Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

щающий слой с другим показателем преломления может присутствовать на границах образца (окна кюветы) [905].

Термин «удвоение» в методике расчетов означает, что предполагаемые известными отражение и пропускание одного слоя для некоторого угла падения и выхода света из образца могут быть использованы для нахождения отражения и пропускания слоя вдвое большей толщины путем наложения друг на друга двух идентичных слоев

исложения вкладов в отражение и пропускание от каждого из слоев. Отражение

ипропускание слоя произвольной толщины рассчитывается последовательно, сначала для тонкого слоя с теми же оптическими характеристиками (однократное рассеяние), а затем путем последовательного удвоения толщины рассчитываются характеристики слоя желаемой толщины. Термин «добавление» означает распространение методики удвоения на разнородные слои, что позволяет моделировать многослойные биоткани или учитывать внутренние отражения за счет скачков показателя преломления [905].

Метод ИДУ был успешно использован Пралом при нахождении оптических параметров дермы кожи человека (см. [426, 476]).

Тем не менее, при определении оптических параметров биотканей необходимо учитывать реальную геометрию эксперимента, которая может быть достаточно сложной, структуру биоткани (многослойность, локальные макронеоднородности и т. п.), а также разнообразное угловое распределение пучка света (коллимированный, расходящийся, сфокусированный или точечный), его диаметр, точку ввода излучения

иугол падения. Это можно сделать только при использовании инверсного метода Монте-Карло (ИМК) [214, 426–429, 906, 910]. Так, в [426, 428, 429, 906] представлены близкие по решаемым задачам алгоритмы, предназначенные для определения

всех трех оптических параметров биоткани (µa, µs и g) на основе измерений in vitro полного пропускания, диффузного отражения и коллимированного пропускания (для оптически тонких образцов) с помощью спектрофотометра с интегрирующими сферами. В качестве начального приближения (для ускорения процедуры) была использована теория Кубелки–Мунка, авторы [426, 428] использовали четырехпотоковый вариант теории. Оба описываемых алгоритма учитывают боковые потери фотонов, существенные для достаточно толстых образцов.

Представленные в [476] экспериментальные данные, полученные Пралом для дермы кожи на λ = 633 нм (полное пропускание T = 0,43, полное отражение R = 0,43, коллимированное пропускание Tc = 0,038, толщина образца 0,36 мм, показатель преломления ткани n = 1,4) были использованы для апробирования алгоритма [426, 428]. Получены следующие данные: для рассмотренного выше метода ИДУ

— µa = 1,5 см−1, µs = 88,0 см−1, g = 0,43, а для метода ИМК — µa = 1,13 см−1, µs = 87,4 см−1, g = 0,38. Близкие результаты были получены и при обработке экспериментальных данных Прала методом конденсированного ИМК [427, 476]. Этот метод отличается своей экономичностью, так как основывается на использовании результатов моделирования для заданного альбедо при нахождении параметров для любого другого значения альбедо cреды, достаточно лишь сохранить число взаимодействий каждого фотона со средой.

Значения µa, µs и g для мозга человека, простаты собаки и печени свиньи на длинах волн 800 и 1064 нм, а также спектры µa, µs (350–1050 нм) для некоторых сильно рассеивающих тканей глаза, таких как склера, ретина, рассчитанные с помощью метода ИМК на основе измерений отражения и пропускания in vitro, представлены в [429, 906]. Отметим, что для стабильной работы алгоритма было необходимо генерировать 105–5 · 105 фотонов на каждую итерацию. Для получения заданной точности в определении оптических параметров, порядка 2 %, было необходимо обычно от двух до пяти итераций.

204 Гл. 3. Измерение и управление оптическими свойствами биотканей

Помимо использования метода конденсированного ИМК сокращения затрат компьютерного времени можно достичь применением графических решений обратной задачи на основе предварительного моделирования методом Монте-Карло [214].

Решение обратной задачи методом Монте-Карло может быть построено на основе других измерительных схем, не использующих интегрирующей сферы. Так, в [910] измерялись значения и полуширина распределения интенсивности прошедшего через биоткань излучения, а в [476] метод конденсированного ИМК применялся для обработки измерений in vivo отраженного от биоткани излучения, проведенных с помощью специального датчика, содержащего два светодиода (660 и 940 нм) и три пространственно разделенных фотодетектора. Следует отметить, что сравнительные исследования оптических параметров кожи человека при измерениях in vitro и in vivo показали, что коэффициент поглощения и редуцированный коэффициент рассеяния для измерений in vivo существенно меньше их значений, полученных на основе измерений in vitro, соответственно в 10 и 2 раза [476]. Согласно обсуждению в [476], такие расхождения для µa следует искать в малой чувствительности метода интегрирующих сфер к малым значениям поглощения на фоне значительного рассеяния (µa µs), а для µ′s — в сильной зависимости от изменения относительного показателя преломления рассеивателей и основного вещества ткани n, µ′s (n − 1)m, m > 2 [929].

Прямые измерения фазовой функции рассеяния p(ϑ) очень важны для выбора адекватной модели исследуемой биоткани, что в сочетании с методом двух интегрирующих сфер дает возможность получать полную и надежную информацию о коэффициентах поглощения и рассеяния [930]. Обычно фазовая функция рассеяния определяется на основе гониофотометрических измерений для сравнительно тонких образцов биотканей [70, 89, 201, 204, 426, 471, 473–476, 913, 924–926, 930, 931]. Измеренная индикатриса рассеяния (с учетом геометрии образца и экспериментальной установки) аппроксимируется либо функцией Хеньи–Гринштейна (ХГ) (2.5) [64, 426, 913, 926, 930], либо набором функций ХГ, каждая из которых отражает тип рассеивателей, со своим удельным вкладом в индикатрису [913, 924]; в предельном случае двухкомпонентной модели cреды с крупными и мелкими, по сравнению

сдлиной волны, рассеивателями индикатриса представляется в виде анизотропной и изотропной частей [89, 476, 925]. Используются и другие аппроксимирующие функции, например полученные на основе приближения Рэлея–Ганса [476] или следующие из точной теории Ми [908, 909]. Такая аппроксимация, в частности, позволила найти зависимость фактора анизотропии рассеяния g дермы и эпидермиса от длины волны в диапазоне 300–1300 нм, которая в предположении 10 %-го вклада изотропного рассеяния хорошо совпадает, по крайней мере в диапазоне 300–630 нм,

сэмпирической формулой, представленной в [70]:

Детальные исследования индикатрис рассеяния последовательных отрывов эпидермиса нормальной кожи и кожи, предварительно обработанной кремами и растворами красителей, показали, что на длине волны 633 нм среднее по всем пяти слоям эпидермиса значение g = 0,89 ± 0,02, обработка кожи кремом с псораленом (используется при фототерапии псориаза и других кожных заболеваний) или вазелином уменьшает g соответственно до 0,86 ± 0,01 и 0,85 ± 0,01, в то же время 1 %-й метиленовый синий не изменяет значение параметра [426, 926].

Наряду с описанными выше традиционными для оптики рассеивающих сред методами исследований [245, 529, 570, 594, 659, 932], требующими зачастую длительных измерений и расчетов искомых параметров, в оптике биотканей важны также менее точные, но оперативные методы измерений, позволяющие делать оценки

оптических параметров биоткани в реальном масштабе времени. Мы уже упоминали о быстрых алгоритмах решения обратной задачи [73, 214, 427, 476, 905] и более простых измерительных схемах [476, 910]. В качестве еще одного примера простой

ибыстрой измерительной схемы следует отметить схему зондирования биоткани лазерным пучком, наклонно падающим на исследуемый объект [933, 934]. В этом случае простая аналитическая формула для линейного смещения центра максимума диффузного отражения x позволяет легко находить оптические параметры среды

иглубину проникновения света в биоткань,

где αi — угол падения лазерного пучка; n — средний показатель преломления рассеивающей среды (предполагается, что ткань находится в воздухе); µ′s µa.

Временные и фазовые методы измерения оптических параметров биотканей, несмотря на их относительную сложность, являются перспективными именно для измерений in vivo, поскольку допускают раздельное определение µa и µ′s в одном эксперименте при исследовании обратного отражения (рассеяния) от объекта [1–3, 12, 31, 64] (см. главу 2).

Результаты измерений in vitro и in vivo оптических параметров биотканей человека, выполненные различными методами, представлены в табл. 3.1. В дополнение к этим данным приведем значения параметров для некоторых биотканей, измеренные в широком диапазоне длин волн и выраженные в виде аппроксимирующих формул.

Кожа европейца (n = 21); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавления–удвоения (ИДУ); образцы — цельная кожа толщиной 1–6 мм, менее 24 ч после смерти, хранение при 20 ◦C в физиологическом растворе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 400–2000 нм [917]:

µ′s = 1,1 · 1012λ−4 + 73,7λ−0,22 [λ, нм].

Подкожная жировая клетчатка человека (n = 6); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавления–удвоения (ИДУ); образцы — срезы ткани толщиной 1–3 мм, менее 6 ч после хирургической операции, хранение при 20 ◦C в физиологическом растворе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 600–1500 нм [917]:

µ′s = 1,05 · 103λ−0,68 [λ, нм].

Склера глаза человека (n = 10); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавления–удвоения (ИДУ); образцы склеры хранились короткое время при 20 ◦C в физиологическом растворе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 370–1800 нм [922]:

µ′s = 2,411 · 105λ−1,325 [λ, нм].

Кость черепа человека (n = 10); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавления–удвоения (ИДУ); измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 800–2000 нм [919]:

µ′s = 1533,02λ−0,65 [λ, нм].

Твердая мозговая оболочка человека (n = 10); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавления–удвоения (ИДУ); образцы ткани хранились короткое время при 20 ◦C в физиологическом рас-

творе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 400–700 нм

[916]:

µ′s = 2,887 · 104λ−1,164 [λ, нм].

Белое вещество мозга человека (n = 7); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный Монте-Карло (ИМК); данные с графиков работы [914], аппроксимация представлена в работе [911]:

µs = 1,67 · 106λ−1,375 + 702,8λ−0,192 [λ, нм] (700–1100 нм);

g = 0,8 + 0,099(1 − exp(−(λ − 484,7)/216,18)) [λ, нм] (360–1100 нм).

Коагулированное белое вещество мозга человека (n = 7); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный Мон- те-Карло (ИМК); данные с графиков работы [914], аппроксимация представлена в работе [911]:

µs = 1,92 · 106λ−1,434 + 846,94λ−0,168 [λ, нм] (600–1100 нм);

g = 0,859 + 0,082(1 − exp(−(λ − 468,2)/200,3)) [λ, нм] (360–1100 нм).

Слизистая оболочка гайморовой пазухи человека (n = 15); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный добавле- ния–удвоения (ИДУ); образцы ткани хранились короткое время при 20 ◦C в физиологическом растворе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 400–2000 нм [915]:

µ′s = 443742,6λ−1,62 [λ, нм].

Слизистая оболочка стенки желудка человека (n = 15); метод измерения — интегрирующие сферы (ИС), метод решения обратной задачи — инверсный Монте-Карло (ИМК); образцы ткани хранились короткое время при 20 ◦C в физиологическом растворе; измерения при комнатной температуре в спектральном диапазоне 400–2000 нм [920]:

µ′s = 1,027 · 1012λ−4 + 164,3λ−0,446 [λ, нм];

g = 0,498 + 0,319(1 − exp(−(λ − 533,7)/138,7)) [λ, нм].

Из (3.3) следует также необходимость независимых измерений как среднего показателя преломления биоткани (n), так и показателей преломления рассеивающих центров (ns) и базового вещества (n0), в котором они распределены, поскольку отношение ns/n0 ≡ m определяет величину коэффициента рассеяния. Например, в простейшей монодисперсной модели ткани как ансамбля невзаимодействующих рассеивающих диэлектрических шаров [929]

где a — радиус шара; ρ — объемная плотность шаров; m — относительный показатель преломления материала шара; λ — длина волны излучения.

Формула (3.4) справедлива для невзаимодействующих рассеивателей Ми при g > 0,9; 5 < 2πa/λ < 50; 1 < m < 1,1. Из (3.3) следует, что при изменении показателя преломления базового вещества всего на 5 % (n0 = 1,35 → 1,42) при показателе преломления рассеивающих центров ns = 1,47, µ′s уменьшается в 7 раз. В пределе выравнивания показателей преломления m = 1, µ′s → 0 (см. рис. 1.16). Представленные значения показателей преломления являются типичными для роговицы и склеры глаза животных и человека [12].

Измерение показателей преломления биотканей и отдельных ее компонентов является одной из актуальных задач оптики биотканей. Такие исследования ведутся сравнительно давно [204], однако нельзя сказать, что в литературе можно найти достаточно полную информацию даже о среднем значении показателя преломления отдельных биотканей n. Согласно данным [87], значения n для многих биотканей лежат в диапазоне 1,335–1,620 для видимого света например, для рогового слоя кожи n = 1,55, для эмали зуба 1,62, а для поверхности хрусталика — 1,386. Следует отметить, что результаты измерений n in vitro и in vivo могут существенно отличаться например, для брыжейки крысы измерения in vitro дают n = 1,52, а in vivo только 1,38 [204]. Это означает, что, согласно (3.4), рассеивающие свойства живой и препарированной ткани могут существенно различаться, причем увеличение среднего значения n препарированной ткани говорит о повышении показателя преломления базового вещества n0, при этом показатель преломления рассеивателей ns должен сохраняться прежним, следовательно коэффициент рассеяния при измерениях in vitro должен быть существенно ниже, чем при измерениях на живой ткани. Для многих биотканей оптические свойства, в том числе и показатель преломления, определяются содержащейся в биоткани водой. Значения показателя преломления воды в широком диапазоне длин волн 0,2–200 мкм представлены в [204] например, для λ = 0,2 мкм n = 1,396; λ = 0,5 мкм — 1,335; λ = 2,8 мкм — 1,142; λ = 3,5 мкм — 1,400; λ = 10 мкм — 1,218; λ = 200 мкм — 2,130.

Для отдельных частей клетки значения показателей преломления на λ = 900 нм могут быть оценены как следующие: среда вне клетки — n = 1,35, цитоплазма — n = 1,37, мембрана клетки — n = 1,46, ядро — n = 1,39, меланин — n = 1,7 [201].

Измерения показателя преломления некоторых сильно рассеивающих биотканей на λ = 633 нм с помощью волоконно-оптического рефрактометра были проведены авторами [935]. Согласно этой работе, наибольшее значение n из исследованных тканей имеет жировая ткань (1,455), наименьшее — ткань легких (1,380) и печень (1,368), а среднее — кровь и селезенка (1,400), мышечная ткань (1,410) и почки (1,418). Оказалось, что гомогенизация ткани мало влияет на результаты измерений (изменения не превышают ошибки измерений, равной 0,006), коагулированная ткань имеет более высокий показатель преломления, чем нативная (например, для яичного белка n изменяется от 1,321 до 1,388 при коагуляции), имеется тенденция к снижению показателя преломления при увеличении длины волны света от 400 до 700 нм (например, для мышечной ткани быка в пределах 1,42–1,39), что характерно для большинства родственных материалов.

Значения показателя преломления некоторых биотканей, измеренные на отдельных длинах волн, представлены в табл. 3.2. Спектральные зависимости для показателя преломления окси- и дезоксигемоглобина в диапазоне 450–820 нм можно найти в работе [936].

Оригинальная методика измерения показателя преломления базового вещества дентина, основанная на трубчатой структуре дентина и проявлении этой тканью волноводных свойств, представлена в [937]: в белом свете n0 для недавно прорезавшихся зубов составил 1,553 ± 0,001.

Измерение временного сдвига сверхкороткого импульса, формируемого группой прошедших биоткань баллистических фотонов, по отношению к импульсу, прошедшему до детектора по воздуху, также позволяет определять показатель преломления биоткани. Например, для двух образцов нормальной и патологической (раковая опухоль) ткани груди показатели преломления оказались равными соответственно 1,403 и 1,431 на длине волны 625 нм [64].

Отметим, что существующие в слоистых биологических средах локальные изменения показателя преломления приводят к существенному изменению хода лучей

Т а б л и ц а 3.2. Экспериментальные значения показателя преломления некоторых биотканей человека и животных

света на коротких расстояниях, поскольку изменение n на 10 % на длине в 10 мкм соответствует радиусу кривизны эквивалентной оптической системы (эквивалентная локальная линза) порядка 0,1 мм [62, с.114].

3.2. Управление оптическими свойствами биотканей

Характер отражения, поглощения и рассеяния света биотканями и кровью можно достаточно эффективно изменять с помощью различных средств [12, 13, 22, 27, 31, 57, 85, 149, 152–154, 156, 222–224, 250, 430, 431, 792, 803, 838, 846–848, 850, 852, 853, 938–969]. Окрашивание (сенсибилизация) биологических материалов широко используется для изучения механизмов взаимодействия света с их отдельными компонентами, а также в практической медицине для диагностики и селективной фотодеструкции компонентов живой ткани. Диагностика и фотодинамическая терапия раковых опухолей, а также УФА-фотохимиотерапия псориаза и других пролиферативных заболеваний основана на этих принципах (см. главу 1).

Можно существенно (до 40 раз) увеличить пропускание мягких кровенаполненных тканей за счет их сдавливания [958]. Прокалывание и растягивание биоткани дает аналогичные эффекты [85]. «Просветление» живой ткани в этом случае связано с увеличением ее оптической однородности за счет уплотнения рассеивающих центров (например, коллагеновых волокон мышечной ткани) и удаления крови и межтканевой жидкости (воды) из сдавливаемой области, что ведет к увеличению показателя преломления базового вещества, который становится сравнимым с показателем преломления коллагеновых волокон, что в свою очередь уменьшает рассеяние [22, 959]. Конечно, определенную роль играет и изменение характера поглощения за счет ухода крови из области надавливания. Теоретическое описание эффектов «просветления» биотканей при компрессии можно найти в [22, 166, 959, 960]. Локальное сдавливание и растягивание биотканей давно и успешно используется в лазерной хирургии [85], а также в лазерной терапии при черезкожном облучении внутренних органов и крови [9, 10]. Следует однако помнить, что эффект просветления при надавливании некровенаполненных тканей, таких как склера глаза, имеет достаточно большую инерционность (несколько минут) за счет сравнительно медленной диффузии воды из области надавливания [961, 962].

Другим методом существенного уменьшения рассеяния является согласование показателей преломления рассеивающих центров и базового вещества за счет введения в ткань соответствующих препаратов, так называемых иммерсионных агентов. Качественно эти эффекты описываются соотношением (3.4). Экспериментальное наблюдение значительного просветления склеры глаза человека в видимой области спектра под действием верографина, тразографа, глюкозы и других препаратов описано в [10, 13, 22, 31, 34, 57, 222–224, 227, 430, 431, 846–854, 944, 955, 963–966] (см. также рис. 2.22 и 2.23). Физиологические концентрации глюкозы в биоткани незначительно изменяют ее коэффициент рассеяния, однако эти изменения оказываются вполне регистрируемыми с помощью современных оптических методов, из которых наиболее перспективен метод ОКТ [34, 564–566, 846–854, 955]. Аналогичное согласование преломляющих свойств многокомпонентных биотканей, обладающих поляризационной анизотропией формы (например, роговицы), приводит к уменьшению анизотропии ткани [5, 10, 22, 31].

Изменение характеристик рассеяния и пропускания суспензий α-кристаллинов, выделенных из хрусталиков глаза теленка, в зависимости от концентрации α-крис- таллинов связывается авторами [964] с осмотическими явлениями в таких суспензиях. Сильно влияние осмотических и диффузионных процессов при просветлении склеры растворами верографина, тразографа, глюкозы и полиэтиленгли-

коля [224]. Осмотические явления оказываются также важными при воздействии растворов сахаров, спиртов и электролитов на оптические свойства биологических материалов (клеток и тканей), что может затруднить определение степени насыщения гемоглобина кислородом или обнаружение таких поглотителей, как цитохромоксидаза, в ткани оптическими методами [967, 968].

Собственные физиологические изменения в тканях и клетках также приводят к изменениям оптических свойств, что является как раз мерой таких изменений. Например, близкая к параболической зависимость коэффициента рассеяния от величины гематокрита Hct тонких слоев крови представлена в [247] (см. соотношение (1.39)), в этой же работе даны оптические характеристики крови в зависимости от степени насыщения гемоглобина кислородом.

Экспериментальные данные по просветлению патологической кожи, а также по управлению спектрами отражения и пропускания кожи под действием воды, солнцезащитных кремов и медицинских препаратов представлены в [22, 90, 969]. Эти эффекты связаны с вымыванием или, наоборот, внедрением дополнительных рассеивателей или поглотителей в ткань, а также с иммерсией показателей преломления рассеивателей и базового вещества.

УФ-облучение кожи приводит к возникновению эритемы (покраснению), образованию меланина, а при сильных воздействиях — к отеку и избыточному росту ткани [83, 87, 250, 567, 568, 970–972]. Все эти фотобиологические эффекты существенно изменяют оптические свойства кожи, что необходимо учитывать при фототерапии.

Под действием УФ-света, в том числе лазерного излучения, происходит радиационное окрашивание хрусталика глаза человека [484] и агрегация кристаллинов, приводящая к существенному возрастанию рассеяния света и, соответственно, уменьшению пропускания хрусталика [973, 974]. Уменьшение температуры хрусталика (до 12◦С) может приводить к возникновению так называемой холодной катаракты, т. е. помутнению хрусталика (резкому увеличению коэффициента рассеяния за счет образования конгломератов протеинов) [386, 975]. Этот процесс обратим, и при увеличении температуры прозрачность хрусталика восстанавливается.

В процессе лазерной абляции или коагуляции биоткань меняет свои оптические свойства по сравнению с нормальной, что должно учитываться при лазерных хирургических вмешательствах [240, 976]. Например, при абляции ткани аорты эксимерным лазером (308 нм) оптическая плотность увеличивается в 2,3–3,7 раза по сравнению с нормальной тканью [240]. При коагуляции ткани аорты (100 ◦C, 300 с) ее коэффициент поглощения µa (в диапазоне длин волн 350–1750 нм) меняется незначительно (как правило, уменьшается не более чем на 21,4 %, 630 нм),

вто же время редуцированный коэффициент рассеяния µ′s увеличивается весьма значительно, до 148,6 % [240].

Детально исследования по оптическому просветлению биологических тканей, обсуждение физических механизмов просветления, методы и приложения представлены

вмонографиях [10, 22, 31, 854], а также в обзоре [977].