использован для получения генов проинсу лина и соматостатина. Соматостатин (известный также как ингибитор гормона роста) — это белковый гормон, состоящий всего из 14 амино кислот.
Метод «дробовика» — использование рестрикционных ферментов
Этот первый метод выделения генов был раз работан в конце 1960х — начале 1970х гг. Его появление стало возможным благодаря открытию ферментов, называемых рестрикци онными (от англ. restricting — ограничива ющий) эндонуклеазами или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, спо собны разрезать ДНК, например они разреза ют любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая (рестри цируя) таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий проду цируют различные рестрикционные эндонук леазы. Каждая из них разрезает нуклеиновую кислоту (отсюда, «нуклеаза») в строго опреде ленных точках («эндо» означает, что фермент разрезает молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую после довательность оснований и взаимодействует именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательнос тей. Свою собственную ДНК бактерия защи щает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы.
Название каждого фермента происходит
от названия бактерии, из которой его выделя
ют (рис. 25.2). Обратите внимание на то, что рестрицируемая последовательностьмишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т. е. читается одина ково в обоих направлениях. Рассматривая рис. 25.2, помните, что две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы про изводят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными концами (например, EcoRI, (рис. 25.2). Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими конца ми других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой (рис. 25.1). Например, широко используемая рестриктаза EcoRI образует липкий конец — ТТАА. Есть рестриктазы, формирующие тупые концы. К ним относится, например, HindII (рис. 25.2). С помощью ре стриктаз ДНК любого организма можно фраг ментировать. Длина образовавшихся рестрик ционных фрагментов зависит от типа используе мой рестрикционной эндонуклеазы и от того, где расположены последовательности основа ний, которые узнаются данным ферментом (рис. 25.3).
Известно, что каждый нуклеотид в ДНК не сет фосфатную группу, которая заряжена отри цательно, поэтому фрагменты ДНК различной длины заряжены неодинаково. Эти различия можно использовать для разделения фрагмен тов ДНК в электрическом поле методом гель электрофореза (рис. 25.4). Как следует из назва ния метода, он предполагает использование агарозного (для очень больших фрагментов) или полиакриламидного (для фрагментов мень ших размеров) геля. Поскольку ДНК бесцветна, положение того или иного фрагмента в геле по сле электрофореза выявляют либо с помощью окрашивания, либо используя радиоактивно меченную ДНК и проводя радиоавтографию, в ходе которой на гель накладывают фотографи ческую пленку. Радиоактивное излучение засвечивает пленку в том месте, где расположе на ДНК.
При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше.