Лабораторна робота №1

Тема: Визначення концентрації глюкози у біологічних рідинах глюкозооксидазним методом

Мета роботи: оволодіти глюкозооксидазним методом кількісного визначення глюкози.

Клініко-діагностичне значення: збільшення змісту глюкози в крові (гіперглікемія) спостерігається при цукровому діабеті, гострому панкреатиті, панкреатичних цирозах, емоційних стресах, після ефірного наркозу, частого прийому вуглеводів з їжею, а також при підвищенні гормональної активності ряду залоз (щитовидної, гіпофізу, коркового і мозкового шару наднирків).

Зниження рівня глюкози в крові (гіпоглікемія) зустрічається при поражені паренхіми печінки, порушенні ферментативної активності, при розпаді глікогену, недостатньої функції щитовидної залози, наднирків, гіпофізу, передозуванні інсуліну при лікуванні цукрового діабету, порушенні всмоктування вуглеводів, отруєннях фосфором, бензеном, хлороформом, при недостатньому прийомі з їжею вуглеводів, після великих втрат крові.

Принцип методу: глюкоза в присутності глюкооксидази окислюється киснем повітря до глюконової кислоти та перекису водню, який у присутності пероксидази реагує з фенолом та 4-амінофеназоном з утворенням хіноніміну червоно-фіолетового забарвлення, який визначається фотометрично.

Реактиви:

1. Ензими (розчин): пероксидаза, β,D-глюкооксидаза, 4-амінофеназон, стабілізатори, активатори.

2. Буферний розчин (фосфатний буфер – рН 7,2-7,4), фенол.

3. Калібрувальний розчин глюкози (10±0,5) ммоль/л.

4. Фізіологічний розчин.

Обладнання:

1. Штатив для пробірок.

2. Пробірки градуйовані – місткістю 10 мл (10 – 12 шт. – контрольна, калібрувальна, дослідна проби).

3. Дозатор 10, 20 мкл, 1000 мкл, 200 – 2000 мкл; наконечники.

4. Піпетки місткістю 0,1 мл; 1,0 мл.

5. Фотоелектроколориметр (λ=500 – 546 нм); кювети з товщиною прошарку 1 см.

6. Водяний термостат або автоматична водяна баня, здатна підтримувати температуру 37±0,1 ⁰С (можливо використання сухоповітряного термостата з механічною циркуляцією повітря).

7. Стеклограф або маркер.

8. Годинник.

Матеріал для аналізу: сироватка крові.

Концентрація глюкози стабільна протягом 24 годин при температурі від + 2 до + 8 ⁰С, за умови, що сироватка або плазма приготовлені не пізніше 30 хв. після забору крові. Якщо вміст глюкози в сироватці крові або плазмі вище 27,7 ммоль/л, її необхідно розбавити фізіологічним розчином у 5 разів і повторити дослідження.

Приготування робочих розчинів: для використання набору у варіанті біреагенту розчини готові до використання і стабільні до закінчення гарантійного терміну придатності (при дотриманні умов збереження – температура від + 2 до +16 ⁰С).

Хід роботи:

Складаємо робочу схему проведення досліду.

Калібрувальний розчин глюкози розбавляють у 10 разів: 0,1 мл калібрувального розчину глюкози (10 ммоль/л) змішують із 0,9 мл фізіологічного розчину.

Аналіз проводиться у відповідності за схемою, наведеною у таблиці.

Таблиця

Відміряти у пробірку, мл	Буферний розчин	Ензими	Фізіоло-гічний розчин	Розведений калібру-вальний розчин	Аналізує-мий матеріал	Показники оптичної щільності
						Е кал. пр.	Е досл. пр.
1	2	3	4	5	6	7	8
Холоста проба (контроль)	2,00	2,00	0,04	–	–
Калібрувальна проба	2,00	2,00	–	0,4	–
Дослідна проба 1.	2,00	2,00	–	–	0,04
2.	2,00	2,00	–	–	0,04
3.	2,00	2,00	–	–	0,04
4.	2,00	2,00	–	–	0,04
5.	2,00	2,00	–	–	0,04
6.	2,00	2,00	–	–	0,04
7.	2,00	2,00	–	–	0,04
8.	2,00	2,00	–	–	0,04
9.	2,00	2,00	–	–	0,04
10.	2,00	2,00	–	–	0,04
Змішати, витримати при кімнатній температурі (від + 18 0С до + 25 0С), або 12 хв. при температурі + 37 0С. Вимірюють оптичну щільність калібрувальної (Е кал. пр.) та дослідної проби (Е досл. пр.) проти холостої проби.

Розрахунок концентрації глюкози за формулою:

С = 10,0 ∙ Е досл. пр. / Е кал. пр.

де: 10 – концентрація калібрувального розчину глюкози (ммоль/л);

Е досл. пр. − оптична щільність дослідної проби, од. опт. щільності;

Е кал. пр. – оптична щільність калібрувальної проби, од. опт. щільності.

Контроль якості: достовірність одержуваних результатів контролюють за допомогою атестованих контрольних сироваток “Ліонорм” (Чехія) або “Біоконт С” (Росія).

Нормальна величина вмісту глюкози в сироватці, плазмі крові − 3,9-6,1 ммоль/л.

Висновок до лабораторної роботи.