Актуальные вопросы современной гепатологии

роли вируса в развитии заболевания. Первые работы, посвященные изучению гепатита А, продемонстрировали наличие ВГА в фекалиях и крови больных в инкубационный и в течение 2-3 недель желтушного периода.

Максимальная концентрация антигена ВГА регистрируется на поздней стадии инкубационного периода и в продроме. В дальнейшем процент положительных результатов его обнаружения постепенно уменьшается ко второй и третьей неделям желтушного периода и составляет 20 и 5% соответственно.

Определение продолжительности выделения вируса в процессе инфекции имеет важное практическое значение. От того, как долго больной остается опасным для окружающих, зависят сроки его госпитализации в стационаре, время проведения заключительной дезинфекции в очаге и другие противоэпидемические мероприятия.

В сыворотке крови Аг ВГА удается обнаружить значительно реже. Продолжительность виремии меньше (от нескольких часов до нескольких дней), чем период выделения ВГА с фекалиями. Подтверждением факта циркуляции в крови больного HAV и реальности заражения через инфицированную кровь служат зарегистрированные случаи посттрансфузионного гепатита А.

Разработка и внедрение методов выявления РНК открыли новые возможности в лабораторной диагностике гепатита А. Особое значение имеют результаты обнаружения РНК ВГА в сыворотке крови больных. РНК удается обнаружить в период «окна», то есть до появления Ig M анти-ВГА. Учет данного факта важен при диагностике в инкубационный период и при обследовании лиц из очагов инфекции.

РНК ВГА удается определить и в периоды ранней и поздней реконвалесценции. В типичных случаях время циркуляции вируса может достигать 40 дней. Особенно часто длительное обнаружение РНК ВГА в сыворотке крови регистрируется в случаях затяжного гепатита и у лиц с измененным иммунным статусом.

Наличие разнообразных маркеров инфицирования ВГА и методов их тестирования значительно расширило современные диагностические возможности. В таблице 1 представлен перечень этих маркеров с возможной интерпретацией результатов исследования.

21

Таблица 1

Специфические маркеры инфицирования вирусом гепатита А и интерпретация их обнаружения

Диагностика гепатита Е

В 90-е годы эпидемическая форма «ни А ни В гепатита», вызывающая вспышки в странах с жарким климатом, была обозначена как гепатит Е. Вирус идентифицирован в 1983 году при проведении эксперимента с заражением добровольца материалами, полученными от больных, у которых был заподозрен гепатит Е (Балаян М.С., 1995). В последующие годы подробно изучены свойства HEV: это частица сферической формы диаметром 27-34 нм с одноцепочечной РНК, не покрытая оболочкой.

Как и при гепатите А, специфическая лабораторная диагностика гепатита Е строится на тестировании комплекса серологических маркеров инфицирования ВГЕ (анти-ВГЕ классов Ig M и Ig G), непосредственно вируса и его компонентов. Для гепатита Е характерно последовательное появление и исчезновение маркеров в ходе заболевания и в процессе выздоровления. Обобщенная схема представлена ниже (рис. 5).

Острый гепатит Е может быть заподозрен в эпидемических случаях у лиц с острым «ни А ни В гепатитом». Иммуноферментный анализ позволяет выявить анти-ВГЕ Ig M и/или Ig G.

Антитела класса Ig M присутствуют в сыворотке от 2 до 24 недель после острого начала болезни. Антитела класса IgG также появляются через 2 недели, и обычно их титр начинает снижаться после 2-х лет, хотя иногда высокие титры могут наблюдаться в течение многих лет. Выздоровление от острого заболевания приводит к пожизненному иммунитету.

22

Рисунок 5. Динамика обнаружения маркеров инфицирования ВГЕ при остром гепатите Е

Основным методом исследования, позитивный результат которого свидетельствует о наличии вируса, является метод полимеразной цепной реакции. По мнению A.Anderson и I.Shresta (2002), обнаружение РНК ВГЕ может рассматриваться как «золотой стандарт» лабораторной диагностики гепатита Е. Для подтверждения своих слов авторы ссылаются на данные обнаружения ВГЕ в случаях отсутствия антительного ответа, определяемого на момент обнаружения РНК ВГЕ.

Антитела класса IgA играют важную роль в патогенезе гепатита Е, обеспечивая защиту организма на слизистых оболочках желу- дочно-кишечного тракта, препятствуя дальнейшему проникновению ВГЕ в организм человека.

Обнаружение разнообразных маркеров инфицирования ВГЕ значительно расширило современные диагностические возможности. В таблице 2 представлен их перечень с возможной интерпретацией результатов исследования.

23

Таблица 2

Специфические маркеры инфицирования вирусом гепатита Е и интерпретация их обнаружения

Диагностика HCV-инфекции

Вирус гепатита С (HCV) идентифицирован в 1989 году американскими исследователями под руководством M.Houghton, когда была выделена нуклеиновая кислота при экспериментальном заражении шимпанзе и в дальнейшем получена ДНК-копия, которую использовали для создания библиотеки клонов. Скрининг образцов из этой библиотеки позволил выявить клон, экспрессирующий антиген, который реагировал с антителами из сывороток людей, больных посттрансфузионным гепатитом «ни А, ни В». Далее был получен рекомбинантный белок, который содержал последовательность из 363 аминокислотных остатков. Эту последовательность обозначили как С-100-3 и использовали в качестве антигена при создании иммуноферментной тест-системы. В результате стало возможным диагностировать гепатит С и начать его всестороннее изучение.

Вирус гепатита С относится к гепатотропным вирусам, но при этом доказана возможность его внепеченочной репликации, в частности в мононуклеарах крови. Весьма важным свойством этого вируса является способность ускользать из-под иммунного надзора - «immune escape virus». В основе этой способности лежит перманентное и быстрое изменение антигенной структуры, в результате чего вирус воспроизводит себя не в каком-либо постоянном антигенном варианте, а в целой серии близких, но иммунологически различных штаммов (кажущихся разновидностей – «quasispecies»). В отличие от HBV механизм интеграции в геном хозяина вирусу гепатита С не присущ.

24

Острый гепатит С (ОГС), как правило, протекает бессимптомно или с минимальными клиническими проявлениями. 70-80% больных предъявляют жалобы только на быструю утомляемость и различной степени выраженности слабость, лишь только у 20-30% больных можно выявить клинически значимые проявления заболевания. Если же имеются признаки желтушного синдрома, то клиническое течение ОГС, лабораторные биохимические тесты, морфологические изменения в ткани печени ничем не отличаются от других вирусных гепатитов. Уникальной особенностью HCV является крайне высокая степень развития хронического гепатита С (рис. 6). Известно, что в 50-90% случаев отмечается неспособность организма к спонтанной элиминации инфекции в зависимости от пути передачи, наличия симптомов гепатита, а также возраста, в котором произошло инфицирование.

Цирроз печени 20-30% за 20-30 лет

Гепатоцеллюлярная карцинома 3% в год

Рисунок 6. Течение инфекции, обусловленной вирусом гепатита С

(цит. по L.Garnier, G.Inchauspe, C.Trepo, 2002)

25

Учитывая перечисленные особенности клинического течения HCV-инфекции, само понятие «острый гепатит С» носит скорее символический характер, так как в большинстве случаев инфекция выявляется на хронической стадии заболевания. Условным рубежом, разграничивающим ОГС и ХГС, является срок в 6 месяцев от дебюта клинических симптомов.

Рисунок 7. Динамика обнаружения маркеров инфицирования HCV при остром гепатите с элиминацией вируса

Только эпидемиологические данные с указанием возможного времени инфицирования анти-HCV после серонегативного периода на фоне персистенции HCV РНК могут достоверно подтвердить диагноз острого гепатита С (рис. 7).

Серологическая диагностика гепатита С имеет ряд особенностей. Основным методом является определение антител к HCV (рис. 8). Наибольшее распространение благодаря своей надежности и чувствительности получил иммуноферментный анализ (enzyme immunosorbent assay, ELISA). Существуют три поколения диагностических иммуноферментных систем, которые различаются своей специфичностью.

26

Рисунок 8. Динамика обнаружения маркеров инфицирования HCV при остром гепатите с хронизацией процесса

Трудности при диагностике (ИФА) гепатита С связаны со следующими причинами:

1)отсутствие активной клиники;

2)вирус очень быстро меняется по субтипам;

3)до 20% HCV присутствует в клетках крови;

4)позднее появление антител против вируса;

5)отсутствие вакцинации.

Для того чтобы понять, с чем связаны трудности ИФАдиагностики и отсутствие вакцины к вирусу гепатита С, необходимо представить структуру вируса.

Геном вируса – одиночная цепь РНК – разделен на зоны, в которых заключена информация о структурных и неструктурных белках (рис. 9). Структурная зона представлена следующими участками:

-Core – кодирует ядерные белки;

-E1и E2 (envelop 1 и envelop 2, или NS1 – у некоторых авторов)

–отвечает за синтез оболочечных белков.

Неструктурная зона также разделена на участки NS2, NS3, NS4А, NS4В, NS5А, NS5В, которые содержат информацию о ферментах, определяющих жизнедеятельность вируса.

27

При детальном молекулярно-генетическом исследовании нуклеиновых последовательностей участка NS5 к настоящему моменту обнаружено 6 вариантов генотипа и большое количество субтипов вируса (номенклатура P.Simmonds et al., 1993).

Рисунок 9. Структура генома вируса гепатита С. Указаны белки вируса, которые кодируются соответствующими

участками генома

Структурный белок core формирует вирусный нуклеокапсид. Он является одним из наиболее иммуногенных белков вируса и индуцирует мощный Т- и В-клеточный ответ. Показано, что в первый месяц острой фазы гепатита С, когда содержание антител незначительно, только количество core белка увеличивается столь же быстро, как и вирусная РНК. Количественный анализ содержания core белка не выявил различий у будущих реконвалесцентов и хронических больных. После 6 месяцев гепатита С скорость увеличения РНК и белка снижается. Почти все пациенты, выздоровевшие от острого гепатита С, имеют пожизненно анти-core антитела из-за высокой иммуногенности этого белка.

Белок NS2 является вирусной металлозависимой протеиназой и вместе с клеточной пептидазой участвует в аутокаталитическом нарезании самого себя из вирусного полипротеина. Белок NS3 – это вирусная протеиназа, играющая важную роль в процессинге вирус-

28

ных белков. Белок NS4А действует как кофактор для NS3протеолитической активности и регулирует фосфорилирование белка NS5А, который обладает функцией репликазы. Белок NS5В является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой. В инфицированной вирусом клетки белки NS4А, NS4В, NS5А, NS5В и NS3 ассоциируются в общую структуру, которая играет важную роль в вирусной репликации. Из-за отсутствия 3´-5´ - экзонуклеарной активности эта РНК-полимераза при репликации делает много ошибок, что приводит к высокой скорости мутации. Оба белка области NS5 иммуногенны.

Вострой фазе антитела к неструктурным белкам определяются позднее, чем антитела к структурным белкам. Часто у выздоравливающих пациентов в конце острой фазы происходит снижение титра анти - NS3 антител перед исчезновением вируса. Вероятно, длительно высокие титры антител к NS3 в острой фазе гепатита С можно рассматривать как маркер хронизации. Антитела к NS4 белку в острой фазе детектируются как в высоких, так и в низких титрах вне связи с исходом заболевания. Антитела к NS5 в высоких титрах в конце острой фазы рассматриваются как неблагоприятный признак.

Для надежного выявления вируса гепатита С тест-системы должны иметь несколько (4-6) моноклональных антител к разным структурным эпитопам вируса гепатита С. И даже это не гарантирует, что исследователь не столкнется с очередной модификацией вируса, в которой не будет нужных эпитопов. По мере расширения представлений о структуре вируса методы выявления инфекции становятся все более чувствительными. Высокая изменчивость вируса гепатита С – причина отсутствия до настоящего времени вакцины от этой инфекции.

Тест-система 1-го поколения (ELISA-1) с 1989 года выявляла антитела к антигенам 5-1-1 и С-100-3. Указанные антитела к неструктурным антигенам региона NS3/NS4 определяются только через 3-12 месяцев после инфицирования HCV, специфичность метода составляет 70-80%.

Вдальнейшем были получены новые клоны РНК HCV, продуцирующие другие вирусные антигены для обнаружения соответствующих антител (табл. 3), что привело к появлению 2-го (1991 г.)

и3-го (1993 г.) поколения ELISA. Тесты второй генерации выявляют антитела к core- (С22) и NS3/NS4-антигенам (С33), при этом

29

специфичность составляет более 90%. Положительным данный тест становится через 2-6 месяцев после инфицирования, поскольку гуморальный иммунный ответ на капсидные антигены (структурные белки) начинается быстрее, чем на неструктурные белки. Важно, что только у 40% больных тесты второго поколения положительны через 2 месяца. Таким образом, серологические тест-системы первого и второго поколений не пригодны для подтверждения диагноза острого ГС.

ELISA-3 широко используется для скрининга доноров, являясь значительно более чувствительной и специфичной по сравнению с тест-системами предыдущих поколений. Большое значение имеет возможность выявления с помощью ELISA-3 антител к NS-5 региону, так как до 5% вирусоносителей имеют в крови только данный тип антител, что приводит к ложноотрицательным результатам при использовании первых поколений ELISA.

Использование ELISA-3 дает почти 100% гарантию выявления носителей анти-HCV. Однако в двух случаях антитела могут быть не обнаружены. Во-первых, появление анти-HCV происходит в срок до 6 месяцев после инфицирования (в среднем через 12 недель), то есть в определенный период течения инфекции имеется так называемое «серологическое окно». Во-вторых, антитела могут не выявляться у больных, получавших иммуносупрессорную терапию (например, после трансплантации органов). Кроме того, несмотря на высокую специфичность ELISA-3 (99,7%), возможны также ложноположительные результаты. Важно помнить, что ложноположительные анти-HCV нередко встречаются при аутоиммунных заболеваниях, в том числе при аутоиммунном гепатите, особенно 2 типа. Учитывая это, предложены подтверждающие тесты, такие как рекомбинантный иммуноблотинг (recombinant immunoblot assay, RIBA).

При использовании RIBA антигены HCV наносятся раздельно на полоски нитроцеллюлозы и инкубируются с сывороткой больного. При наличии соответствующих антител происходит их визуализация. Тест-система 3-го поколения (RIBA-3), широко распространенная в Европе, содержит синтетические пептиды core-региона, NS4, рекомбинантные NS3 и NS5 (табл. 3). Результаты RIBA считаются положительными при выявлении антител более чем к одному региону HCV.

30