Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

где P — индуцированная поляризация среды, χ(n) — нелинейная восприимчивость n-го порядка, E — вектор напряженности электрического поля падающего света. Первый член описывает линейное поглощение и отражение света, второй — ГВГ, генерацию суммарных и разностных частот, а третий — двух- и трехфотонное поглощение и генерацию третьей гармоники.

В отличие от двухфотонной флуоресценции (см. подраздел 1.6.2) ГВГ не возникает в результате процесса поглощения. Вместо этого интенсивное поле лазера индуцирует нелинейную поляризацию второго порядка в ансамбле молекул, в результате чего получается когерентная волна точно на удвоенной частоте (или с половинной длиной волны) падающего света. Для ГВГ и спектральные, и временные характеристики зависят от лазерного источника: ширина полосы равна 1/√2 от ширины полосы возбуждающего лазера и, благодаря когерентности процесса, импульс ГВГ во времени развивается синхронно с возбуждающим импульсом.

Упрощенное выражение для интенсивности сигнала ГВГ имеет вид [723]

где χ(2) — нелинейная восприимчивость второго порядка материала ткани или клетки, E(ω) и τp — энергия и длительность лазерного импульса соответственно. Сигнал квадратичен по пиковой мощности, и поскольку ГВГ — мгновенный процесс, сигнал генерируется только на протяжении лазерного импульса. Макроскопическое значение χ(2) выражается через молекулярную гиперполяризуемость β как

где ρM — плотность числа молекул, а угловые скобки означают усреднение по ориентациям. Поскольку hβi обнуляется для изотропного распределения дипольных моментов, то соотношение (2.125) отлично от нуля только в случае отсутствия центра симметрии в среде. Как следует из (2.124) и (2.125), сигнал ГВГ зависит от квадрата плотности числа молекул.

Одна из последних разработанных схем ГВГ-визуализации представлена на рис. 2.50. Она существенно отличается от известных схем возможностью возбуждения ГВГ-сигнала в произвольной точке по выбору оператора, тем самым возможностью осуществлять оптический мониторинг локальных быстропротекающих процессов, связанных с изменениями мембранных потенциалов, одновременно с наблюдениями в пределах большого поля зрения микроскопа. Система построена на базе фемтосекундного волоконного лазера и электронно-управляемых акустооптических дефлекторах лазерного пучка. Такой ГВГ-микроскоп позволяет регистрировать метаболические процессы с характерными длительностями порядка 1 мс и получать сигналы потенциала активности нескольких нейронов одновременно в пределах широкого поля зрения (150 × 150 мкм) и с достаточно большой глубины срезов живого мозга.

2.7.8. Терагерцовая спектроскопия. Терагерцовый частотный диапазон, занимающий промежуточное положение между ИК и микроволновым диапазоном (1 ТГц → 1 пс → 300 мкм → 33 см−1 → 4,1 мэВ → 47,6◦К) частот, сравнительно мало исследован во всей шкале электромагнитных волн, от радиочастотного до рентгеновского диапазона (см. рис. 1.2). Эффективные источники излучения появились только в последние два десятилетия, в основном благодаря развитию лазеров со сверхкороткими импульсами. Возбуждаемое лазерными импульсами терагерцовое (ТГ) излучение является перспективным для применений в биологии и медицине, поскольку: 1) многие колебательные переходы важных биомолекул находятся именно

в этом диапазоне; 2) неоднородности, характерные для биотканей и приводящие к сильному рассеянию электромагнитного излучения в видимой и ближней инфракрасной области, не дают значительного рассеяния; 3) рефракция компонентов биотканей сильно различается между собой; 4) возбуждение сверхкороткими импульсами позволяет исследовать широкий диапазон частот за одно измерение

иобеспечивать высокое разрешение по времени [896–901]. Поэтому разработка спектроскопических методов исследования биологических тканей в ТГ-диапазоне частот, обеспечивающих детектирование и визуализацию метаболических и патологических процессов, вызывает в последние годы высокий интерес. Кроме того, ТГспектроскопия позволяет в одном измерении определять комплексный показатель преломления исследуемой среды, что важно для создания функционального ТГтомографа с высокой чувствительностью к изменению концентрации метаболитов

иточным маркированием границ патологического процесса.

Известно достаточно много методов генерации импульсного ТГ-излучения, в которых используют фотопроводящие антенны, поверхность полупроводника или нелинейные кристаллы в качестве преобразователя коротких импульсов лазерного излучения в ТГ-диапазон. В первых двух случаях генерация излучения обусловливается созданием нестационарной электронно-дырочной фотопроводимости полупроводника под действием импульсов света и всплеском фототока под действием внешнего или внутреннего электрического поля [898]. В последнем случае происходит генерация разностной частоты (оптическое выпрямление) в нелинейном кристалле [899]. Детектирование ТГ импульса (ТГИ) производится в аналогичной фотопроводящей антенне или на основе электрооптического эффекта в нелинейном кристалле [899]. Поле ТГИ наводит двулучепреломление в кристалле, при этом, изменение поляризации пробного лазерного импульса пропорционально амплитуде поля ТГИ в данный момент времени. В эксперименте измеряется разница в мощности ортогональных компонент поляризации пробного лазерного импульса либо ток, наведенный в антенне в зависимости от временной задержки между ТГ и пробным оптическим импульсом. Чувствительность детектора, так же как и эффективность генератора ТГИ, определяется параметрами фазового синхронизма, величиной нелинейной восприимчивости, длиной кристалла и длительностью лазерного импульса. При замене полупроводниковых устройств на нелинейно-оптические диапазон оптимальной работы спектрометра (0,5 ± 0,45 ТГц) сдвигается в высокочастотную область (2 ± 1,5 ТГц).

Одна из схем ТГ импульсного спектрометра представлена на рис. 2.51 [900]. Тип детектора и генератора ТГИ выбирались в зависимости от характера поглощения образца и интересующего диапазона частот [901]. Например, для измерений в диапазоне 2,5–3,5 ТГц использовалось излучение лазера на длине волны λ = 790 нм

сдлительностью импульса τ = 90 фс, а в качестве генератора и детектора, соответственно, поверхность полупроводника, выращенная при низкой температуре LT-GaAs, и электро-оптический детектор на основе кристалла ZnTe h110i толщиной 0,3 мм. С помощью преобразования Фурье из измеренного временного профиля ТГИ вычисляется комплексный спектр, содержащий информацию о показателях преломления и поглощения среды, через которую прошел ТГИ. Например, в работе [897] использовалась временная выборка из 1024 точек, длительностью 50 пс, со временем накопления сигнала в каждой точке 300 мс. Это позволяло проводить измерения

ссоотношением сигнал/шум больше 102 для частот в спектральном диапазоне от 0,3 до 2,5 ТГц и со спектральным разрешением порядка 10 ГГц. Лазерные (и ТГ)

импульсы следуют с интервалом 12 нс, при этом энергия ТГИ, который зондирует биологическую ткань, составляет порядка 10−13 Дж; такая малая энергия импульса не должна оказывать воздействия на ткань. Даже в случае резонансного поглощения малая доля спектральных компонент импульса поглощается в образце.

а частотная зависимость показателя преломления n′(ω) рассчитывается из соотношения

В более строгом приближении необходимо учитывать переотражения на гранях образца — моды Фабри-Перо [900], это важно в случае большого показателя преломления и тонких пластинок исследуемых образцов, например при измерении спектров срезов зубов и спектров прессованных таблеток сахаров и других биологически важных веществ.

Для анализа характеристических линий поглощения веществ, содержащихся в биотканях или биожидкостях, можно привлечь простую модель для диэлектрической проницаемости в виде суммы лоренцевских осцилляторов [897]:

где ωj , γj , fj — суть собственные частоты, коэффициенты затухания и силы осцилляторов соответственно, ε0 — диэлектрическая проницаемость вещества на низких частотах, j — номер резонанса в выбранном диапазоне частот.

Для ряда объектов спектроскопия пропускания плохо применима из-за сильного поглощения (например, ткани содержащие воду) или из-за больших размеров объекта (in vivo). В таком случае обычно используют спектроскопию отражения, когда

ющей показателя преломления.

При исследовании биотканей важна глубина зондирования и учет слоистости среды. Соотношение (2.134) позволяет получить информацию только о границе раздела (эффективная глубина, где формируется отраженный сигнал, — десятки микрон). Однако при исследовании слоистых тканей, таких как кожа, например, при толщинах слоев порядка 100 мкм и более можно разделять отраженные от разных поверхностей импульсы во времени. Далее можно применять соотношение (2.134) для каждого слоя со своим коэффициентом отражения и учетом объемных параметров среды (слоя) между поверхностями, через которую дважды проходит излучение. В видимом диапазоне частот такая методика развита, например, для трехслойной модели кожи [902], которая вполне может быть адаптирована для терагерцового диапазона.

Для исследования мягких тканей или водных растворов можно использовать спектроскопию отражения в условиях полного внутреннего отражения (ПВО), которая использует именно нарушение условий ПВО за счет взаимодействия с исследуемым веществом, поэтому метод называется «нарушенное ПВО» или НПВО.

186 Гл. 2. Распространение света в биологических тканях

В такой схеме можно обеспечить зондирование по глубине за счет изменения проникновения поля в вещество. Для реализации метода НПВО можно использовать

вом диапазоне составляет 3,42, дисперсия и поглощение практически отсутствуют. Данная призма помещается в параллельный пучок терагерцового излучения, при этом она не меняет направления пучка. В качестве опорного сигнала используется отражение от чистого основания призмы, а в качестве измерительного — сигнал, полученный, когда исследуемый объект плотно соприкасается с основанием призмы. Основное преимущество метода НПВО перед отражательной спектроскопией заключается в простоте измерения опорного спектра (без вещества), кроме того амплитуда коэффициента отражения близка к единице. Основная сложность метода НПВО — это необходимость решения проблемы оптического контакта при исследовании твердых образцов, поскольку наличие прослойки воздуха всего в 10 мкм уже критично. Формулы Френеля, описывающие спектр отражения, остаются применимыми и для случая НПВО, только нужно учесть показатель преломления материала призмы nпр, и заменить n на n/nпр в формуле (2.134).

На рис. 2.52 показаны спектры отражения кожи человека, снятые in vivo методом НПВО. Поскольку высокая чувствительность метода обеспечивается в поверхностном слое ткани до 10 мкм, то кожа зондируется только на глубину рогового слоя. В этом слое содержание воды минимально и равно 15 % (вес/вес), а основное содержание составляют белки (70 %) и липиды (15 %) [189], поэтому спектр отражения кожи существенно отличается от спектра отражения воды.

Рис. 2.52. Терагерцовые спектры для амплитуды и фазы коэффициента отражения кожи руки волонтера (мужчина, 32 года, белый, ладонь у основания большого пальца), измеренные методом НПВО [897]

Отметим хорошую прозрачность жиров, слабовыраженную дисперсию и характерные особенности в спектре поглощения в районе 2–2,5 ТГц. Отсюда следует, что с помощью импульсной ТГ-спектроскопии, по задержке ТГ-импульсов, отраженных от границ слоя, по-видимому, можно будет измерять толщину жирового слоя [897]. Исследования ряда биологических тканей (рис. 2.53) показали высокое и сравнимое между собой поглощение, но довольно значительное различие в показателе преломления в исследуемом диапазоне частот. Существенная дифференциация по

показателю преломления различных тканей дает возможность измерять амплитуды импульсов отраженных от границ различных слоев, что важно как для идентификации сигналов, несущих спектроскопическую информацию, так и для построения томографических схем.

Мониторинг патологических изменений тканей зуба можно провести с помощью ТГ-спектроскопии. В качестве примера на рис. 2.54 приведены спектры поглощения и показателя преломления различных участков зуба образцов человека, рассчитанные на основе измерений спектров пропускания с использованием спектрометра, представленного на рис. 2.51. Усредненный (по измеряемым частотам) показатель преломления практически одинаков (n = 2,4) для всех участков дентина и существенно отличается для эмали (n = 3,2). При этом дисперсия показателя преломления [900] имеет небольшие отличия в разных областях зуба. Спектр поглощения может быть аппроксимирован квадратичной зависимостью α(f ) = A + B1 · f + B2 · f 2 (в диапазоне 0,2–2,5 ТГц). Усредненные величины коэффициентов A, B1, B2 соответственно равны 13, −21 и 36, если f измеряется в ТГц, а α — в см−1. Показатель преломления для многих приложений можно считать постоянным.

Г л а в а 3

ИЗМЕРЕНИЕ И УПРАВЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ БИОТКАНЕЙ

3.1. Методы измерения оптических параметров биотканей

Существует много разнообразных методов определения оптических параметров биотканей [1–3, 12, 13, 30–32, 73, 250, 682, 903–937]. Эти методы можно разделить на два больших класса: прямые и косвенные. К прямым методам относятся методы, в основе которых лежат базовые понятия и определения, например закон Бугера–Бера (см. (1.1)), фазовая функция однократного рассеяния (см. (2.5)) для тонких образцов или эффективная глубина проникновения света для объемных сред. Измеряемыми параметрами являются коллимированное пропускание и индикатриса рассеяния для тонких образцов или освещенность внутри объемной среды. Достоинства этих методов заключаются в чрезвычайной простоте аналитических выражений, используемых при обработке данных: соответственно формулы (1.1) и (2.5) при нахождении коэффициента экстинкции и фактора анизотропии рассеяния или формулы (2.20) и (2.21) при нахождении диффузионной длины свободного пробега фотона. Недостатки прямых методов связаны с необходимостью строгого выполнения условий эксперимента, соответствующих модели: однократности рассеяния для тонких образцов, исключения влияния поляризации света и преломления света на гранях кюветы и т. п.; для объемных сред с многократным рассеянием детектор, регистрирующий освещенность (обычно волоконный световод с изотропно-рассеивающим шариком на торце), должен быть расположен вдали от источника света и границ среды.

Косвенные методы предполагают решение обратной задачи рассеяния на основе использования той или иной теоретической модели распространения света в среде. В свою очередь, косвенные методы делятся на итерационные и неитерационные. Неитерационные методы используют уравнения, в которых оптические свойства определяются через параметры, непосредственно связанные с измеряемыми величинами. Модели Кубелки–Мунка, трех-, четырех- и семипотоковые [1–3, 12, 31, 73, 79, 89, 245, 426, 450, 474] лежат в основе косвенных неитерационных методов. В косвенных итерационных методах оптические свойства выражаются неявно через измеряемые параметры. Величины, определяющие оптические свойства рассеивающей среды, перебираются до тех пор, пока расчетные значения отражения и пропускания не будут с заданной точностью совпадать с измеренными. Эти методы являются громоздкими, однако используемые оптические модели могут быть существенно более сложными, чем в случае неитерационных методов, примерами являются диффузионная теория [1–3, 12, 13, 31, 73, 245, 907], инверсный метод добавления–удвоения (adding–doubling) [905] или инверсный метод Монте-Карло [214, 426–429, 474, 906, 910, 911].

Для измерений оптических параметров биотканей (µa, µs и g) используют различные методы. Наибольшее распространение при измерениях параметров образцов биотканей in vitro имеет метод двух интегрирующих сфер в сочетании с измерениями коллимированного пропускания [90, 903–907, 911]. Схематически метод измерения представлен на рис. 3.1, он заключается в последовательном или одновременном

Рис. 3.2. Экспериментальные спектры полного пропускания (а) и диффузного отражения (б) отрывов эпидермиса человека и соответствующие спектральные зависимости коэффициентов поглощения (µa) и рассеяния (µs) (в), рассчитанные с использованием четырехпотоковой модели. Сплошные линии — кожа в норме, пунктирные линии — псориатическая кожа [426, 474]

погрешностей при подсчете значений оптических коэффициентов являются следующие причины, которые необходимо иметь в виду при сравнительном анализе значений оптических параметров, полученных различными авторами [73]:

—физиологическое состояние биологических образцов: уровень гидратации, гомогенность, видовая вариантность, замороженное — незамороженное состояние, in vivo — in vitro измерения, фиксированный — нефиксированный образец, гладкость его поверхности;

—геометрия облучения;

—согласованность — несогласованность показателя преломления на границах;

—ориентация регистрирующих волоконных световодов внутри образца по отношению к световоду — источнику;

—значения числовой апертуры регистрирующих световодов;

—угловое разрешение фотодетекторов;

—отделение рассеянного вперед излучения от нерассеянного;

—теория, используемая для решения обратной задачи.

Проиллюстрируем на примере определения оптических параметров эпидермиса кожи человека некоторые из обсуждаемых методов измерений. Исследования оптических параметров кожи представляют большой интерес с точки зрения совершенствования методов фото- и фотохимиотерапии кожных заболеваний, а также для развития методов диффузной оптической томографии и диафаноскопии. Для получения воспроизводимых результатов в дозиметрии и диагностике необходимо иметь надежные данные для всего набора оптических параметров кожи (µa, µs, g), для всех слоев кожи, в том числе и эпидермиса. Возможности получения надежных данных определяются не только выбранной методикой измерений, но также технологией приготовления образцов ткани, адекватных решаемой задаче. Технология изготовления образцов эпидермиса (вид биопсии ткани) на основе отрывов эпидермиса с использованием специальных медицинских клеев и стеклянных или кварцевых подложек разработана С. Р. Утцем [426, 474]. Эта технология позволяет получать высококачественные образцы верхних слоев эпидермиса толщиной 20–50 мкм, удобные для спектрофотометрических, нефелометрических, флуоресцентных и других