2. . Исследование структуры биологических мембран с помощью физических методов.

Первая модель строения биологических мембран была предложена в 1902 г. Овертон заметил, что через мембраны лучше всего проникают вещества, хорошо растворимые в липидах и на основании этого предположил, что биологические мембраны состоят из тонкого слоя фосфолипидов. На самом деле, на поверхности раздела полярной и неполярной среды (например, воды и воздуха) молекулы фосфолипидов образуют мономолекулярный (одномолекулярный) слой (см. рис. 1.1). Их полярные «головы» погружены в полярную среду, а неполярные «хвосты» ориентированы в сторону неполярной среды. Поэтому можно было предположить, что биологические мембраны построены из монослоя липидов.

Рис. 2.1 Мономолекулярный слой липидов на поверхности раздела полярной и неполярной среды.

В 1925 году Гортер и Грендел установили, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов. Гортер и Грендел экстрагировал липиды из гемолизированных эритроцитов ацетоном, затем выпаривали раствор на поверхности воды и измеряли площадь образовавшейся мономолекулярной плёнки липидов. На основе результатов этих исследований было сделано предположение, что липиды в мембране располагаются в виде бимолекулярного слоя (рис. 2.2).

Рис. 2.2. Бимолекулярный слой липидов.

Это предположение подтвердили исследования электрических параметров мембран (Коул и Кертис, 1935г.): высокое электрическое сопротивление и большая электроемкость на единицу площади мембраны ( 10⁷ Ом м² и О,5 10^-2 Ом/м² соответственно).

Биологическую мембрану можно рассматривать как электрический конденсатор (рис. 2.3).

Рис. 2.3. Мембрана, как конденсатор (объяснения в тексте).

Проводниковые пластины конденсатора образуют электролиты наружного и внутреннего растворов (внеклеточного и цитоплазмы).

Проводники разделены липидным бислоем. Липиды – диэлектрики с диэлектрической проницаемостью ε = 2

Емкость плоского конденсатора ,

C= (2.1)

где электрическая постоянная ε₀ = 8,85 10^-12 Ф/м - электрическая постоянная,

ℓ - расстояние между пластинами конденсатора.

Удельная ёмкость на единицу площади поверхности мембраны:

C_уд= (2.2)

Отсюда можно найти расстояние между пластинами конденсатора, примерно соответствующее в нашем случае толщине липидной части мембраны:

ℓ = м ≈ 3 -4 нм (2.3)

Это как раз соответствует по порядку величины толщине неполярной части двухмолекулярного слоя липидов, сложенного определенным образом.

Вместе с тем, имелись экспериментальные данные, которые свидетельствовали о том, что биологическая мембрана состоит и из белковых молекул. Например, при измерении поверхностного натяжения клеточных мембран было обнаружено, что измеренные значения коэффициента поверхностного натяжения значительно ближе к коэффициенту поверхностного натяжения на границе раздела белок-вода (около 0.1 дин/см), нежели на границе раздела липид-вода (около 10 дин/см). Эти противоречия экспериментальным результатам были устранены Даниэлли и Девсоном, предложившими в 1935 году так называемую «бутербродную» модель строения биологических мембран, которая с некоторыми несущественными изменениями продержалась в мембранологии в течение почти 40 лет. Согласно этой модели, мембрана – трехслойная: она образована двумя расположенными по краям слоями белковых молекул, с липидным бислоем посредине (рис. 2.4); образуется нечто вроде бутерброда: липиды, наподобие масла, между двумя «ломтями» белка.

Рис.2.4 Трёхслойная «бутербродная» модель строения биологической мембраны.

Однако по мере накопления экспериментальных данных пришлось в конце концов отказаться и от «бутербродной» модели строения биологических мембран.

Огромную роль в развитии представлений о строении биологических мембран сыграло всё большее проникновение в биологию физических методов исследования.

Большую информацию о структуре мембран, о взаимном расположении атомов мембранных молекул дает рентгеноструктурный анализ (см. раздел III. 2.7), основанный на изучении дифракции коротковолновых рентгеновских лучей на атомах. Рентгеноструктурный анализ позволяет обнаруживать упорядоченность в расположении атомов и определять параметры упорядоченных структур (например, расстояния между кристаллографическими плоскостями).

Согласно формуле Вульфа-Бреггов расстояние между кристаллографическими плоскостями d, длина волны рентгеновского излучения λ и угол скольжения, соответствующий дифракционному максимуму k-го порядка связаны между собой соотношением

2 d sin θ = 𝑘 λ , 𝑘=0,1,2… (2.4)

.

Зная длину рентгеновской волны λ, можно по углу скольжения θ, соответствующему дифракционному максимуму k- го порядка, определять параметр кристаллической решетки d:

d= (2.5)

Исследования дифракции рентгеновских лучей подтвердили относительно упорядоченное расположение липидных молекул в мембране – двойной слой с более или менее параллельно расположенными жирнокислотными хвостами; дали возможность точно определить расстояние между полярной головой липидной молекулы и метильной группой в конце углеводородной цепи.

Наибольшие успехи в раскрытии особенностей строения биологических мембран были достигнуты в электронно-микроскопических исследованиях (см. раздел III, 5.2). Как известно, световой микроскоп не позволяет рассмотреть детали объекта меньше примерно половины длины волны света (около 200 нм). В световом микроскопе можно разглядеть отдельные клетки, однако он совершенно непригоден для изучения биологических мембран, толщина которых в 20 раз меньше предела разрешения светового микроскопа.

Разрешающая способность микроскопа ограничена явлением дифракции. Поэтому, чем меньше длина волны по сравнению с деталями исследуемого объекта, тем меньше искажения. Предел разрешения z пропорционален длине волны λ:

z~λ

Согласно формуле де Бройля длина волны движущегося электрона:

,

m - масса электрона, ѵ - его скорость, р – импульс электрона.

Электронам, разогнанным до больших скоростей, тоже присущи волновые свойства, в том числе явление дифракции, однако при достаточно больших скоростях длина волны де Бройля достаточно мала и соответственно мал предел разрешения электронного микроскопа. У электронов, ускоренных в электрическом поле с напряжением U= 10⁵ В, скорость

ѵ = ≈10⁸

а длина волны де Бройля:

λ≈0,005 нм

Однако в силу некоторых конструктивных особенностей электронного микроскопа его предел разрешения z составляет не тысячные доли нанометров, а порядка z≈0,5 нм, что, однако, уже позволяет рассмотреть отдельные детали строения биологических мембран.

В электронном микроскопе достигается увеличение в сотни тысяч раз, что позволило исследовать строение клетки, клеточных органелл и биологических мембран.

Недостатком электронной микроскопии является деформация живого объекта в процессе исследования. В электронном микроскопе нельзя рассматривать живую клетку. Перед началом электронно- микроскопических исследований клетка проходит через многие стадии предварительной обработки: обезвоживание, закрепление, ультратонкий срез, обработка препаратов соединениями тяжелых металлов, плохо пропускающих электроны (например, осмия или марганца) с целью повышения контрастности изображения. При этом изучаемый объект значительно изменяется. Несмотря на это, успехи в изучении клетки при помощи электронного микроскопа несомненны.

При помощи электронной микроскопии удалось получить изображение биологических мембран, на снимках видно трехслойное строение мембраны. Новая информация о строении мембраны была получена с помощью метода «замораживание-скол-травление». По этому методу клетку охлаждают до очень низкой температуры в жидком азоте. Охлаждение проводится с очень большой скоростью (около 1000 градусов в секунду). Затем клетки раскалываются специальным ножом и помещаются в вакуум. Твёрдая стеклообразная вода быстро возгоняется, освобождая поверхность скола (этот процесс и называют травлением). После травления получают реплику (отпечаток со сколотой поверхности), наносят на нее смесь углерода и платины и фотографируют в электронном микроскопе. Мембраны при скалывании расщепляются и вдоль границы двух липидных монослоев и поэтому можно видеть их внутреннее строение. (рис. 2.5).

Рис. 2.5. Интегральные белки, обнаруженные методом «замораживание-скол-травление» (объяснение в тексте).

Было обнаружено, что имеются белковые молекулы, погруженные в липидный биослой и даже прошивающие его насквозь, что привело к существенному изменению представлений о строении мембран.

К методам изучения динамики мембран, позволяющим исследовать их, не разрушая, относятся флюоресцентный метод и методы радиоспектроскопии – ЭПР и ЯМР (см. разделIII, 8.5). Эти методы дают сведения о движении и взаимодействии мембранных молекул и отдельных частей молекулы. Было выяснено, что при физиологических условиях липидные молекулы находятся в жидком агрегатном состоянии. Метод ЭПР показал, что не вся поверхность биологической мембраны покрыта белками. Так, например, больше половины поверхности мембраны кишечной палочки образована полярными головами липидов.