Методы молекулярной генетики

Таблица 15.1.

Метод	Цель и возможности метода
Химический синтез ДНК	Получение ДНК с помощью ДНК-синтетаз. Результатом являются олигонуклеотиды (одиоцепочечные молекулы), использующиеся в качестве ДНК-зондов, праймеров для ам­плификации нуклеотидных последовательностей, фрагментов для синтеза генов.
Рестрикция	Получение фрагментов ДНК с помощью ферментов - рестриктаз. Построение рестрикционных карт хромосом
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)	Создание множества копий фрагмента ДНК. Последующее изучение фрагментов путем электрофореза с целью выявления мутаций
Гибридизация с ДНК-зондами	Определение с помощью ДНК-зондов специфических нуклеотидиых последовательностей ДНК, выявление положения гена, диагностика генных болезней
Клонирование	Получение фрагменов ДНК в большом количестве с использованием плазмид и фагов (генная инженерия). Возможность получения белка, кодируемого клонированным фрагментом ДНК. Создание коллекций клонов ДНК, геномных библиотек.
Секвенирование	Определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК. Возможность диагностики генных болезней
Функциональные методы	Изучение функций генов. Анализ транскриптон и продуктов гена с применением электрофореза, хроматографии, спектрометрии, РНК чипов, белковых чипов и т.д.

Рестрикция ДНК

Получить фрагмент геномной ДНК с целью последующего изучения можно путем рестрикции ДНК. Выделенная из клеток органов ДНК подвер­гается расщеплению рестрикционными эндонуклеазами (рсстрикгазами). Эго ферменты бактериального происхождения, участвующие в распознавании чужеродных молекул ДНК и их уничтожении. Каждый такой фермент способен узнавать в любой двухценочечной молекуле ДНК специфическую последовательность из 4-12 нуклеотидов. Такие последовательности часто являются палиндромными, т.с. последовательности нуклеотидов в них читаются в обоих направлениях одинаково. Две цепи ДНК разрезаются в участке узнавания или вблизи от него, причем цепи во многих случаях разрезаются нс прямо друг против друга, а наискосок, образуя в результате «липкие» концы. Эти одноцепочечные концевые участки способны образовывать комплементарные пары оснований с любыми другими одноцепочеч­ными концевыми участками, полученными с помощью того же фермента.

Известно более 500 различных типов рестриктаз. каждая из которых способна разрезать молекулу ДНК в определенном месте - сайте рестрикции. Длина рестрикционных фрагментов зависиг от распределения сайтов в исходной молекуле ДНК: чем чаще расположены сайты, тем образующиеся фрагменты короче.

В зависимости от частоты расположения сайтов рестрикции выделяют три класса рестриктаз: часто расщепляющие, узнающие короткие специфические последовательности длиной в 4-5 нуклеотидов, средне расщепляющие, узнают последовательности 6-7 пар нуклеотидов, редко расщепляющие, узнают последовательности 8-12 пар нуклеотидов.

После обработки участка ДНК несколькими рестрикгазами образуются рестрикционные фрагменты, и с помощью специального анализа можно определить расположение этих фрагментов относительно друг друга в молекуле ДНК, т.е. построить рестрикционную карту.