Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях

уже только молекулы 1O2 ответственны за каскад химических изменений в био- молекулах-мишенях в клетках или тканях, которые в свою очередь приводят к ряду биологических эффектов. Примерные интервалы времени для существования физических, химических и биологических процессов при ФДТ показаны на рис. 1.35.

Рис. 1.35. Порядок величин временных интервалов для последовательности событий в фотодинамической терапии: поглощение света, переходы внутри системы, передача энергии кислороду, первичная фотохимия, мгновенный биологический отклик, последующий биологический отклик [306]

Для максимальной эффективности фотодинамического эффекта фотосенсибилизатор должен обеспечивать высокий квантовый выход синглетного кислорода, близкий к 100 %. Поскольку переход T1 → 3O2 является разрешенным квантово-меха- ническим переходом (нет изменений спина), то, как правило, фотосенсибилизаторы имеют достаточно высокий квантовый выход молекул 1O2. Энергетический зазор между возбужденным и основным состоянием для молекул кислорода близок к 1 эВ, эта энергия и определяет предельное значение энергии фотона, которая требуется для запуска фотодинамической реакции типа II. На практике эффективная генерации 1O2 ограничивается немного более высокими значениями энергии, на уровне 1,5 эВ. Это соответствует длинам волн излучения, равным или короче 800 нм. На сегодняшний день наибольшая длина волны, используемая в клинических исследованиях ФДТ с применением фотосенсибилизатора бактериофеофорбида (TOOKAD), равна 763 нм [306].

Для реакции типа I химические изменения биомолекул связаны с их взаимодействием непосредственно с молекулами фотосенсибилизатора в возбужденных синглетном (S1) или триплетном (T1) состояниях без участия кислорода. Химические изменения для этой реакции существенно отличаются от тех, что имеют место для реакции типа II, хотя последующие биологические эффекты могут быть подобными. В оптимальном режиме ФДТ, когда используется эффективный фотосенсибилизатор и достаточно растворенного кислорода в ткани, реакция типа II является основной.

Различные возбужденные состояния, представленные на рис. 1.33, могут распадаться либо с излучением света видимого или ближнего ИК, либо без излучения (за счет передачи энергии внутри молекулы, S1 →Т1, на кислород T1 → 3O2, или столкновений с другими молекулами с выделением тепла, τS и τT). Переход S1 →S0 соответствует флуоресценции молекул фотосенсибилизатора, что является основой фотодинамической диагностики (ФДД). Чем выше квантовый выход 1O2, тем ниже

выход флуоресценции, однако квантовый выход на уровне нескольких процентов вполне достаточен для флуоресцентной спектроскопии и визуализации, несколько клинически используемых фотосенсибилизаторов попадают в эту категорию. Это оказывается полезным не только для флуоресцентной диагностики (маркирования границ опухоли на клеточном уровне), но также для определения количества накопленного фотосенсибилизатора в клетках перед проведением ФДТ и дозиметрии лазерного излучения путем мониторинга фотобличинга. Типичное время жизни флуоресценции для фотосенсибилизаторов ФДТ лежит в наносекундном диапазоне.

Излучательный переход молекул кислорода 1O2 → 3O2, т. е. переход синглетного кислорода обратно в основное (триплетное) состояние, соответствует длине волны 1270 нм. Поскольку это запрещенный переход, он имеет слабое излучение, которое может быть зарегистрировано специальными фотоумножителями ИК-диапазона, что является основой метода ФДТ-дозиметрии с использованием люминесценции синглетного кислорода (SOLD — singlet oxygen luminescence dosimetry) [306]. Время жизни 1O2 в воде около 3 мкс. В биологических средах, таких как клетки или ткань, время жизни может быть на порядок меньше. Из-за сильной реакционной способности 1O2 при взаимодействии с биомолекулами вероятность распада состояния с излучением люминесценции очень мала ( 10−6–10−8), поэтому метод технически трудно реализовать с достаточной точностью измерений [307, 308].

Таким образом, диффузионная длина, т. е. среднее расстояние, на которое может переместиться молекула 1O2 перед тем как она вступит в реакцию, очень мало: по некоторым оценкам на уровне 10 нм, что существенно меньше типичных размеров клеток. Следовательно, химическое поражение и последующие биологические эффекты, связанные с 1O2, существенно зависят от локализации молекул фотосенсибилизатора в момент оптического возбуждения. Это, в частности, подтверждается наблюдаемой корреляцией между локализацией многих фотосенсибилизаторов порфиринового ряда в мембранах митохондрий и апоптозом клеток («программируемая» смерть клеток), который ассоциируется с повреждениями митохондрий [305, 306].

Перспективным является применение 5-аминолевулиновой кислоты (ALA), введение которой продуцирует в организме гидрофобные и гидрофильные порфирины, в большей степени протопорфирин IX. Именно водорастворимые порфирины накапливаются через некоторое время в патологической ткани; например, при дозе ALA 200 мг кг−1 через час после введения продуцируемые водорастворимые порфирины обнаруживаются только в опухоли экспериментального животного, их не видно в коже и окружающей мышечной ткани [6]. Последнее принципиально отличает эту технологию от технологии прямого введения ПГП, так как значительное накопление ПГП в коже и окружающих тканях снижает эффективность фототерапии.

Требуемые для реализации фотодинамической терапии интенсивности света сравнительно невелики (меньше 1 Вт/см2, для многих случаев плотность мощности около 150 мВт/см2 оказывается достаточной при дозе 10–20 Дж/см2) и могут быть обеспечены обычными источниками света [6]. Тем не менее, использование лазеров оказывается очень полезным по следующим причинам. Во-первых, лазерное излучение легко доставляется с помощью волоконных световодов в труднодоступные места, включая внутренние органы. Во-вторых, высокая интенсивность лазерного излучения позволяет, по сравнению с тепловыми источниками, существенно снизить время облучения: именно поэтому лазеры дали новый толчок в развитии фотодинамической терапии. И в-третьих, с помощью лазеров необходимую дозу облучения можно обеспечить с помощью одного короткого импульса света, что важно в тех случаях, когда нужно исключить влияние света на последующие химические реакции.

64 Гл. 1. Основы лазерной биомедицины

При использовании новых типов фотосенсибилизаторов, таких как, например, фталоцианины, хорошими источниками облучения являются матрицы полупроводниковых лазеров или светодиодов с подходящей длиной волны (650–680 нм).

Для фотохимиотерапии ряда кожных заболеваний, включая псориаз, используют сенсибилизацию кожи фурокумаринами (псорален) и ее облучение УФА-светом в диапазоне длин волн 320–400 нм (так называемая ПУФА-терапия). Молекулярные механизмы фототоксических эффектов при ПУФА-терапии не в полной мере выяснены. Выделяют три основных канала для проявления фотобиологических эффектов — это фотодинамическая инактивация ферментов (реакция идет в присутствии кислорода (см. рис. 1.33), образование бирадикалов псоралена (различные биологические эффекты) и последующее присоединение тимина с образованием циклобутанового аддукта, которое в свою очередь приводит к подавлению синтеза ДНК. Терапевтический эффект при лечении псориаза связывают именно с фотоповреждением молекул ДНК за счет присоединения к ним фурокумаринов, что приводит к уменьшению пролиферативной активности клеток [46, 83, 84, 297, 298]. Согласно данным [83], индукция эритемы и меланиновой пигментации при УФА-облучении, что связывают с реакциями сенсибилизированного окисления, снижает эффективность ПУФА-те- рапии. Для реализации лазерной ПУФА-терапии хорошо подходят УФА-лазеры: азотный (λ = 337,1 нм), эксимерный ХеF (λ = 351 нм), аргоновый (λ = 351 нм) и гранатовый (третья гармоника, λ = 355 нм) [297].

Терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного излучения возможно

ибез экзогенных сенсибилизаторов [86, 304, 311–314]. Детальные исследования процессов стимулированного роста бактерий, синтеза белка в дрожжевых культурах и синтеза нуклеиновых кислот в клетках животных и человека, активности различных ферментов, выполненные Т. Кару, показали, что стимуляция осуществляется в довольно узкой области параметров облучения (доз, длительностей и частот повторения импульсов, длин волн и интенсивностей) [311, 312]. Проведенные исследования служат некоторым обоснованием многочисленных практических методик по низкоинтенсивной терапии посттравматических, воспалительных и дегенератив- но-дистрофических заболеваний. Лазерная терапия является эффективным фактором при лечении длительно не заживающих ран, язв, гнойных заболеваний и пр. Длины волн, наиболее часто применяемых в терапии лазеров (Не–Nе с λ = 632,8 нм, Не–Сd с λ = 441,6 нм, GаАs с λ = 830 нм), довольно хорошо совпадают с некоторыми длинами волн максимумов спектров действия, полученных на клеточном уровне: 404, 620, 680, 760 и 830 нм. Кроме того, в лазерной терапии применяются УФ-лазеры

(азотный с λ = 337,1 нм) и ИК-лазеры (СО2-лазеры с λ = 10,6 мкм). Лазерному облучению подвергаются как поверхность раны или язвы, отдельные органы и железы (чрескожно), так и кровь в сосудах (в том числе и чрескожно) [86, 311–317].

Вкачестве возможных эндогенных фоторецепторов лазерного излучения в диапазоне длин волн 400–1300 нм, ответственных за биологический эффект, рассматриваются содержащиеся в биообъектах молекулы кислорода (см. рис. 1.33, прямое возбуждение — пунктирная стрелка) [308, 315, 316]. Максимумы некоторых полос поглощения молекулярного кислорода лежат на длинах волн вблизи 638, 762, 1060

и1260 нм и соответствуют дважды запрещенным триплет-синглетным переходам. Однако в конденсированной среде, которой является любая биоткань, вероятность фотовозбуждения запрещенных переходов может быть достаточно высокой из-за ослабления квантового запрета. В литературе обсуждаются также другие механизмы биостимуляции: усиление под действием лазерного излучения кислородотранспортной функции крови за счет изменения сродства гемоглобина к кислороду (облучение на λ = 632,8 и 890 нм); изменение ультраструктуры ядрышек лимфоцитов крови человека и другие специфические действия на иммунокомпетентные клет-

повреждений после сердечных приступов, инсультов, повреждений нервной ткани и ретинальной токсичности.

Очевидно, что новые достижения молекулярной и клеточной биологии и их дальнейший прогресс позволят в полной мере понять механизмы НИЛТ [304, 306–308, 312–314, 319–323, 325].

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии

Методы диагностики можно разделить на два больших класса — микродиагностика на уровне атомов и молекул и макродиагностика на уровне клеток

иорганов. Микродиагностика использует все средства линейной и нелинейной атомной и молекулярной лазерной спектроскопии, макродиагностика — методы упругого

иквазиупругого рассеяния света, дифрактометрию, интерферометрию и голографию. Рассмотрим сначала некоторые из наиболее типичных методов микродиагностики. Микродиагностика лежит в основе так называемой молекулярной визуализации биологических тканей и клеток [95, 96, 135].

Традиционно спектральный анализ широко применяется в биологии для анализа следовых концентраций веществ при изучении метаболизма живых организмов

ив токсикологии. Однако спектральный анализ на основе нелазерных источников света позволяет в лучшем случае обеспечить детектирование сигнала от 1010 атомов или молекул одного сорта исследуемого объекта [53]. С использованием лазеров удается реализовать сверхчувствительные методы, позволяющие детектировать даже отдельные атомы или молекулы. Более того, высокое спектральное разрешение

иселективность лазерной спектроскопии дают возможность проводить атомный анализ непосредственно на реальных объектах, не прибегая к их предварительной подготовке (разложению на компоненты и соответствующему химическому анализу) или сводя подготовку к минимуму операций. Примерами являются метод прямой лазерной резонансной фотоионизации, успешно примененный к определению следовых концентраций алюминия в крови человека или его сочетание с традиционной

масс-спектроскопией, позволившее определить содержание триптофана в воде на уровне 10−14 г [53, 293]. Высокая чувствительность и селективность указанного метода дает универсальное средство для определения содержания различных элементов в органах человека и выявления их роли в метаболизме человеческого организма в нормальных и патологических случаях.

Анализ различий спектров поглощения и флуоресценции нормальных и патологических тканей человека всегда применялся в диагностике [309]. Использование лазерного излучения, которое может быть легко введено в человеческий организм с помощью световодов, значительно расширило возможности традиционных методов. Разработаны, например, высокочувствительные методики, основанные на регистрации спектров диффузного отражения стенок аорты и сравнительной мгновенной лазерной флуориметрии биоткани, и лазерная волоконно-оптическая аппаратура для диагностики атеросклеротических бляшек в сосудах человека [326].

Лазерно-флуоресцентная спектроскопия с применением фотосенсибилизаторов патологических тканей, таких как двунатриевый флуоресцеин, акридин оранжевый, акрифлавин, тетрациклин, производная гематопорфирина (ПГП), фталоцианин, индоцианин зеленый, толуидиновый синий, метиленовый синий, зеленые флуоресцирующие белки и другие, оказывается очень эффективной при ранней диагностике раковых заболеваний внутренних органов [6, 55, 56, 256–259, 309, 310, 327, 328]. Красители преимущественно накапливаются в опухолевых клетках, облучение кото-

68 Гл. 1. Основы лазерной биомедицины

Лазерное излучение может быть сфокусировано в пятно размером, сравнимым с длиной волны, что используется в целом ряде методик, реализующих микроспектральный анализ биологических объектов. Можно сфокусировать интенсивный лазерный пучок на поверхности биообъекта и испарить микрообъем веществ порядка 1 мкм3, затем провести масс-спектральный анализ пара и получить информацию об атомах и молекулах, содержащихся в микрообъеме. Рассмотренный принцип лежит в основе лазерной микроаналитической масс-спектрометрии и промышленных лазерных масс-анализаторов [294].

Используя низкоинтенсивное перестраиваемое и жестко сфокусированное излучение лазеров, изучают спектры флуоресценции микрообластей биообъекта (не разрушая его), что лежит в основе лазерной микрофлуориметрии отдельных живых клеток или органелл [5, 13, 41, 53, 251]. Пространственное разрешение равно 0,3–1 мкм, а временное — нескольким десяткам пикосекунд. Лазерная микрофлуориметрия используется, например, при спектроскопических исследованиях ПГП в культивируемых клетках почки свиньи и фибробластов человека, полезна при флуоресцентном картировании генов.

Световые импульсы пикосекундной и субпикосекундной длительности нашли самое широкое применение для изучения фотосинтеза, зрения и биохимических реакций (происходящих непосредственно после поглощения фотона) с участием гемоглобина, ДНК и других биологически важных молекул [294]. Важно, что именно такой путь позволяет получить прямую и надежную информацию о первичных фотопроцессах. Ультрабыстрые реакции являются характерными для биологии, причем для одного и того же объекта скорости фотофизических и фотохимических реакций могут занимать очень широкий диапазон, например, для гемоглобина характерные времена установления составляют 10−5–10−15 с. Подобные исследования требуют применения импульсных лазеров и новых методик спектроскопии, включая спектроскопию комбинационного рассеяния (КР), быстродействующие абсорбционные методы и флуоресцентную спектроскопию во временном масштабе от наносекунд до фемтосекунд.

Двухфотонная флуоресцентная микроскопия имеет целый ряд достоинств по сравнению с конфокальной микроскопией при функциональной визуализации живых биотканей, поскольку регистрируются не только баллистические фотоны, как в конфокальной микроскопии, но и диффузные фотоны, а высокое пространственное разрешение определяется сильной локализацией двухфотонного процесса [15, 18–20, 41, 260–269].

Лазерная спектроскопия КР позволяет изучать структуру белков и их компонентов, определяющих биохимическую активность молекул [5, 63, 107–109, 331–355]. Получены КР-спектры свободных нуклеиновых кислот и нуклеотидов, их комплексов с белками, тяжелыми металлами и другими элементами и соединениями, а также спектры растворов, содержащих природные вирусы и хромосомы. КР-спектроскопия позволяет различать измененные и нормальные лимфоциты; распознавать клетки на различных стадиях неоплазии шейки матки; детектировать глютамат в отдельных синаптосомах (конечных частях нейронов), подвешенных в оптическом поле (оптическая левитация, или оптическая ловушка, или оптический пинцет [37]); наблюдать трансляцию мРНК в эмбриональных стволовых клетках; детектировать биологические изменения, связанные с жизненным циклом клетки и ее смертью, ассоциацию липидных тел с фагосомами в лейкоцитах, изучать метастатические клетки и механизмы стресса клеток, а также анализировать отдельные клетки крови при диагностике церебрально-спинальной жидкости.

КР-спектроскопия используется также для картирования или получения изображений распределения различных компонентов клеток, таких как белки, ДНК и РНК,

1.8. Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 69

внутриклеточных липидных везикул, митохондрий и хромосом. Для некоторых компонентов получены и трехмерные изображения.

КР-спектроскопия перспективна для применений в различных областях клинических исследований, таких как мониторинг развития катаракты или процесса минерализации костной и зубной ткани, определение глюкозы в крови, неинвазивная диагностика злокачественных новообразований кожи, мониторинг гидратации кожи и действия лекарственных препаратов при местном применении [63, 102, 107–109, 340–352].

Возбуждение КР-спектров излучением видимого диапазона длин волн, в частности излучением Ar+-лазера с длинами волн 488 и 514,5 нм, позволило существенно снизить вероятность фотодеградации клеток по сравнению с использованием более коротковолнового излучения [339]. При возбуждении излучением 488 и 514,5 нм никакие морфологические изменения клеток не наблюдаются вплоть до мощности порядка 5 мВт. Переход к более длинным волнам обеспечивает жизнеспособность клеток при исследовании в течение более длительного времени и с более высокими интенсивностями. Например, излучение лазера на длине волны 785 нм мощностью до 115 мВт не приводит к деградации клеточных компонентов, по крайней мере в течение 1 ч исследований.

Для преодоления существенного недостатка КР-спектроскопии, связанного с малой величиной сигнала от большинства биологических молекул, используют резонансное КР (РКР) (Resonance Raman scattering (RRS)) или гигантское КР (ГКР) (Surface enhanced Raman scattering (SERS)). Метод РКР исследует колебания молекул хромофоров [344], в то время как ГКР основан на взаимодействиях ближнего поля с поверхностью шероховатых поверхностей нанометровой размерности [5, 339]. В обоих случаях необходима тщательная селекция длин волн возбуждения и соответствующая подготовка образца.

РКР обеспечивает высокую степень специфичности и селективности исследования, за счет того что длина волны возбуждения соответствует электронному переходу исследуемой молекулы, поэтому колебательные моды, ассоциированные с возбужденным состоянием, существенно усиливаются вплоть до 106 раз. Электронные переходы нуклеиновых кислот и белков без простатических групп лежат ниже 280 нм, белков с простатическими группами попадают в видимый диапазон. Усиление не распространяется на вибрационные колебания в основном электронном состоянии, поэтому РКР-спектр является менее сложным, что важно при интерпретации спектров от больших биологических молекул.

Используя технику оптического пинцета для удержания эритроцита во время снятия спектров, были получены РКР-спектры для окси- и дезоксигемоглобина для отдельного эритроцита in vivo при возбуждении лазерными линиями на длинах волн 488, 514,5, 568 и 632 нм (см. [339]). С помощью РКР был локализован и проанализирован малярийный пигмент гемозоин, найдено внутриклеточное распределение НАДФ·Н (НАДФ — никотинамидадениндинуклеотидфосфат) оксидазы субъединицы цитохрома b558 в случаях покоящихся и фагоцитирующих гранулоцитах. КР-сигнал от молекул цитохрома b558 резонансно и селективно усиливался в нейтрофильных гранулоцитах при возбуждении на длине волны 413 нм. Непосредственно в их естественной среде было найдено распределение нитрификаторов и anammox бактерий (anammox — это абривиатура: anaerobic ammonium oxidation — анаэробное окисление аммиака) при использовании РКР от эндогенных молекул цитохрома c. Важно, что спектры снимаются в течение времени, меньшего 1 с.

Гигантское КР (ГКР), реализуемое при лазерном облучении молекул, адсорбированных на поверхности металла с сильной шероховатостью нанометровой размерности и имеющее до 1015 раз большее сечение рассеяния, чем обычное КР, является

высокочувствительным методом регистрации тонких конформационных изменений в ДНК и позволяет детектировать единичные молекулы [5, 339].

Спектроскопия ГКР была использована при определении топографии хромофорного центра светочувствительного мембранного белка — бактериородопсина. Спектроскопия ГКР эффективна при исследованиях веществ очень низких концентраций.

Впервые возможность измерения ГКР-спектров от живых клеток без молекулярных зондов была продемонстрирована для клеток HT29, монослои этих клеток инкубировались с золотыми наночастицами [354]. Аналогичным способом исследовались отдельные клетки остеогенной саркомы, исследовались также бактерии на монослоях золотых наночастиц, нанесенных на субстрат из SiO2, и бактерии, покрытые шероховатой пленкой серебра (см. [339]).

Активная спектроскопия КР (АСКР), требующая для своей реализации двух перестраиваемых лазеров и, следовательно, обладающая высокой селективностью, использовалась для изучения таких сложных молекул, как β-каротин, витамин В12, металлопорфирины, для исследования механизма каталитической активности белкафермента α-химотрипсина [5].

Когерентное анти-стоксово КР (Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS)) также принадлежит к нелинейному КР, как и АСКР, и формально описывается

врамках четырехволнового смешения. Основные достоинства CARS по сравнению с обычным КР, кроме возможности усиления сигнала более чем на четыре порядка величины, является прямая генерация сигнала, узкая полоса и полное отсутствие влияния автофлуоресценции, поскольку сигнал генерируется на длинах волн короче, чем длина волны возбуждения. При сопряжении с лазерным сканирующим микроскопом CARS позволяет получать изображения с видеоскоростью. Метод был использован для визуализации липидных везикул в клетках HeLa, мембраны лизированных эритроцитов, роста капелек жира в живых адипоцитах, транспорта органелл

вживых клетках и запасания липидов в Nematode Caenorhabditis Elegans при регистрации CARS-сигнала на частоте 2845 см−1 (см. [339]). Было показано, что CARS-визуализация не является деструктивной для исследуемых клеток, если время измерения не превышает 5 мин.

Для исследований на субклеточном уровне интенсивно разрабатываются методы КР-микроскопии и соответствующее высокочувствительное спектральное оборудование [5, 63], в частности конфокальные КР-спектрометры для исследования отдельных клеток и хромосом при возбуждении в видимой области спектра [333]. Высокое пространственное разрешение (порядка 0,7 мкм) и высокую чувствительность имеет АСКР-микроспектрометр, который использовался при получении КР-изображений хромбактерий и различных типов бактерий, содержащих каротин [5]. Важно, что при АСКР- и CARS-исследованиях индивидуальные клетки надежно анализируются на фоне других клеток суспензии без необходимости их предварительного разделения. Стимулированное КР является основой другого метода нелинейной микроскопии для визуализации клеток и тканей без применения экзогенных зондов [355]. Этот метод

вбудущем может существенно дополнить КР- и CARS-микроскопию.

Значительные перспективы в микродиагностике биообъектов имеет абсорбционная фурье-спектроскопия, обеспечивающая широкий диапазон длин волн (УФ, видимый и ИК), быстрое сканирование спектра (до 50 сканирований в секунду), высокое разрешение (лучше 0,005 нм). Особое значение для биологии имеет фу- рье-спектроскопия КР при возбуждении в ИК-области спектра, главным достоинством которой является исключение сопутствующей флуоресценции [343]. Хорошей альтернативой, с точки зрения снижения уровня лазерной мощности и более быстрого получения изображений биотканей, является КР-спектроскопия с использованием современных ПЗС-камер (CCD) [345].

1.8.Примеры применения лазеров в биомедицинской диагностике, терапии и хирургии 71

Воснове биомедицинской макродиагностики лежит использование высокой монохроматичности и когерентности лазерного излучения, которые обеспечивают высокоточные измерения положения, скорости, малых перемещений и формы различных компонентов биологических объектов [5, 53]. Заметим, что большинство перечисленных ниже примеров не может быть реализовано с помощью тепловых источников света. Зачастую методы микро- и макродиагностики используются совместно для получения более ценной и объективной информации.

Одним из первых эффективных применений лазеров в биомедицине была пролетная цитометрия. Лазеры в этом методе используются для ускорения и повышения надежности процесса распознавания отдельных клеток млекопитающих за счет точных измерений их оптических свойств — поглощения, упругого рассеяния, состояния поляризации и флуоресценции. Суспензия клеток в виде очень тонкого и быстро движущегося ламинарного потока облучается лазерным излучением. Когда клетка нужного типа пересекает лазерный пучок, она создает соответствующий отклик в системе регистрации поглощения света, рассеяния или флуоресценции. В результате запускается другая система, которая выводит каплю, содержащую клетку, из общего потока. Одноволновые и многоволновые цитометры на основе аргонового, криптонового и гелий-неонового лазеров выпускаются промышленно и широко используются

висследованиях на культуре животных клеток и в диагностике заболеваний крови [37, 159, 356, 357].

Перспективна так называемая лазерная многопараметрическая цитометрия, при которой для дифференциации клеток (например, клеток крови) используют различные сочетания измеренных параметров упруго рассеянного или поглощенного света и флуоресценции, позволяющие одновременно учитывать геометрические (размеры, форму) и оптические характеристики клеток [357–361].

Впоследние годы интенсивно развивается цитометрия in vivo непосредственно

всосудах животного или человека [159, 356, 361–381]. Визуализация клеток крови или лимфы осуществляется с помощью быстродействующих цифровых видеокамер высокого разрешения (макродиагностика, информация о скорости, параметрах движения, форме и структуре отдельных клеток потока) и одновременно с помощью оптотермического (ОТ) или оптоакустического (ОА) эффектов при поглощении лазерного излучения различными компонентами клетки. По виду ОТили ОА-отклика клеточных структур различают нормальные и патологические клетки, а также микробы, вирусы, наночастицы и метастазирующие клетки, циркулирующие в кровеносных или лимфатических сосудах и узлах.

Лазерные технологии с успехом применяются в так называемой слайдовой цитометрии, которая использует малые количества биоптата при компьютерном количественном анализе изображений тонких срезов ткани [159, 356]. Слайдовая цитометрия использует множество различных цитометрических методов, основанных на различных технологических платформах, которые объединены тем, что клетки располагаются на слайде и проводится объективный количественный клеточный анализ. Инновации в технологии окраски образцов, детектировании отраженного света и флуоресценции, а также в изготовлении новых типов слайдов в виде линеек или матриц ячеек, каждая из которых предназначена для размещения малого количества ткани или отдельных клеток и может быть функциализирована, дают существенное повышение диагностической ценности метода. Использование квантовых точек, новых типов красителей, введение мультиспектральной визуализации, метода флуоресценции при резонансной передаче энергии (ФРПЭ) (fluorescence resonance energy transfer (FRET)) и многих других лазерных технологий существенно расширили возможности метода.