Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

Интенсивно разрабатываются методы лазерной томографии биотканей, основанные на измерениях их пропускания (отражения) или флуоресценции под действием непрерывного, импульсного или модулированного по интенсивности лазерного излучения с различными длинами волн [1, 3, 12, 30–32, 41, 162]. Визуализация оптически неоднородных сильно рассеивающих и объемных биотканей требует использования эффективных методов регистрации рассеянного или переизлученного света, а также быстродействующих алгоритмов для получения томограмм в реальном масштабе времени.

Упругое рассеяние света (нефелометрия) является одним из эффективных методов макродиагностики и давно применяется в различных областях биологии и медицины. Применение лазеров, обладающих малой угловой расходимостью, высокой спектральной плотностью, легко управляемой поляризацией излучения, позволило существенно упростить измерения и повысить их надежность, тем самым расширив область применения метода в иммунологии, вирусологии и гематологии. В частности, лазерная нефелометрия используется для определения степени деформируемости эритроцитов при приложенных к ним сдвиговых напряжениях, функции распределения эритроцитов по размерам, оптических и геометрических параметров лимфоцитов, моноцитов, нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов в образцах белых кровяных клеток; для контроля протекания реакции антиген–антитело, содержания белков в крови и моче; для обнаружения бактерий в жидких средах; для изучения процессов споризации и прорастания бактерий [5, 12, 13, 24, 66, 81, 357, 360, 361, 382, 383]. Перспективно применение лазерной нефелометрии для контроля оптимальных условий программного размораживания органов, биологических тканей, клеток крови, костного мозга, микроорганизмов, сперматозоидов и т. д. [81, 359].

Спектроскопия упругого рассеяния, основанная на измерениях спектров отражения от верхних эпителиальных слоев биоткани, находит применение в ранней диагностике рака, поскольку дает информацию о морфологических изменениях на клеточном и субклеточном уровне, позволяя не прибегать к биопсии и введению специфических красителей [336, 384].

Поляризационная нефелометрия, основанная на анализе полной матрицы рассеяния биообъекта, перспективна для изучения макроструктуры различных биообъектов (формы и размеров отдельных частиц, характеристик распределения по размерам, оптических постоянных, статистических характеристик пространственного расположения частиц, наличия анизотропии и прочее) [5, 57, 165–170]. Знание макроструктуры биообъектов, в частности биотканей, дает возможность ранней диагностики некоторых заболеваний, связанных с изменениями макроструктуры (например, катаракты и глаукомы).

Другое не менее эффективное применение лазеров — лазерная спектроскопия квазиупругого рассеяния биообъектов [5, 82, 115, 176–178, 383, 385]. Она основана на регистрации обусловленных движением частиц временных изменений параметров рассеянного излучения, которые проявляются в автокорреляционной функции и соответственно в спектре флуктуаций интенсивности рассеянного поля. В зависимости от характера движения частиц происходит либо уширение спектра (движение типа равновесной диффузии, случайных миграций и пр.), либо смещение (направленное движение). Последнее называют доплеровским смещением. Обычно для биологических систем имеет место и уширение, и сдвиг. Уширение и сдвиг настолько малы по сравнению с оптической частотой ( νD/ν ≈ 10−7–10−14), что практически в спектроскопии квазиупругого рассеяния допускается использование только лазеров, да еще с низким уровнем амплитудных и частотных флуктуаций.

Для случая обратного рассеяния [5] νD = (2nv/λ) cos ϕ, где n — относительный показатель преломления рассеивающих частиц; v — скорость их движения; ϕ —

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 73

угол между направлениями лазерного пучка и движения рассеивателей. Например, для средней скорости кровотока v = 1 см/с и λ = 633 нм с учетом того, что для эритроцитов в плазме крови n = 1,05, частотный сдвиг νD составляет всего 32 кГц.

Различают гомодинные, основанные на регистрации самобиений различных спектральных компонентов рассеянного света, и гетеродинные, использующие опорные лазерные пучки, схемы лазерных спектрометров квазиупругого рассеяния. Последние чувствительны не только к движениям типа равновесной диффузии, но и к направленному движению рассеивателей (лазерные доплеровские анемометры). Измеряются спектр или автокорреляционная функция фототока приемника рассеянного излучения. Вид измерений определяет тип спектрометра, например фотон-корреляционный. Для обработки сигналов широко используют персональные компьютеры, реализующие быстрые цифровые методы спектрального и корреляционного анализа.

С помощью лазерных спектрометров квазиупругого рассеяния исследуют параметры трансляционной и вращательной диффузии макромолекул, надмолекулярных

иклеточных структур, вирусов, фагов, контроль коэффициента трансляционной диффузии и гидродинамического радиуса которых позволяет судить о характере процесса денатурации, степени агрегации, кинетике модификации и полимеризации, характере конформационных изменений, протекании иммунологических реакций и других показателях [5, 82]. Исследуются, например, процессы агрегации иммуноглобулина, кинетика полимеризации тубулина и самосборки микротрубочек in vitro, переход фибриногена в фибрин и агрегация фибрина. Разрабатываются методы диагностики катаракты, использующие специфику квазиупругого рассеяния на конгломератах высокомолекулярных белков, определяющих нарушение структуры и, соответственно, помутнение хрусталика. Так, для глаз человека найдено, что основные рассеиватели представляют собой монодисперсную фракцию частиц с размерами 0,5 мкм и полидисперсную — с размерами в диапазоне от 1 до 6 мкм [12, 19, 31, 176, 386]. Сочетание спектрометра с микроскопом позволяет регистрировать кинетику агрегации гемоглобина внутри эритроцитов крови больных серповидной анемией, движение протоплазмы внутри живых клеток, размерами порядка 10 мкм.

Измерение скорости направленного движения биообъектов с помощью лазерных доплеровских измерителей скорости (ЛДИС) является одним из эффективных способов диагностики в биологии и медицине [5, 383, 385]. В настоящее время достаточно хорошо развит метод так называемого электрофоретического светорассеяния, основанный на измерении подвижности заряженных светорассеивающих частиц в электрическом поле [5, 82]. Метод применяется для анализа состава форменных элементов и белков плазмы крови, популяций вирусов и бактерий; агрегации

иполимеризации белковых молекул; самосборки актиновых филаментов из глобулярных мономеров; анализа иммунологических реакций, проводимых при диагностике злокачественных опухолей, иммунодефицитного состояния, рассеянного склероза, ревматоидного артрита и др.

ЛДИС используют для изучения гемодинамики, что очень важно в медицинской диагностике. Измеряется средняя скорость кровотока, распределение скоростей по сечению сосуда, интенсивность турбулентных пульсаций и пр. С высокой точностью определяются параметры движения крови в тонких (менее 100 мкм) сосудах с прозрачными стенками, например сосудах сетчатки глаза. Для более крупных сосудов с непрозрачными стенками используют волоконно-оптические катетеры.

Перспективны для клинических исследований разнообразные лазерные измерители микроциркуляции крови в микрососудах приповерхностного слоя органов, основанные на бесконтактных измерениях рассеянного излучения движущимися в слое ткани эритроцитами [5, 12, 19, 31, 41, 103, 176, 387–391]. Разработаны и применяются в клинической практике фотон-корреляционные волоконно-оптические измерители

микроциркуляции крови: приборы, сочетающие измерение кровотока с оптической плетизмографией, компактные доплеровские системы на основе полупроводниковых лазеров.

Спектроскопия квазиупругого рассеяния является признанным средством при анализе подвижности живых клеток в суспензиях (например, сперматозоидов животных и человека, бактерий, снабженных флагеллами — жгутиками и др.), перспективна при изучении внутриклеточной подвижности: стационарных движений светорассеивающих частиц, составляющих протоплазму клеток (ядер, митохондрий

ит. д.) [5, 82, 392]. При исследованиях небольших клеток требуются уже лазерные доплеровские микроскопы, которые интенсивно разрабатываются в последние годы [5, 169, 383, 392].

Голография и интерферометрия являются мощными средствами диагностики вообще и биомедицинской в частности [5, 53, 175, 176, 388, 393–399]. Голографические методы позволяют получать трехмерные изображения биообъектов (например, изображение целого глаза или его отдельных частей), измерять размеры внутренних структур глаза с высоким разрешением, проводить локализацию внутренних инородных тел, опухолей, отеков, отслоек и др. Сочетание голографической регистрации изображений глазного дна с флуоресцентной ангиографией дает голографические изображения кровеносных сосудов диаметром до 10 мкм с контрастом 25 : 1. Разработаны голографические распознающие устройства, способные обеспечить параллельную обработку больших массивов экспериментальных данных, в том числе и при анализе больших популяций микроорганизмов или клеток.

Принципиально возможна реализация голографической топографии, заключающейся в картировании контуров биообъектов. Деформации биообъектов могут быть проанализированы в реальном масштабе времени с помощью голографической интерферометрии, что может оказать влияние на развитие многих разделов медицины: ортопедии, маммографии, офтальмологии, урологии и отологии. Большие потенциальные возможности имеют классическая интерферометрия при использовании лазерных источников (создание ретинометров — устройств для определения ретинальной остроты зрения, измерителей толщины роговицы и пр. [5]), метод оптики спеклов (для определения структуры и шероховатости некоторых биотканей [114, 175, 176, 181, 182, 400, 401]), а также исследования динамических спекл-струк- тур (при определении рефракции, хроматической аберрации, астигматизма и точки наилучшей аккомодации глаза [402], контроле динамики локального кровотока

илимфотока в сосудах [12, 13, 19, 31, 41, 175, 176, 391, 400, 403–406]) или пространственного распределения скорости кровотока в ткани [12, 13, 19, 31, 41, 391].

Разработаны лазерные биовиброметры, использующие принципы гомодинной и гетеродинной интерферометрии, включая спекл-интерферометрию; они применяются в биомедицинских исследованиях при изучении микровибраций органов внутреннего уха, регистрации пульсовых волн, случайных вращений глазного яблока, тремора мышечной ткани и пр. [175, 176, 407, 408].

Для неинвазивного мониторинга направленного или случайного движения крови в объемных биотканях интенсивно развивается метод диффузионно-волновой спектроскопии (ДВС), который отличается от метода квазиупругого рассеяния тем, что он применим к исследованию сред с многократным рассеянием, дает информацию о движении частиц на существенно меньших масштабах и позволяет оценивать рассеивающие свойства ткани [12, 13, 19, 31, 175–180, 409].

В основе лазерной терапии лежит управление биохимическими процессами с помощью света. Однофотонные фотобиохимические процессы лежат в основе терапии желтухи новорожденных, фототерапии или фотохимиотерапии различных заболеваний кожи [43–46, 83, 86, 205, 295–298] и фотодинамической терапии

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 75

(ФДТ) злокачественных опухолей и воспалительных заболеваний, а также подавления роста бактерий с использованием гематопорфирина, металлокомплексов порфиринов, фталоцианина, анионных красителей и других фотосенсибилизаторов [6, 41, 43–46, 54–56, 68, 83, 205, 208, 295, 299–308, 310]. В лазерной ФДТ широко применяется 5-аминолевулиновая кислота (ALA), которая при введении в организм индуцируют в нем генерацию в основном протопорфирина IX, который уже является эффективным фотосенсибилизатором. Этот метод имеет целый ряд преимуществ и интенсивно разрабатывается.

При наличии фотосенсибилизатора, накопленного в опухоли или других патологических фокусах, излучение лазера, который используется при терапии, возбуждает флуоресценцию молекул фотосенсибилизатора, которая служит для диагностики патологий и маркирования границ поражений, определения количества накопленного фотосенсибилизатора в ткани и дозиметрии лазерного излучения.

Для фотохимиотерапии ряда кожных заболеваний, включая псориаз, используют ПУФА-терапию, основанную на сенсибилизации кожи фурокумаринами (псорален)

иоблучении УФА-светом в диапазоне длин волн 320–400 нм [46, 83, 84, 297, 298]. Так называемая низкоинтенсивная лазерная терапия (НИЛТ) позволяет для ряда заболеваний получить терапевтический эффект и без введения экзогенных фотосенсибилизаторов [86, 304, 311–314]. Такая биостимуляция осуществляется в довольно узкой области длин волн, интенсивностей и доз облучения, а также длительностей

ичастот повторения импульсов [311, 312]. В литературе описаны многочисленные практические методики НИЛТ для лечения посттравматических, воспалительных

идегенеративно-дистрофических заболеваний. Также интенсивно обсуждаются проблемы и возможные механизмы НИЛТ [304, 311–314], включая молекулы — первичные акцепторы света, такие как цитохром-c-оксидаза, порфирины и флавины; митохондрии как органеллы, ответственные за ряд первичных эффектов действия света [324]; оксид азота как медиатор лазерного воздействия [313, 318, 321, 322].

Одним из действенных методов лазерной терапии является лазерная селективная гипертермия, которая перспективна для использования в терапии раковых опухолей. Длина волны и мощность излучения лазера определяются размерами опухоли

испектром поглощения патологической ткани. Во многих случаях условия облучения аналогичны таковым при фотодинамической терапии. В последнее время в качестве медиаторов селективного лазерного нагрева раковых опухолей используются красители, например индоцианин зеленый (полоса поглощения 790–800 нм) [286, 287], или золотые наночастицы, в частности нанооболочки, имеющие плазмонный резонанс в ИК-области спектра близи излучения диодного лазера 805–808 нм, где биоткань максимально прозрачна [283–285].

Более сильный локальный нагрев ткани под действием лазерного излучения приводит к ее коагуляции, что также используется для разрушения раковых опухолей — это так называемая лазерная межтканевая термотерапия (LITT) [2]. Такая терапия является минимально-инвазивной и может быть рассмотрена как один из видов лазерной хирургии. Для обеспечения минимального влияния высоких температур на окружающие ткани и предотвращения карбонизации и выпаривания коагулируемой ткани используют специальные волоконно-оптические аппликаторы с охлаждением

иразнообразные средства визуализации области лазерного воздействия (магниторезонансную томографию или ультразвуковую визуализацию). Основные области применений такой терапии — это опухоли мозга, печени, простаты, гинекологические заболевания, сосудистая система и пр. [2]. Как правило, используются достаточно мощные лазеры ближней ИК-области спектра — неодимовые (1,06 мкм и 1,3 мкм)

иполупроводниковые (0,8–0,9 мкм). К этой технологии очень близко примыкает лазерная технология по удалению «портвейновых пятен» (болезнь М. Горбачева), для

76 Гл. 1. Основы лазерной биомедицины

удаления которых используют лазеры, работающие в зелено-желтой области спектра [62, 69–71].

Наблюдается значительный интерес к косметическим применениям лазерных импульсных тепловых технологий абляционного (СО2-лазер, 10,6 мкм, или эрбиевый лазер, 2,79–2,94 мкм) и неабляционного (неодимовый лазер, 1,06 и 1,3 мкм) характера [36, 39, 148, 280, 410, 411]. Имеются определенные успехи при удалении волос и разглаживании морщин на лице. Главная идея, реализуемая при разглаживании морщин, заключается в выборе такой длины волны лазерного излучения и дозы облучения, когда селективно поражается папиллярная дерма и активизируются фибробласты за счет продолжительного процесса заживления раны, при этом в момент лазерного воздействия эпидермис должен быть защищен от перегрева, например за счет предварительного охлаждения поверхности кожи. При удалении волос возникают аналогичные проблемы, и режим лазерного облучения и охлаждения подбирается таким образом, чтобы эффективно воздействовать на волосяные фолликулы. Чаще всего используется излучение рубинового лазера (λ = 694 нм), хотя применяются и другие типы высокоэнергетических и более экономичных лазеров.

Современные представления о фотоэпиляции включают как тепловое, так и механическое действие света на волосяной фолликул, в результате, которого происходит либо задержка роста волоса или полное прекращение его роста. В первом случае достаточно разрушить клетки матрикса волосяного фолликула в фазе роста (анаген) в цикле развития волоса или коагулировать папиллярные кровеносные сосуды, которые питают волос, или разрушить часть внешнего эпителиального влагалища корня волоса. Во втором случае, для полного прекращения роста волос, необходимо разрушить стволовые клетки, которые расположены в области расширения фолликула на границе внешнего эпителиального влагалища корня волоса и соединительной ткани, или разрушить волосяной фолликул целиком на уровне дермы.

Фотосклеротерапия обеспечивает тепловое или механическое разрушение сосудистых структур при поглощении света кровью, находящейся в этих сосудах. Гемоглобин крови имеет значительное селективное поглощение в широком диапазоне длин волн, являясь одним из основных поглотителей в биотканях. При такой терапии закрытие сосуда происходит за счет денатурации сосудистой оболочки, вызываемой передачей тепла от нагреваемой лазерным излучением крови, что хорошо описывается в рамках расширенной теории селективного фототермолиза [148].

Следует отметить, что все виды лазерной термотерапии требуют тщательной дозиметрии лазерного излучения, надежных данных по оптическим и теплофизическим параметрам биотканей и применения средств управления этими параметрами (селективное просветление ткани, охлаждение и пр.).

Часто терапевтический эффект низкоинтенсивного лазерного света связывают с его когерентностью или высокой степенью поляризации. Однако при используемых малых интенсивностях скорость возбуждения молекул Wвоз оказывается в 1010 раз меньше, чем скорость релаксации возбужденных молекул в конденсированной среде (скорость потери когерентности), которая при нормальной температуре лежит в диапазоне 1011–1013 с−1. Таким образом, при взаимодействии с тканью полностью теряется временная когерентность лазерного излучения. Действительно, терапевтический эффект наблюдается и с нелазерными источниками света при облучении на ряде длин волн в диапазоне 400–850 нм, но лазеры в соответствии с перечисленными выше причинами оказываются более удобным инструментом. Тем не менее, остается невыясненным влияние спекл-структуры лазерных полей внутри биоткани на биостимулирующее действие лазерного излучения, что является проявлением когерентности света и принципиально отличает лазерное излучение от теплового. Учет поляризационных эффектов важен при облучении анизотропных биотканей.

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 77

Многофотонное возбуждение биомолекул можно обеспечить с помощью сверхкороткого лазерного импульса не очень большой энергии, но большой пиковой мощности. При этом для двухступенчатого возбуждения триплетных уровней достаточно импульсов наносекундной длительности, а для более короткоживущих синглетных уровней необходимы длительности в пикосекундном диапазоне. Использование двухквантового возбуждения высоколежащих электронных состояний биомолекул в растворах приводит к диссоциации и образованию радикалов молекул растворителя, т. е. вызывает такие же биохимические реакции, которые обычно наблюдаются в растворах при облучении ионизирующей радиацией. Принципиальное отличие двухквантового фотолиза от γ-радиолиза состоит в том, что молекулы растворителя в первом случае диссоциируют только вблизи молекул-хромофоров, которые поглощают лазерное излучение, а не во всем облучаемом объеме, как при γ-радиолизе [53]. Данный эффект может найти применение в лазерной терапии раковых опухолей, поскольку он обеспечивает образование радикалов воды, которые поражают раковые клетки, но не влияют на окружающие здоровые клетки, что обусловлено свойствами молекул сенсибилизатора.

Двухквантовые фотохимические реакции наблюдаются в биологических системах разного уровня организации (вирусы, дрожжи и клетки) и должны найти применение в генной инженерии. При исследованиях in vivo удается увидеть различные типы повреждений молекул нуклеиновых кислот (разрывы и сшивки), что позволяет изучать пространственную структуру и функции сложных биомолекул (белки, нуклеиновые кислоты). С помощью лазеров наносекундной длительности изучают также причины повреждения ДНК, составляющей комплекс с красителем. Считается, что механизм повреждения состоит в образовании в результате двухступенчатой ионизации реакционноспособных радикалов красителя, приводящих к необратимой химической модификации ДНК.

Двухквантовое возбуждение по сравнению с одноквантовым (за счет исключения синглет-триплетной конверсии (см. рис. 1.33, б) позволяет повысить эффективность фотохимической реакции. Переход от низкоинтенсивного возбуждения (меньше 1 Вт/см2) к высокоинтенсивному (109 Вт/см2) увеличивает квантовую эффективность фотомодификации порфирина в растворе в 100 раз. Подобные эксперименты с производными гематопорфирина при облучении азотным лазером показывают, что главным механизмом, ответственным за разрушение молекул, является двухступенчатое возбуждение, которое дает более сильный цитотоксический эффект, чем одноступенчатое.

Итак, многофотонное возбуждение биомолекул является основой эффективной нелинейной фототерапии, использующей короткие лазерные импульсы, способные производить значительные фотохимические эффекты при таких малых средних мощностях, когда тепловые эффекты отсутствуют.

Преимущества лазерной хирургии хорошо известны — бесконтактность, дающая абсолютную стерильность; селективность, позволяющая выбором длины волны облучения разрушать патологические ткани, не затрагивая окружающие здоровые; широкий диапазон интенсивностей и длительностей импульсов света, что дает возможность обеспечивать требуемое воздействие на биообъект: плавление (коагуляция) и выпаривание при сравнительно небольшом разогреве; гидродинамическое разрушение при локальном интенсивном импульсном нагреве (абляция); деструкцию прозрачных и пигментированных тканей короткими и сверхкороткими лазерными импульсами путем термоинной и многофотонной ионизации вещества (оптический пробой) [2, 7, 42–46, 60–62, 85, 205, 271–273, 412–420]. Области существования указанных процессов взаимодействия лазерного излучения с биотканями показаны на рис. 1.24 и 1.25. В частности, при постоянстве дозы облучения, удерживаемой

на определенном уровне (3 Дж/см2, рис. 1.25), оказывается возможным получение всего многообразия режимов фоторазрушения варьированием лишь длительности импульсов.

Отметим бескровность лазерных операций благодаря коагулирующему действию света, а также широкие возможности при микрохирургии тканей и клеток из-за высокой степени фокусировки пучка и порогового характера фоторазрушения.

Наиболее значительные достижения лазерная хирургия имеет в офтальмологии [52, 205, 271, 413–418]. Проводятся операции на стекловидном теле, фотокоагуляция сетчатки при лечении диабетической ретинопатии, приваривание отслаивающейся сетчатки, микрохирургия разрывов сетчатки, пробивка отверстий для обеспечения нормального функционирования Шлеммова канала при лечении глаукомы, фотокоагуляция радужной оболочки, удаление капсулы хрусталика и пр. Успех таких микрохирургических операций зависит от степени локальности лазерного воздействия. Хорошие результаты дает использование коротких и сверхкоротких мощных импульсов, поскольку возникающие в фокальном объеме нелинейные эффекты способствуют локальному образованию плазмы и разрушению ткани при возбуждении акустических ударных волн, окружающие ткани за время действия импульса не успевают сильно нагреться и поэтому не страдают.

Наибольшее распространение в микрохирургии глаза получили Аr-лазеры, используются также Кr-, Rb-лазеры, лазеры на красителях. Перспективными для некоторых офтальмологических операций являются АИГ:Nd-лазеры (λ = 1,06 мкм)

смодуляцией добротности и синхронизацией мод. В последние годы многие исследования направлены на реализацию лазерных операций на роговице с помощью УФ-эксимерных лазеров. Вообще эксимерные лазеры являются идеальными скальпелями биологических материалов с очень малым проникновением лазерного света в соседние здоровые ткани и возможностью тонкого послойного контроля за процессом абляции за время действия отдельного лазерного импульса, что связано

смалой глубиной проникновения (значительным коэффициентом поглощения, см. табл. 1.1) УФ-излучения для большинства биотканей. В идеале весь УФ-свет должен поглощаться в пределах одного клеточного слоя.

Лазерная УФ-абляция тканей может быть использована при лечении различных кератозов, однако в настоящее время усилия многих исследователей направлены на поиск оптимальных режимов абляции для проведения кератомоделирования с помощью низкоинтенсивного УФ-излучения для исправления нарушений рефракции глаза [413, 414, 416]. Современные рефракционные хирургические технологии, такие как LASIK (laser-assisted in situ keratomileusis — местное изменение рефракции роговицы удалением ее слоев с помощью лазера), становятся все более популярными для коррекции нарушений рефракционной способности глаза путем изменения формы поверхности роговицы глаза. Однако около 5 % пациентов имеют послеоперационные осложнения, выражающиеся в нежелательных оптических эффектах за счет рассеяния света на послеоперационных структурах, синдроме сухого глаза и некоторых проблемах с заживлением. Несмотря на большие успехи в исследованиях, широкое внедрение этих технологий пока сдерживается из-за отсутствия отдаленных данных по действию коротковолнового УФ-излучения на окружающие ткани, а также по перестройке структуры роговицы после ее заживления [416].

Имеются сведения об использовании ХеСl-эксимерного лазера с λ = 308 нм для абляционного разрушения костной ткани [419]. Оказалось, что толщина однократно удаляемого слоя ткани составляет 2–3 мкм, что открывает перспективы для проведения тонких операций в ортопедии и стоматологии.

Разработаны новые мощные и надежные полупроводниковые лазеры, а также высокоэффективные АИГ:Nd-лазеры с накачкой от полупроводниковых лазеров и пре-

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 79

образованием частоты (см. гл. 6), которые вытесняют дорогостоящие и сложные Аr-, Кr-лазеры и лазеры на красителях, используемые для коагуляции тканей [416].

В хирургии широко используются различные типы СО2-лазеров (λ = 10,6 мкм) [85, 205], в зависимости от вида операций применяют режим послойного испарения ткани (разрез) сфокусированным пучком (объемная плотность мощности в фокусе достигает нескольких сотен киловатт в см3) или режим коагуляции расфокусированным пучком (объемная плотность составляет несколько сотен ватт в см3). СО2-лазе- ры используются в хирургии желчных путей и пороков сердца, кожно-пластической хирургии, для операций на желудке и кишечнике, в нейрохирургии, онкологии, урологии и гинекологии, для лечения глубоких ожогов и пр.

Излучение АИГ:Nd-лазера с λ = 1,06 мкм имеет существенно большую глубину проникновения в ткань по сравнению с излучением СО2-лазера, хорошо пропускается волоконными световодами, поэтому используется в основном при операциях, когда требуется коагуляция больших кровеносных сосудов при сильных кровотечениях, разрушениях глубоколежащих опухолей, а также при операциях, требующих подачу излучения через эндоскоп [7, 420, 421]. Наиболее широкое применение АИГ:Nd-ла- зеры нашли в гастроэнтерологии, урологии, гинекологии, нейрохирургии и т. д. При использовании волоконных световодов применяют сапфировые наконечники, допускающие прикосновение к коагулируемой ткани, что существенно облегчает операцию.

Значительные возможности открываются у лазерной хирургии при использовании волоконных световодов, которые способны почти без потерь в видимой и ближней ИК-областях спектра передавать значительные мощности излучения, от нескольких до сотен ватт. Применение волоконно-оптических катетеров позволяет также реализовать лазерную ангиопластику — разрушение атеросклеротических бляшек в сосудах сердца и других крупных сосудах. Для испарения бляшек достаточно, например, в течение нескольких секунд облучать ее светом аргонового лазера мощностью 3–4 Вт, для известковой бляшки время увеличивается до 30–40 с. Показано, что для лазерной ангиопластики пригодны достаточно мощные лазеры, работающие как в непрерывном, так и в импульсном режимах, на длинах волн ИК, видимой и УФ-областей спектра [7, 61, 205, 272]. Лазеры используются в сочетании с различными катетерными системами, у которых на дистальном конце световода находятся разогреваемые лазерным излучением или наконечники, или микролинзы, или кварцевые и сапфировые колпачки [7, 61, 205].

Перспективными для склерозирования крупных сосудов являются диодные или волоконные лазеры, генерирующие излучение с длиной волны 0,94–0,97 мкм [421]. В этом диапазоне рассеяние достаточно мало, поэтому при чрескожной лазерной коагуляции можно обеспечить прогрев достаточно крупных сосудов по всему их сечению. С другой стороны, в этом диапазоне длин волн располагается локальный пик поглощения крови, позволяющий при эндовенозной лазерной коагуляции (ЭВЛК) осуществлять безопасный для окружающей здоровой ткани селективный фототермолиз. Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей — одно из наиболее часто встречаемых в повседневной медицинской практике патологических состояний, характеризующихся прогрессивным и часто осложненным течением. ЭВЛК относится к малоинвазивным методам лечения, поэтому эндовенозная лазерная облитерация (ЭВЛО) варикозно расширенных вен сопровождается хорошими клиническими и эстетическими результатами и позволяет избежать длительного лечения.

Даже небольшое увеличение коэффициента поглощения патологической биоткани, снижающее порог абляции, может приводить к повышению эффективности процедуры — увеличению селективности воздействия лазерного излучения на патологическую биоткань, росту скорости ее удаления [46]. Например, при абляции

артериальных бляшек излучением лазера на красителях диапазон эффективных длин волн (450–479 нм) определяется накапливающимися в них естественными каротиноидами. В бляшках также селективно накапливается тетрациклин, что ведет к повышению, примерно в 2 раза, эффективности абляции на длине волны 355 нм. Хорошо известный в медицине краситель ПГП, имеющий сильное поглощение в УФ-области спектра при обычных концентрациях, используемых в фотодинамической терапии рака, к сожалению, не дает нужной селективности воздействия УФ-излучения на бляшку. Также как и в случае абляции роговицы, широкое клиническое внедрение методики требует знания отдаленных последствий операции, полной реализации достоинств лазерной операции по сравнению с альтернативными методами.

В качестве перспективных для лазерной хирургии рассматриваются мощные лазеры, работающие на длинах волн вблизи максимума поглощения воды (минимальная глубина проникновения в ткань) — эрбиевые лазеры с длиной волны λ = 2,94 мкм. Разрабатываются эффективные импульсные лазерные системы на красителях, работающие в видимой области (450–700 нм) для разрушения камней желчного пузыря и почек [46, 69]. В этой области длин волн коэффициент поглощения камней оказывается выше, чем у окружающих тканей. Поглощение импульсов света вызывает акустические возмущения и последующую фрагментацию конкрементов. Имеются сообщения о том, что вызванные лазерным излучением несильные акустические возмущения в опухолях способствуют снижению скорости роста раковых клеток.

Достаточно мощные лазеры видимой и ближней ИК-областей спектра (Аr с λ = 488 нм, АИГ:Nd с λ = 1,06 и 1,3 мкм) применяются для сваривания сосудов и сращивания раневой поверхности мягких тканей [85, 205]. При нагревании лазерным излучением мембрана клеток ткани разрушается, а содержащийся в клетке раствор, изливаясь внутрь ткани, коагулирует под действием света и формирует достаточно прочные структуры за счет образования межмолекулярных связей. Для облегчения

иповышения качества лазерных операций созданы эффективные вспомогательные инструменты — компрессионные и растягивающие ткань зажимы, сшивающие аппараты [85]. Добавление красителей в область сваривания, например, индоцианина зеленого, сильно поглощающего излучение диодного лазера с длиной волны 805 нм, позволяет существенно повысить эффективность сваривания. Это так называемая холодная сварка, при которой окружающая ткань практически не нагревается [422]. Золотые наночастицы, внедренные в область сваривания, также позволяют существенно повысить эффективность сварки [423].

Для проведения тонких хирургических операций на роговице, например при трансплантации роговицы, используются фемтосекундные лазеры [422]. Типичный промышленный лазер на стекле с неодимом с длительностью импульсов 600–800 фс

ичастотой повторения 60 кГц обеспечивает контролируемое и воспроизводимое резание ткани с точностью до 5 мкм, что выгодно отличает лазерную технологию от обычных скальпелей.

Отметим, что во многих случаях в процессе лазерной хирургической операции ткань оказывается покрытой различными жидкостями (кровь, лимфа, растворы для ангиографии и пр.). Жидкости легко устраняются при так называемой открытой хирургии, однако в эндоскопии их наличие приводит к усложнению операции. Например, необходимо обеспечивать постоянное омывание оперируемого органа прозрачной для лазерного излучения жидкостью (водные растворы солей, искусственная кровь). Излучение АИГ:Nd-лазера с λ = 1,06 мкм хорошо пропускается кровью и в меньшей степени солевым раствором, поэтому он широко используется в эндоскопии для коагуляции биотканей без применения омывающих жидкостей. Излучение аргонового лазера (λ = 488 нм), напротив, сильно поглощается кровью и хорошо пропускается водными растворами солей. УФ-излучение эксимерных лазеров в значительной

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 81

мере поглощается кровью, растворами красителей, используемых для ангиографии,

исущественно меньше солевыми растворами (λ = 308 нм), поэтому для уменьшения требуемой энергии лазерного излучения необходимо использовать солевые растворы для удаления крови из зоны абляции. Однако такая процедура может давать хорошие результаты только в видимой и ближней ИК- и УФ-областях и бесполезна для глубокого УФ (λ < 200 нм) и дальнего ИК (λ > 3 мкм). При использовании лазеров,

работающих в дальнем ИК (например, СО- и СО2-лазеры) и глубоком УФ (некоторые типы эксимерных лазеров), хорошие результаты дает импульсное сфокусированное излучение с необходимой энергией пучка и высокой частотой следования импульсов для того, чтобы образовать за счет эффекта кавитации (испарения) свободную от биожидкости стационарную полость на пути лазерного пучка до биоткани [46].

Лазеры в сочетании с волоконно-оптическими эндоскопами начинают применяться в лапароскопических операциях, например при удалении желчного пузыря [7]. Глубина контролируемого рассечения ткани в таких операциях составляет доли миллиметра, поэтому необходимо использовать лазерное излучение со сравнительно малой глубиной проникновения в ткань. Допустимо также применение контактных волоконно-оптических скальпелей с сапфировыми или другими наконечниками, преобразующими излучение любого типа лазеров в тепло.

Значительные перспективы в биологии имеет лазерная микрохирургия живых клеток [424, 425]. Локальность воздействия может быть доведена до 0,01 мкм. Широкие пределы изменения длины волны лазерного излучения и длительности импульса позволяют реализовать любой из видов фоторазрушения, от теплового до многофотонного фотохимического, что дает новые возможности в микрохирургии хромосом, митотических органелл и цитоплазмы, имеет выход в генную инженерию, поскольку «лазерный скальпель» способен сделать субмикронное отверстие в стенке клетки (оптопорацию), через которое из окружающего раствора желаемый ген может проникнуть внутрь клетки.

Лазерная оптопорация клеток дает возможность осуществлять трансфекцию или инжекцию вещества в клетку. Исторически термин трансфекция означал введение в клетку любой молекулы, обычным образом не проникающей через мембрану клетки [424, 425]. В настоящее время различают трансфекцию как интернализацию

ипоследующие биологические эффекты нуклеиновых кислот, в то время как под термином оптическая инжекция подразумевают введение всех других молекул, обычно не проникающих лекарственных препаратов, флуорофоров, или даже антител. В настоящее время наиболее часто вводят именно нуклеиновые кислоты, такие как ДНК, информационная РНК (иРНК, мРНК) или небольшие олигонуклеотиды (как при исследовании интерференции РНК, иРНК).

Использование лазерного излучения для оптопорации имеет по сравнению с другими методами множество достоинств, к которым относятся чрезвычайная простота обеспечения стерильных условий, сохранение жизнеспособности клеток и возможность интеграции с другими оптическими технологиями, такими как конфокальная микроскопия, оптические ловушки (пинцеты), и микрожидкостными системами.

Различают две категории лазерной оптопорации — прицельную и неприцельную. В случае прицельной — лазерный пучок фокусируется на плазматическую мембрану клетки, в которой генерируется небольшое отверстие или пора и только эта клетка подвергается трансфекции или инжекции, остальные клетки остаются абсолютно не тронутыми. Реакция клетки на такую операцию обычно наблюдается в микроскопе светлого поля. Сама реакция зависит от времени экспозиции, типа лазерного источника, а иногда и от типа химического поглощающего свет агента, добавляемого в среду. Ниже определенного порога эффект отсутствует, сильно выше порога — имеют место морфологические изменения в клетке, включая увеличение гранулированности,