3.2. Безопасность в отношении приемных белков

Для анализа биологического материала на содержание прионных белков ВОЗ рекомендованы методы гистохи­мии, электронной микроскопии, электрофореза и иммуноблотинга с антителами к прионному (РгР) белку [Мемо­рандум совещания ВОЗ, 1992; Киселев О. И. и соавт., 1998; Покровский В. И. и соавт., 2004]. '

С целью подтверждения отсутствия в выделенных нуклео-протеиновых комплексах прионных белков изучали скон­центрированные в 200 раз образцы препаратов. Для изу­чения использовали НПК, выделенные из органов, наибо­лее опасных в отношении содержания прионных белков, — коры головного мозга, эпифиза головного мозга, тканей глаза, хрящевой ткани: церебрамин, эпифамин, офталамин, хондрамин соответственно.

Для первичного скрининга прионных инфекций ВОЗ рекомендован гистохимический метод, основанный на окрашивании исследуемого препарата красителем конго-красным. По характерному свечению в скрещенных по­ляризаторах окрашенного конго-красным препарата мож­но выявитm наличие в препарате амилоида, т. е. класса бел­ков, к которому относятся прионы.

Результаты гистохимического исследования представ­лены на рис. 7.

При окрашивании красителем конго-красным сконцен­трированных фракций церебрамина, офталамина, эпифа-мина и хондрамина, фиксированных на полиакриламидном геле, не наблюдалось избирательного связывания красителя. Просмотр окрашенных препаратов в скрещен-

Рис. 7. Анализ церебрамина гистохимическим методом

Окрашивание конго-красным х 600. Свечения амилоида не наблюдается. Точки - пузырьки в геле, светлое пятно — рассеяние света в геле

ных поляризаторах не выявил какого-либо характерного для амилоидных агрегатов свечения. При исследовании препарата амилоидной печени человека обнаруживалось яркое избирательное окрашивание конго-красным и ха­рактерное желто-зеленое свечение амилоидных фибрилл в скрещенных поляризаторах (рис. 8).

Таким образом, с использованием гистохимического метода наличия амилоида и амилоидоподобных белковых соединений, в том числе прионов, при исследовании НПК выявлено не было.

В настоящее время разработаны более специфичные и высокочувствительные методы выявления прионных бел­ков, чем гистохимическое окрашивание конго-красным, в частности иммуноблотинг и прямое электронно-микро­скопическое выявление прионов в виде скрэпи-ассоции-рованных фибрилл (САФ) в сочетании с протеолизом.

Иммуноблотинг — высокоспецифичный метод, позволяю­щий выявить в препарате различные варианты РгР-белка, в том числе инфекционные прионы.

Рис. 8. Анализ препарата амилоидной печени человека

гистохимическим методом. x6ОО

Свечение амилоидных фибрилл при наблюдении в скрещенных

поляризаторах окрашенного конго-красным препарата

Для иммуноблотинга использовали моноклональные антитела к клеточ­ному (неинфекционному) РгР^с и инфекционному РгР^Sc бел­кам — 6Н4 (check-kit PRIONICS).

Результаты исследования представлены на рис. 9 и 10. В препарате хондрамин по результатам электрофоре­за в полиакриламидном геле (рис. 9) не было выявлено белков с молекулярной массой ниже 45-50 кДа, что сви­детельствует об отсутствии белков класса прионов (27-30 кДа), После инкубации мембраны PVDF с исследуемы­ми образцами препаратов хондрамин и офталамин без протеазцой обработки с антителами 6Н4 и последующего окрашивания не было выявлено никаких бэндов связыва­ния, т. е. прионных белков в исследованных препаратах не обнаружено (рис. 10).

Рис. 9. Анализ нуклеопротеиновых комплексов методом

электрофореза в полиакриламидном геле

Дорожки: 1 — церебрамин; 2 — хондрамин; 3 — офталамин; 4 — эпифамин; 5 — маркерные белки (молекулярная масса 30, 40 кДа)

В препаратах церебрамин и эпифамин до протеолити-ческой обработки методом электрофореза (рис. 9) были выявлены слабые полосы на уровне молекулярной массы 30-35 кДа, что свидетельствовало о наличии нормально­го клеточного белка РгР^св исследуемых препаратах. Пос­ле обработки образцов протеиназой К, инкубации с анти­телами 6Н4 и последующего окрашивания ни в одном из исследованных препаратов не было выявлено связывания с антителами (рис. 10), что свидетельствует об отсутствии инфекционного прионного белка.

Таким образом, методом иммуноблотинга установле­но, что связывания антител с церебрамином, офталамином, эпифамином и хондрамином не наблюдалось. Сле­довательно, нормальный клеточный прионный белок (РгР^с), присутствующий в исходном сырье, эффективно элиминируется в технологическом процессе и в конечном продукте не обнаруживается. Аномальные модификации прионного белка (PrP^Sc), т. е. инфекционные прионы, так­же не выявлены.

Прямое электронно-микроскопическое выявление прионных белков в виде скрэпи-ассоциированных фибрилл в сочетании с протеолизом позволяет обнаружить наличие прионов сразу по двум характерным признакам: протео-литической резистентности и морфологическим особен­ностям фибриллярных структур, образуемых прионами. Некоторые авторы указывают на то, что агрегация от­дельных прионных молекул с образованием жгутообразных структур типа САФ может происходить уже после обработки протеиназой К в небольшой концентрации, по­этому в отдельных случаях (видимо, при наличии сильно гликозилированных форм) прионы не обнаруживаются электронно-микроскопически до обработки протеиназой.

При исследовании сконцентрированных в 200 раз бел­ковых фракций НПК фибриллярных структур в виде так называемых «прионных палочек» и скрэпи-ассоцииро­ванных фибрилл выявлено не было. На угольных подлож­ках обнаруживались только следы сорбции низкомолеку-

Рис. 10. Анализ нуклеопротеиновых комплексов методом иммуноблотинга

Дорожки: 1 — церебрамин; 2 — хондрамин; 3 — офталамин; 4 — эпифамин. Слева — дорожки до обработки протеиназой К, справа - после обработки

Рис. 1 1 . Анализ церебрамина

электронно-микроскопическим методом

Изображение углеродной подложки, на которой сорбирован церебрамин.

Негативный контраст, х 30 000

Какие-либо волокна отсутствуют. Видны только светлые округлые пятна —

следы сорбции низкомолекулярных водорастворимых соединений. Темные

области — контрастирующее вещество

лярных соединений. После протеолиза никаких структур, похожих на прионы, также не выявлено (рис. 11).

Таким образом, диагностическими методами, рекомен­дованными ВОЗ, в том числе с использованием иммуно­блотинга и электронной микроскопии, белковых соедине­ний класса амилоидов, в том числе прионов, в нуклеопро­теиновых комплексах не выявлено.