Виды молекулярно-генетической диагностики

А). Прямой метод.

При прямой диагностике предметом анализа являются мутации генов, которые приводят к развитию заболеваний. Главные преимущества прямого метода - высокая (до 100%) точность и возможность диагностики без анализа ДНК пробанда.

1. Образцы ДНК пациента под действием рестриктаз разрезаются на более короткие фрагменты, имеющие точки узнавания.

2. Полученные фрагменты разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле на фракции, отличающиеся размером (молекулярной массой).

3. Получение необходимого числа копий определенных фракций ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР).

4. Тепловая денатурация размноженной фракции двухцепочечной ДНК на одноцепочечные фрагменты.

5. Помещение этих фрагментов в среду с радиоактивным зондом (одноцепочечная ДНК, соответствующая патологическому гену). Если среди фрагментов ДНК имеется комплементарная зонду патологическая последовательность, то происходит образование двухцепочечной ДНК.

6. Регистрация результата исследования происходит при помощи рентгеночувствительной пленки.

Б) Непрямой (косвенный) метод.

Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще не известна, но имеется представление о положении гена на генетической карте.

Косвенная ДНК-диагностика сводится к анализу полиморфных генетических маркеров у больных и здоровых членов семьи. Маркеры должны быть расположены в том хромосомном регионе, где и ген болезни.

Основные этапы молекулярно-генетических методов:

1. Получение образцов ДНК или РНК является исходным этапом всех методов. Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Основная задача - накопление нужных фрагментов ДНК в условиях in vitro. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)- это метод амплификации ДНК в условиях in vitro. В соответствии с нуклеотидной последовательностью концов исследуемого участка синтезируется 2 олигонуклеотидных праймера (затравки). Длина праймеров 20-30 нуклеотидов. Процесс амплификации заключается в осуществлении повторяющихся циклов.

2. Рестрикция ДНК на фрагменты с помощью рестриктаз. Основное их свойство- разрывать двухцепочную ДНК в определенных последовательностях нуклеотидов. Рестриктазы- ферменты, выделенные из бактериальных клеток, которые разрезают молекулу ДНК на фрагменты в строго определенных местах. Применение этих ферментов дает возможность получить относительно короткие фрагменты ДНК, в которых достаточно легко можно определить последовательность нуклеотидов. Разработка метода обратной транскрипции ДНК на молекулах мРНК определенных белков с последующим клонированием этих ДНК привела к появлению ДНК-зондов. Использование таких зондов для гибридизации с ДНК-клеток соответствующего пациента дает возможность точно локализовать неблагоприятную генную мутацию.

3. Электрофорез фрагментов ДНК. Каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля.

4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле.

Разработаны и другие методы выявления специфических фрагментов ДНК с помощью блот- гибридизации по Саузерну.