Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

где fcp — объемная доля цитоплазмы, содержащейся внутри клеток биоткани. Поскольку примерно 60 % всей жидкости в мягкой ткани содержится в межклеточном пространстве, а ncp = 1,367 и nis = 1,355 [201], то из соотношения (1.15) следует, что n0 = 1,362. Показатель преломления материала частицы можно представить как сумму показателя преломления основного вещества и добавки h ni за счет других компонентов,

Среднее значение вариации показателя преломления h ni определяется объем- но-взвешенным средним, зависящим от содержания компонентов ткани:

Здесь нижние индексы f, is, nc, cp и or относятся соответственно к волокнам, межтканевой жидкости, ядрам клеток, цитоплазме и другим органеллам. Члены в круглых скобках представляют собой разности между показателями преломления более плотных компонентов ткани и их окружения, множители — объемные доли компонентов ткани. Показатель преломления волокон соединительной ткани составляет около 1,47, что соответствует примерно 55 % гидратации коллагена, их основного компонента. Ядра и такие органеллы, как митохондрии и рибосомы, имеют показатели преломления, лежащие в сравнительно узком интервале 1,38–1,41. При

условии, что n n = 1,40, можно выразить h ni только через объемную долю

nc = or

фиброзной ткани ff:

Коллаген и эластин составляют примерно 70 % сухого веса обезжиренной кожи, 45 % ткани сердца и 2–3 % немышечных внутренних органов [216]. Поэтому, в зависимости от типа биоткани, ff может быть и малой величиной около 0,02, и большой около 0,7. Для nf − nis = 0,115 и nnc − ncp = 0,033 вариации среднего показателя преломления, соответствующие этим двум предельным случаям, равны h ni = 0,035 и 0,09, или для n0 = 1,362, ns = n0 + h ni = 1,397 и 1,452.

Полидисперсность случайно распределенных рассеивающих частиц можно учесть с помощью гамма-распределения, либо асимметричного логарифмического распределения частиц по диаметрам, сечениям или объемам [13, 215, 216, 222, 224, 228]. Например, для склеры глаза применимо гамма-распределение по радиусам волокон

где σ/am = 2,35µ−0,5, β = a/am, σ — полуширина распределения, а am — наиболее вероятный радиус рассеивающей частицы.

Двухфазная система, состоящая из ансамбля малых частиц одинакового размера с примесью небольшого числа более крупных частиц, представляет собой хорошую модель катаракты хрусталика глаза человека [229].

Для эпителиальных тканей, у которых основными рассеивателями являются структуры ядер, митохондрий и других органелл, характерно логарифмически-нор- мальное распределение по размерам сферических или слегка вытянутых эллипсоидальных частиц вида [230]

Вчастности, при исследовании карциномы простаты крысы для клеток эпителия

икомпонентов их ядер были найдены два логарифмически-нормальных распреде-

отдельными частицами сравнимы с размерами самих частиц. Если распределение частиц по размерам достаточно узкое, то плотная упаковка вносит в расположение частиц определенную степень упорядоченности.

Пространственная упорядоченность исключительно важна для оптических тканей глаза — роговицы, хрусталика и стекловидного тела [13, 167, 168, 231–234, 237]. Пространственный порядок в той или иной степени присущ и другим тканям, в частности, таким как сухожилие, хрящ, твердая мозговая оболочка (dura mater), дерма кожи и мышечная ткань. Высокая степень упорядоченности плотно упакованных рассеивающих частиц гарантирует прозрачность роговицы и хрусталика глаза.

Структуры ткани со статистически упорядоченными периодическими изменениями показателя преломления с масштабом порядка длины волны, как у фотонных кристаллов [238], в одних спектральных областях демонстрируют высокое пропускание, а в других — полосы, в которых распространение электромагнитных волн запрещено. Положение и глубина этих полос зависит от размера, показателя преломления и пространственной упорядоченности рассеивающих частиц.

Коэффициент упаковки частиц различной формы с объемной долей fs выражается следующей формулой [217]:

где p — упаковочная размерность, которая характеризует, как быстро пустое пространство между частицами сокращается по мере роста плотности частиц. Упаковка сферических частиц хорошо описывается размерностью p = 3. Упаковка частиц в виде плоских листов или стержней характеризуется размерностями, приближающимися к 1 и 2 соответственно. Элементы ткани имеют все эти формы и могут одновременно проявлять цилиндрическую и сферическую симметрию, поэтому упаковочная размерность может принимать любые значения между 1 и 5. При расчете оптических параметров среды с высокой концентрацией распределение по размерам η(2a), полученное для невзаимодействующих частиц (см. формулы (1.19)–(1.22)), следует скорректировать на корреляцию частиц [216]:

На основе сочетания теории многократного рассеяния (см. главу 2) с представлением ткани как системы частиц была разработана микро-оптическая модель, описывающая многие наблюдаемые оптические характеристики мягких биотканей [216]. В модели ткань рассматривается как набор рассеивающих частиц, объемные доли которых подчиняются асимметричному логарифмически-нормальному распределению, модифицированному упаковочным множителем p для учета коррелированного рассеяния света плотно упакованными частицами (см. формулы (1.21), (1.22) и (1.24)). Предполагая, что волны, рассеянные отдельными частицами в тонком слое моделируемой ткани, складываются случайно, можно аппроксимировать объемный коэффициент рассеяния суммой коэффициентов рассеяния частиц данного диаметра,

а именно

Np

X

36 Гл. 1. Основы лазерной биомедицины

доли сухого веса волокон (ff = 0,03; 0,3 и 0,7), рассчитанные для трех длин волн (633, 800 и 1300 нм). В целом эти расчеты хорошо согласуются с данными экспериментальных исследований оптических параметров мягких тканей в условиях in vitro и даже in vivo.

Итак, представленная модель позволяет заключить, что [216] 1) биоткань лучше всего описывается ансамблем частиц с широким распределением по размерам; 2) коэффициент рассеяния убывает с длиной волны примерно по степенному закону µs λ2−Df при 600 6 λ 6 1400 нм, где Df — ограничивающая фрактальная размерность 3) частицы с диаметрами между λ/4 и λ/2 определяют рассеяние назад; 4) частицы с диаметрами между 3λ и 4λ ответственны за экстинкцию света, рассеянного вперед.

Однако, как следует из работы [239], фрактальная размерность Df сильно зависит от того, как проводится дискретизация непрерывного распределения частиц по размерам. В модели десяти сфер фрактальная размерность лежит в диапазоне 3 < Df < 4 [216]. Для модели сфер, размер которых меняется от 5 нм до 30 000 нм с шагом 5 нм, диапазон фрактальной размерности определен как 4 < Df < 5 [239]. Однако и в этой модели коэффициент рассеяния убывал с длиной волны по степенному закону µs λ3−Df при 600 6 λ 6 1500 нм. Следовательно, обе модели дают степенной закон зависимости коэффициента рассеяния от длины волны µs λ−h с показателем h, лежащим в интервале 1–2.

Приведенный (транспортный) коэффициент рассеяния также убывает с ростом длины волны в соответствии со степенным законом, что было продемонстрировано экспериментально для нормальной, обезвоженной и коагулированной аорты человека

Экспериментальные данные для контрольных и обработанных образцов аорты человека представлены в табл. 1.7. Например, при прямом нагреве (100 ◦C) наблюдалось наибольшее снижение показателя h от 1,38 до 1,06.

Т а б л и ц а 1.7. Значения показателей h степенной зависимости от длины волны µ′s λ−h для контрольных (hcontrol) и экспериментальных (hexp) спектров приведенного коэффициента рассеяния (400–1300 нм) для аорты человека (в скобках приведены среднеквадратичные отклонения) [240, 241]

In vitro исследование воздействия глицерина на кожу крысы также подтвердило степенную зависимость для µ′s в диапазоне длин волн 500–1200 нм с h = 1,12 для кожи в норме с последующим уменьшением h по мере выдержки кожи в глицерине (скорее всего за счет эффекта дегидратации) [242]. Значения h составляли 1,09 через 5 мин, 0,85 через 10 мин, 0,52 через 20 мин и 0,9 при обратном гидратировании образца после окончания действия глицерина.

In vivo измерения диффузного отражения от кожи человека также продемонстрировали степенной закон зависимости µ′s от длины волны [243]:

Теория рассеяния волн Тверски [244, 246] вполне согласуется с данными измерений оптической плотности для слоя цельной крови [247]. Однако она не описывает пространственное распределение отраженного и прошедшего света и потому не позволяет использовать ее при других взаимных расположениях источника и приемника, кроме как на одной оптической оси. Напротив, обсуждаемая далее во второй главе теория переноса излучения, в частности ее диффузионное приближение, преодолевает эти ограничения теории рассеяния волн. Однако для ее применения к описанию системы плотно упакованных тканей необходимо учитывать эффекты взаимодействия частиц и распределения их по размерам. Например, при расчетах в рамках диффузионной теории была скорректирована зависимость (1.37) коэффициента рассеяния µs от гематокрита для тонкого слоя крови [247]:

Соотношения (1.37)–(1.39) используются при описании оптических параметров крови в зависимости от гематокрита, и, наоборот, по измерениям оптических характеристик могут быть оценены значения гематокрита крови. На рис. 1.18–1.21 представлены экспериментальные данные для относительного коэффициента поглощения µa(Hct)/µa(8,6 %), коэффициента рассеяния µs(Hct)/µs(8,6 %), параметра анизотропии рассеяния g(Hct)/g(8,6 %) и приведенного коэффициента рассеяния µ′s(Hct)/µ′s(8,6 %) суспензии эритроцитов крови в физиологическом растворе в зависимости от гематокрита Hct, усредненные для двух диапазонов длин волн 250–600 нм и 600–1100 нм и двух отдельных длин волн 250 и 415 нм [248].

Рис. 1.18. Значения относительного коэффициента поглощения µa(Hct)/µa(Hct = 8,6 %) суспензии эритроцитов крови в физиологическом растворе в зависимости от гематокрита Hct, усредненные для двух диапазонов длин волн 250–600 нм (линейная аппроксимация с коэффициентом корреляции R2 = 0,9978) и 600–1100 нм (линейная аппроксимация с коэффициентом корреляции R2 = 0,9996) [248]

Значения оптических параметров для гематокрита 8,6 % и концентрации гемоглобина 2,87 г/л для некоторых длин волн, близких к лазерным линиям, представлены в табл. 1.8. На основании экспериментальных данных, представленных на рис. 1.18–1.21, были получены следующие аппроксимирующие функции для расчета зависимостей оптических параметров от гематокрита и длины волны, при этом в качестве исходных берутся значения из табл. 1.8 или из более полной таблицы

Отметим, что теория Тверски [244] (см. формулу (1.37) и рис. 1.19) не в полной мере описывает зависимость коэффициента рассеяния от гематокрита. По-видимо- му, необходим поиск более совершенных моделей, учитывающих физиологическое состояние эритроцитов, чтобы полнее описать эмпирические формулы (1.40).

1.6.Флуоресценция

1.6.1.Однофотонная флуоресценция. Одним из фундаментальных явлений, возникающих при взаимодействии света с биологическими объектами, является их люминесценция — широкополосное свечение на более длинных волнах по сравнению с длиной волны возбуждения. Люминесценцию можно разделить на флуоресценцию, соответствующую разрешенному оптическому переходу со сравнительно большим квантовым выходом и малым (наносекунды) временем жизни, а также фосфоресценцию, соответствующую «запрещенному» переходу с низким квантовым выходом и большим временем распада порядка нескольких микроили миллисекунд [249, 250].

Поглощение света связано с электронным переходом из основного состояния в возбужденное состояние молекулы вещества. В результате свет, проходящий через слой толщины d, ослабляется как [251]

где I(λ) — интенсивность прошедшего света, I0 — интенсивность падающего света, ελ — молярный коэффициент экстинкции, а cab — концентрация поглощающих молекул. В рассеивающих образцах коэффициенты поглощения µa и рассеяния µs (опущенный в уравнении (1.41)) суммируются, обусловливая последующее ослабление проходящего света (см. уравнение (1.1)).

Флуоресценция возникает после поглощения света и связана с электронным переходом из возбужденного состояния молекулы в основное состояние. Ее интенсивность дается выражением [251]

где ηF — квантовый выход флуоресценции, а Ω — телесный угол, в котором регистрируется изотропное излучение флуоресценции (угловая апертура приемника). В случае тонких образцов, например, клеточных монослоев или образцов биопсии толщиной несколько микрометров, выражение (1.42) может быть представлено в виде

Интенсивность флуоресценции пропорциональна концентрации и квантовому выходу флуоресценции поглощающих молекул. В рассеивающих средах длина пробега рассеянных и нерассеянных фотонов внутри образца различны, и выражения (1.42) и (1.43) требуют модификации с учетом эффектов многократного рассеяния. Однако в практически однородных тонких образцах линейная связь между IF, cab и ηF сохраняется.

Энергии электронных состояний молекулы являются сложными функциями межъядерных расстояний, обычно образующими «потенциальные ямы», как показано на рис. 1.22, а для основного (S0) и первого возбужденного (S1) состояний. Каждая «потенциальная яма» содержит большое число колебательных уровней энергии νi, каждый из которых расщеплен на многочисленные вращательные подуровни (не показанные на рис. 1.22, а). Электронный переход между энергетическими уровнями происходит по «вертикали», так как за короткое время такого перехода положение