Клиническая_лабораторная_диагностика_2019_А_А_Кишкун_2_е_изд_

Источник KingMed.info

4) экономическая составляющая, т.е. стоимость лабораторных тестов, которая существенно выше у технологий, обладающих большей аналитической и диагностической чувствительностью и специфичностью, имеет большое значение, поэтому необходимо проводить анализ соизмеримости клинической эффективности лабораторных тестов и их стоимости, т.е. оправдывают ли они свою стоимость.

Каждый метод исследования направлен на определение того или иного компонента биологического материала или группы родственных компонентов (клеток, генов, белков, метаболитов, химических соединений), поэтому все технологии, используемые в КДЛ, можно объединить в следующие группы:

1)методы выявления изменений клеточного состава (качественного и количественного) биологических жидкостей и тканей;

2)методы исследования белков, включая гормоны, онкомаркеры, иммуноглобулины;

3)методы исследования метаболитов и химических соединений;

4)методы выявления генетических нарушений.

Такое разделение методов достаточно условное и упрощенное, так как методы, отнесенные к одной группе, могут в определенных сочетаниях относиться к другой группе. Например, метод проточной цитометрии с использованием моноклональных антител основан на выявлении определенных белков на мембранах клеток (кластеров дифференцировки - CD), но в конечном итоге предоставляет клиницисту информацию об изменениях клеточного состава (качественного и количественного) в пробах крови и тканях при гемобластозах или иммунных нарушениях. Аналогичная ситуация и в отношении микроплашеч-ной или гелевой технологии при выявлении антигенных систем эритроцитов в иммуногематологии, в которых с помощью моноклональных антител определяют специфические белки на мембране эритроцитов.

Необходимую клиническую информацию об изменениях клеточного состава (качественного и количественного) биологических жидкостей и тканей в КДЛ получают путем микроскопии, использования гематологических и мочевых анализаторов, анализаторов спермы, проточных цитофлуориметров.

Наиболее часто для целей клинической практики в КДЛ в пробах биологического материала исследуют специфические белки, метаболиты и химические соединения. Для выявления изменений протеомно-метаболических нарушений в пробах биологического материала используют множество методов, которые можно разделить на две группы.

I группа - методы, основанные на прямом оптическом измерении фотометрических величин светового потока при его прохождении через растворы белков и метаболитов, и методы, которые на основании физико-химических свойств белков и метаболитов позволяют первоначально их выделить, а затем путем измерения фотометрических величин светового потока при его прохождении через раствор определить концентрацию белков и метаболитов:

1)фотометрия, включая нефелометрию, турбидиметрию, флуориметрию;

2)электрофорез, включая капиллярный;

3)масс-спектрометрия;

4)хроматография;

5)высокоэффективная жидкостная хроматография.

21

Источник KingMed.info

II группа - методы иммунного анализа, основанные на реакции «антигенантитело» как с использованием химических и физических меток и последующим измерением фотометрических величин светового потока при его прохождении через растворы белков (метаболитов), так и без меток и последующей визуальной оценки:

1)иммуноэлектрофорез;

2)иммунотурбидиметрия;

3)иммуноферментный анализ (ИФА);

4)иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА);

5)иммунофлюоресцентный анализ;

6)радиоиммунный анализ;

7)микроскопия с использованием моноклональных антител (иммуногисто-химия);

8)флюоресцентная микроскопия с использованием моноклональных антител;

9)микроплашечная и гелевая технологии для исследования антигенных систем эритроцитов в иммуногематологии;

10)проточная цитометрия с использованием моноклональных антител;

11)методы на основе биочипов.

Самым распространенным методом исследования белков на сегодняшний день является фотометрия. С ее помощью удается быстро установить состав белков в исследуемом образце (сыворотке, плазме, моче, спинномозговой жидкости) посредством анализа коэффициента отражения и пропускания излучения при прохождении его через окрашенный раствор с помощью фотоэлектрических приемников оптического излучения (фотоприемников) - приборов, превращающих световую энергию в электрическую. К фотометрическим методам относятся нефелометрия (основана на способности белков рассеивать излучение), турбидиметрия (основана на способности белковых растворов пропускать излучение) и флуориметрия (основана на способности белковых растворов переизлучать поглощенное излучение). Открытие все новых и новых реагентов, образующих окрашенные соединения с белками, разработка принципов сопряженных реакций («фермент-субстрат», «белок-ли-пид», «белок-нуклеиновая кислота») существенно расширяет возможности применения фотометрических методов. Высокая чувствительность, точность, быстродействие и удобство использования для рутинных исследований предопределяют широкое применение оптических методов в клинической лабораторной диагностике для исследования белков и метаболитов.

Исследование белков методом электрофореза основано на том, что при определенном значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их массе и суммарному заряду. Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Капиллярный электрофорез является относительно молодым методом разделения и анализа белков, используемым в КДЛ. Капиллярный электрофорез - метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различиях в электрофоретических подвижностях заряженных белков в буферных электролитах.

Одним из самых современных методов протеомных исследований является масс-спектрометрия - метод, позволяющий установить количественный и качественный состав белков в исследуемом

22

Источник KingMed.info

образце, будь то очищенный и выделенный белок, сыворотка крови или клеточный лизат. Масс- спектро-метрия - метод исследования, основанный на разделении белков после их ионизации в высоком вакууме с помощью электрических и магнитных полей на основании отношения массы белка к его заряду. Другими словами, чтобы получить масс-спектр белков, первоначально в анализаторе нейтральные белки в пробе биологического материала превращаются в заряженные частицы - ионы (ионизируются), затем в высоком вакууме с помощью электрических

имагнитных полей разделяются на основании массы и полученного заряда в пространстве/времени, в последующем сигнал от полученных заряженных белков (ионов) фиксируется детектором ионов. Среди различных вариантов масс-спектрометрии в практике КДЛ для исследования пептидов, белков, углеводов, олигонуклеотидов наибольшее распространение получила матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) - десорбционный метод мягкой ионизации,

обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. Последующее сопряжение метода MALDI (источник ионов) с времяпролетным (Time Of Flight

- TOF) масс-спектрометром (система разделения ионов), в котором заряженные частицы разделяются по времени пролета определенного расстояния, при этом время пролета частицы пропорционально отношению массы данной частицы к ее заряду, привело к поистине революционным возможностям для использования метода в клинической практике. В настоящее время метод MALDI-TOF позволяет получать информацию о протеиновых профилях биологических жидкостей тканей организма человека при различных заболеваниях; осуществлять анализ белковых молекул микроорганизмов и тем самым ускоренно идентифицировать виды микроорганизмов (бактерий, грибов), что имеет первостепенное значение для ранней диагностики инфекционных заболеваний; обнаруживать нуклеотидные мутации (полиморфизмы) в генах пациента (проводить анализ нуклеиновых кислот - ДНК, РНК), генах бактерий и вирусов, что позволяет выявлять предрасположенность к мультифакториальным заболеваниям человека; осуществлять типи-рование микроорганизмов и обнаруживать генетические маркеры лекарственной устойчивости.

Метаболомное профилирование с помощью масс-спектрометрического анализа плазмы/сыворотки крови имеет большое значение для оценки риска возникновения и разработки методов профилактики социально значимых заболеваний, таких как рак предстательной железы, легкого, колоректальный рак, сахарный диабет, нейродегенеративные и сердечно-сосудистые заболевания. Не меньшее значение метаболомное профилирование имеет

ив реализации современного подхода к персонализированной лекарственной терапии на основе анализа метаболического профиля, являющегося интегральным показателем интенсивности катаболизма ксенобиотиков в организме, текущего состояния организма и генетически детерминированной реакции на лекарственную терапию конкретного пациента.

Хроматография - это метод разделения белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках. В чистом виде метод хроматографии в практике КДЛ практически не используется. Его применяют в качестве дополнительного метода для первоначальной очистки пробы биологического материала при исследовании функционального состояния симпатоадреналовой системы (при определении адреналина, норадреналина, метанефринов, винилилминдальной кислоты в моче), для диагностики карциноидных опухолей (при определении 5-оксииндолуксусной кислоты в моче).

23

Источник KingMed.info

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) (HPLC - High Performance Liquid Chromatography) - один из эффективных методов разделения сложных смесей веществ, включая белки, метаболиты, стероидные гормоны, лекарственные препараты, химические соединения, вызывающие отравления, и их метаболиты. ВЭЖХ - это метод колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Метод широко используется в практике токсикологических лабораторий, в допинговом контроле. В КДЛ метод применяют для исследования стероидных гормонов, биогенных аминов (серотонина, гистамина), мониторинга лекарственных препаратов (наиболее часто в кардиологии, онкологии), исследования витаминов и ряда метаболитов. ВЭЖХ - это метод, в котором современная КДЛ остро нуждается для повышения своей клинической эффективности ввиду его неограниченных диагностических возможностей. Основными моментами, которые тормозят широкое использование ВЭЖХ в практике КДЛ, являются его дороговизна и отсутствие полной автоматизации метода для массовых анализов по широкому диапазону аналитов.

Ко второй группе лабораторных технологий относятся методы иммунного анализа, основанные на реакции «антиген-антитело» как с использованием химических и физических меток и последующим измерением фотометрических величин светового потока при его прохождении через растворы белков, так и без меток и последующей визуальной оценки. Все эти методы можно объединить понятием «иммунологические методы». До недавнего времени все революционные достижения в области клинической лабораторной диагностики для клинической практики в отношении возможностей диагностики протеом-

но-метаболических нарушений и самих заболеваний были связаны с этой группой методов исследования:

•для диагностики инфекционных заболеваний (выявления различных специфических антител к инфекционным агентам и их антигенов);

•выявления и определения уровня гормонов и лекарственных препаратов в биологических пробах;

•выявления иммунных комплексов;

•определения общего IgE и специфических IgE-антител;

•определения изотипов (IgG, IgM и др.) антител к конкретному антигену;

•определения специфических белков в сыворотке крови (тропонина, ферритина, фибронектина, D-димера и др.);

•выявления онкомаркеров;

•определения антигенов на поверхности или внутри клетки с помощью моноклональных антител (иммуногистохимический анализ);

•определения цитокинов в биологических жидкостях.

Такая революция стала возможна благодаря методам генной инженерии, которые позволили синтезировать и получать как чистые белки, так и моно-клональные антитела к ним, а технологическая возможность присоединения к комплексам «антиген-антитело» различных химических и физических меток сопровождалось небывалым расцветом лабораторных технологий. В практику КДЛ пришли методы иммунотурбидиметрии, иммуноэлектрофореза, ИФА, иммунохемилюминесценции, иммунофлюоресценции, радиоиммунного анализа и др.

24

Источник KingMed.info

Основные методы иммунного анализа, используемые для определения специфических белков, приведены в табл. 1.2.

Таблица 1.2. Методы иммунного анализа

Окончание табл. 1.2

Иммунотурбидиметрия - это количественное измерение концентрации специфических белков по изменению мутности раствора при реакции «антиген-антитело». Этот метод характеризуется достаточно высокой чувствительностью, которую можно повысить за счет использования латексных частиц, а также широкой возможностью автоматизации на биохимических анализаторах. Метод широко используется в практике КДЛ для определения уровня аполипопротеинов А1 и В, α1-антитрипсина, α2-макроглобулина, od-кислого гликопротеина, антитромбина III, церулоплазмина, С1-эстеразы, компонентов комплементов С3 и С4, гаптоглобина, иммуноглобулинов (IgG, IgA, IgM), компонентов иммуноглобулинов-каппа (легкие цепи Ig) и иммуноглобули-нов-лямбда (легкие цепи Ig), преальбумина, трансферрина. Иммунотурбиди-метрия является основным (65%) методом для исследования гликозилированного гемоглобина (НbА1с). Этот двустадийный метод основан на конкурентном связывании общего гемоглобина и HbА1с со специфическими латексными частицами пропорционально их концентрации. Затем происходит связывание гликогемоглобина и специфических мышиных моноклональных антител, которые, в свою очередь, взаимодействуют с козьими поликлональными антителами к IgG мыши, вызывая агглютинацию латексных частиц. Степень агглютинации зависит от количества связанного с латексными частицами гли-когемоглобина HbА1с. Увеличение мутности смеси измеряется фотометрически.

25

Источник KingMed.info

Иммуноэлектрофорез - это метод исследования иммуноглобулинов, который играет важную роль в диагностике и типировании парапротеинемий. Сущность иммуноэлектрофореза заключается в следующем: вначале проводят электрофоретическое разделение белков в геле, затем по окончании электрофореза в геле параллельно направлению электрофореза вырезают бороздки, в бороздки вносят антитела (антисыворотку), например, к тяжелым (альфа, дельта, эпсилон, гамма, мю) или легким (лямбда, каппа) цепям иммуноглобулинов. Эти антитела и разделенные при электрофорезе белки диффундируют навстречу друг другу. В тех местах, где антитела связываются с белками, образуются дуги преципитации. Наличие дуги преципитации с определенными цепями иммуноглобулинов позволяет отнести их к тому или иному типу.

В основе метода ИФА лежит способность энзимов и антител, ковалентно или нековалентно связанных с твердой основой, сохранять свои функциональные свойства (способность расщеплять субстраты). В качестве ферментов наиболее часто используют пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу. В ИФА антиген (например, фрагмент вируса, бактерии) сорбирован на твердой поверхности пластиковой лунки. В эту лунку вносится сыворотка крови больного. Если в ней содержатся антитела к инфекционному агенту, то они закрепляются на соответствующих антигенах. Затем в лунку вносят антитела с заранее прикрепленным к ним ферментом, способные связаться с антителами сыворотки крови обследуемого пациента, закрепившимися на инфекционном агенте. На следующей стадии в лунку добавляют раствор бесцветного вещества - субстрата, содержащего хромоген. Это вещество приобретает окраску после расщепления субстрата присутствующим в ячейке ферментом, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации антител в сыворотке крови. Интенсивность окраски оценивают с помощью фотометра. Если необходимо выявить содержание в сыворотке крови определенного белка (например, тиреотропного гормона или вируса), то в этом случае на твердой поверхности лунки сорбируются заведомо известные специфические антитела. К ним добавляется сыворотка крови, содержащая определенный белок (антиген). В случае соответствия антител антигену образуется комплекс «антитело-антиген», к которому, как и в предыдущем случае, добавляется комплекс «антитело-фермент», который способен расщеплять субстрат с образованием окрашенного продукта.

Хемилюминесценция - это процесс излучения фотонов при переходе электронно-возбужденных продуктов окислительных химических реакций в исходное энергетическое состояние. На этом физико-химическом феномене базируется метод иммунохемилюминесцентного анализа. В ИХЛА, так же как в ИФА, используется иммунологическая реакция с участием ферментов и антител, а в качестве субстрата присоединяются люминофоры - вещества, светящиеся в ультрафиолете (люмогенный субстрат). Уровень свечения измеряется на специальных приборах - люминометрах. Хемилюминесцентные реакции основаны на способности люминола светиться при окислении перекисью водорода. Для усиления сигнала используются различные соединения, например, люци-ферин, фенолы, в этом случае интенсивность люминесценции усиливается в 10100 раз, в отдельных вариантах - в 500 раз (усиленный хемилюминесцент-ный анализ). Люминесцентный сигнал очень стабилен, его уровень достигает максимума за 30 с (для сравнения: цветная реакция с использованием перокси-дазы хрена и О- фенилендиаминдигидрохлорида в качестве индикатора в ИФА полностью развивается лишь за 30 мин).

Методы ИХЛА делят на биолюминесценцию и хемолюминесценцию. Сущность биолюминесцентного иммуноанализа состоит в том, что в реакционную систему входят кофакторы (АТФ или NAD), субстрат (люциферин) и фермент (люциферазы светлячков или бактерий). В хемолюминесцентном иммуноана-лизе в реакционную систему добавляют субстрат,

26

Источник KingMed.info

окислитель, фермент-катализатор. В зависимости от используемой метки выделяют разновидности хемо-люминесцентного иммуноанализа.

1.В одних методах в качестве метки используют фермент-катализатор - пероксидазу, микропероксидазу (фрагмент цитохрома С). В настоящее время наибольшее распространение получил иммунохемилюми-несцентный анализ с двумя субстратами (люминол + люциферин) и пероксидазой в качестве метки, чувствительность метода оценивается в 10-13 М антигена.

2.В других методах в качестве метки применяют молекулы субстрата (изолюминол, эфиры акридина). Метод обладает высокой чувствительностью (10-12 М, или до 0,2 пг, антигена для изолюминола, до 10-18 М антигена для эфиров акридина).

3.В третьих методах в качестве метки для конъюгата антител вместо фермента используется ион металла рутения (Ru). Вблизи платинового электрода двухвалентный рутений (Ru+2) окисляется в трехвалентное состояние (Ru+3), в реакции в качестве поддержки используется трипропиламин (ТРА), который окисляется в ТРА+-радикал, теряя при этом протон. Этот радикал передает электрон Ru+3, создавая электронно-возбужденный Ru+2, который возвращается в базовое состояние, испуская фотон. Данная разновидность хемолюминесцентного иммуно-анализа известна под названием «электрохемилюминесцентный анализ» и широко представлена в практике КДЛ в виде анализаторов иммунохимических анализаторов Elecsys фирмы Roche

Diagnostics.

Во всех иммунологических методах реакция «антиген-антитело» происходит на твердой поверхности стенок пробирки, поверхности микропланшет или сферических бусинках, которые имеют относительно небольшую реакционную поверхность, что ограничивает чувствительность метода. Кроме того, продолжительность диффузии слишком велика для того, чтобы антиген (или антитело) достиг равновесия связывания, что является проблемой, особенно для больших молекул белков-антигенов. Для преодоления этих ограничений стали применять микрочастицы. Данная технология в полной мере воплощена в анализаторах на основе метода биолюминесцентного и хемилюминесцентного анализа. Микрочастицы имеют размеры от 0,8 до

100нм. Они представляют намного большую поверхность для реакции «антиген-антитело» на единицу веса. В результате длительность диффузии существенно уменьшается и возрастает скорость реакции, соответственно, время получения результата анализа сокращается. Однако дисперсная фаза микрочастиц требует применения устройств для разделения связанной и свободной фракций. В современных иммунохимических анализаторах эта проблема решена за счет использования магнитных частиц, поскольку они могут быть отделены из раствора (свободной фазы) применением магнитов. Магнитные частицы могут быть сферической и неправильной формы. У последних площадь поверхности больше до 10 раз по сравнению со сферическими. Именно поэтому метод ИХЛА обладает большей аналитической специфичностью и чувствительностью по сравнению с традиционным ИФА на планшетах и занимает меньше времени в КДЛ.

Иммунофлюоресцентный анализ основан на связывании антител, меченных флюорохромом (например, флюоресцеином изотиоцианатом), с антигенами. Концентрация вещества оценивается по интенсивности излучения в ультрафиолетовых лучах, возбуждающих свечение флюорохрома. Для измерения результатов иммунофлюоресцентного анализа в лабораториях используют анализаторы (флуориметры) или оценивают визуально с помощью флюоресцентной микроскопии (светящиеся комплексы «антиген-антитело» хорошо видны при микроскопии). Реакцию иммунофлюоресценции используют для изучения клеточных антигенов (наиболее

27

Источник KingMed.info

часто при системных заболеваниях соединительной ткани), выявления вируса в зараженных клетках и обнаружения бактерий и риккетсий в мазках.

Радиоиммунологический метод основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Высокая чувствительность и селективность РИА всем известны, однако очевидны и недостатки метода, прежде всего, радиоактивность и проблема захоронения отходов. Кроме того, в РИА усложнена стандартизация, так как срок годности наборов зависит от периода полураспада радиоактивного иода-125. Этим обусловлено развитие широкого спектра альтернативных методов, не требующих радиоактивных изотопов и использующих различные физические принципы количественного определения метки.

Иммуногистохимический анализ используется для определения антигенов на поверхности или внутри клетки, например, для обнаружения маркеров онкологических процессов на срезах тканей, лимфоцитов и иммунокомплексов при гломерулонефритах и других заболеваниях почек. В этой реакции для выявления антигенов пользуются или иммунофлюоресценцией, или иммуноферментными конъюгатами с пероксидазой. Количество специфических антигенов определяют по интенсивности окрашивания при микроскопии.

Микроплашечная и гелевая технологии для исследования антигенных систем эритроцитов широко используются в иммуногематологии. В основе технологии лежит реакция агглютинации, которая представляет собой склеивание эритроцитов - носителей антигена с помощью моноклональных антител к этому антигену. Микроплашечная и гелевая технологии позволяют выполнить весь спектр иммуногематологических исследований:

•определение группы крови по системе АВ0 (простая и перекрестная реакция);

•определение группы крови системы резус;

•фенотипирование антигенов эритроцитов всех известных систем;

•выявление, определение активности и специфичности аллоиммунных антиэритроцитарных антител классов IgG и IgM;

•определение аутоиммунизации к антигенам эритроцитов;

•индивидуальный подбор эритроцитсодержащих компонентов для переливания;

•диагностика иммуноконфликтной беременности и гемолитической болезни новорожденных.

Проточная цитофлуориметрия - метод лабораторной диагностики, позволяющий проводить абсолютный и относительный подсчет небольших концентраций популяций и субпопуляций клеток в биологическом материале. Для анализа клеток используют проточный цитофлуориметр - прибор, способный измерять оптические свойства индивидуальных клеток в суспензии. Большинство существующих в настоящее время приборов измеряют такие параметры клеток, как светорассеяние под разными углами и флюоресценция в различных диапазонах спектра.

В отличие от оптического микроскопа, проточная цитофлуориметрия не является методом визуализации: изображения клетки в процессе работы прибор не получает. Цитофлуориметры различных моделей могут существенно отличаться по конструкции проточной ячейки, однако в целом ее принципиальная схема работы может быть представлена в следующей последовательности:

1) ламинарный поток жидкости протекает по тонкому каналу в кювете из оптически прозрачного материала (кварца);

28

Источник KingMed.info

2)в одном из участков канала в его центре сфокусирован лазерный луч, и клетки в потоке последовательно пересекают эту точку;

3)в момент пересечения клеткой этого участка рассеянный ею свет лазера, а также флюоресценция регистрируются оптической системой прибора.

Флюоресценция клетки может возникать как за счет собственных химических соединений (автофлюоресценция), так и за счет применения специальных красителей. Применяются красители, специфически связывающиеся с теми или иными структурами и компонентами клеток (например, пропидиум йодид, связывающийся с ДНК), или конъюгаты красителей с моноклональными антителами, специфичными к определенным мембранам и цитоплазматическим антигенам клетки. Подход с использованием антител к мембранным антигенам является наиболее распространенным в проточной цитофлуориметрии. Одновременное использование нескольких красителей позволяет выделить популяции клеток с различным сочетанием исследуемых признаков. В частности, такой подход является очень важным при анализе содержания в крови различных фракций лейкоцитов, каждая из которых отличается уникальным сочетанием поверхностных белков - кластеров дифференциации. Все антитела с красителями при этом вносятся в суспензию клеток одновременно, но каждая клетка связывается только с антителами, специфичными к экспрессируемым ею антигенам.

Для определения фенотипа клеток используется метод иммунофено-типирования: клетки окрашиваются специфичными к CD антителами, конъюгированными с флюоресцентными красителями. Связывание маркированных антител с клеткой определяется тем, какие именно CD она экспрессирует. После такой окраски проводится анализ флюоресценции клеток с помощью проточной цитофлюориметрии.

Проточная цитофлуориметрия применяется в клинической практике:

1)в иммунологии - для определения субпопуляционного состава лимфоцитов и пролиферативного статуса клеток;

2)в онкогематологии - для иммунофенотипирования лимфом, острых и хронических лейкозов;

3)в трансплантологии - для определения в сыворотке реципиента антител к лейкоцитам донора, мониторинга отторжения трансплантата, динамического наблюдения за действием антилимфоцитарных препаратов;

4)в гинекологии - для выявления антиспермальных антител и изучения акросомальной реакции при диагностике иммунологического бесплодия.

Использование биочипов для определения уровня специфических белков и метаболитов основано на стандартных методах иммунохимического анализа, которые изложены выше. Биочип - это матрица, на которую наносятся биологические макромолекулы (ДНК, белки, в том числе ферменты и клетки), способные избирательно связывать вещества, содержащиеся в анализируемом биологическом материале. Чиповая технология используется в лабораторной диагностике для выявления вирусов и микроорганизмов, определения уровня гормонов, аллергенов, наркотиков, любых биологически активных веществ в малых концентрациях и метаболитов, а также в криминалистике, для исследований в области экологии и биобезопасности. Существуют три основных типа биочипов:

•клеточные;

•белковые;

29

Источник KingMed.info

• ДНК-чипы.

Клеточные биочипы используют в основном для иммунофенотипирования клеток при гемобластозах. Биочип в данном случае представляет собой прозрачную подложку, на которой в строго определенные участки нанесены иммобилизованные антитела (IgG), способные взаимодействовать с определенными поверхностными антигенами клеток.

Белковые биочипы основаны на регистрации реакции «антиген-антитело». Если анализируемый аналит (антиген или антитело) присутствует в образце пациента, то он связывается с поверхностью специфического лиганда и его концентрация может быть измерена. Присоединение анализируемого вещества к лигандам, связанным с биочипом, приводит после добавления сигнального реактива к образованию хемилюминесцентного сигнала, который легко обнаруживается и оценивается количественно. Для этих целей используют усиленный хемилюминесцентный субстрат с пероксидазой хрена в качестве метки для обнаружения анализируемых антител или анализируемого антигена, связавшихся со специфическими рецепторами на поверхности биочипа.

Молекулярно-генетические методы все более широко используются в клинической практике как для диагностики инфекционных заболеваний, так и выявления генетических мутаций. К ним относятся:

•метод полимеразной цепной реакции;

•метод гибридизации (метод генного зондирования);

•методы на основе ДНК-биочипов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из методов ДНК-диагностики, которая позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) клеток, бактерий или вирусов в миллионы раз с

использованием фермента ДНК-полимеразы. Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК с помощью фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНК-вирусы, например, вирус гепатита С.

ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В последние годы в практике КДЛ основное место занимает метод ПЦР в реальном времени, который использует общие принципы ПЦР и одновременно измеряет количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения продуктов амплификации используют либо флюоресцентные красители, интеркалирую-щие в двухцепочечные молекулы ДНК, или модифицированные олигонуклео-тиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Метод гибридизации (метод генного зондирования) основан на способности нуклеиновых кислот к образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (А-Т, Г-Ц). Для определения искомой последовательности ДНК (или РНК) специально создается так называемый зонд - полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В его

30