4.5. Гамма-глутамілтранспептидаза

Гамма-глутамілтранспептидаза (γ-глутамілтрансфераза, ГГТП, ГГТФ; КФ 2.3.2.2) каталізує перенесення гамма-глутамілового залишку з гамма-глутамілового пептиду на амінокислоту, інший пептид або інший субстрат. В організмі людини фермент бере участь у метаболізмі глутатіону – трипептиду, що складається із залишків глутамінової кислоти, цистеїну й гліцину, який виконує важливу роль у багатьох обмінних процесах.

ГГТП складається з одного поліпептидного ланцюга з молекулярною масою 90 кДа. Фермент має гідрофільний і гідрофобний фрагменти. Активний центр розміщений на гідрофільній ділянці поліпептидного ланцюга. Гідрофобною ділянкою фермент прикріплюється до мембрани.

Тест щодо визначення активності ГГТП останнім часом набуває все більшого значення в діагностиці захворювань печінки і гепатобіліарного тракту, оскільки відрізняється більшою чутливістю, ніж застосовувані з цією метою тести на АлАТ, АсАТ і ЛФ.

Найвища активність ГГТП виявлена в нирках –у 7000 разів вище, ніжусироватці крові. Вміст ГГТПусироватці крові здорової людини, як правило,незначний і пов’язаний з її екскрецією з клітин печінки, де активність ферменту в 200–500 разів вища. Крім того, ГГТП міститься в клітинах підшлункової залози (у 600 разів вище, ніжусироватці крові). Незначна активність ферменту реєструється в кишечнику, мозку, серці, селезінці, простатійскелетних м’язах. У клітині ГГТП локалізована в мембрані, лізосомах і цитоплазмі, причому мембранна локалізація ферменту характерна для клітиніз високою секреторною, екскреторноюабо реабсорбційноюздатністю.Це епітеліальні клітини, що вистилають жовчні шляхи і печінкові канальці, проксимальні канальці нефрону, клітини екзокринної тканини і вивідних проток підшлункової залози, ворсинчасті клітини тонкої кишки.

Серед біологічних рідин найвища активність ГГТП спостерігається в жовчі, сечі. У сироватці крові активність ферменту в 4–6 разів нижча, ніж у сечі. В еритроцитах фермент відсутній.

ГГТП представлена різними ізоферментами (методом диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі виявлено 5 фракцій ізоензимів ГГТП). Залежно від виду патології кількість ізоферментів у хворого може бути різною. Розділення ізоформ ГГТП методом електрофорезу на пластинках агарози дозволило виявити у здорових людей 4 ізоформи. Ізоформа ГГТП із найбільшою рухливістю (розміщується в зоні преальбуміну) названа ГГТП-1, смуги з меншою рухливістю, які за розподілом відповідають альбуміну, альфа-1-, альфа-2- і гамма-глобулінам, названі відповідно ГГТП-2, ГГТП-3 і ГГТП-4. ГГТП-2 (56-67 % загальної активності ГГТП у сироватці крові) має головним чином печінкове походження, основним джерелом ГГТП-3 (12–16 %) є підшлункова залоза, ГГТП-4 (12–18 %) має ниркове походження, а джерелом найменш активної ізоформи ГГТП-1 (0,4–3,0 %), яка не візуалізується при використанні менш чутливих методів, є кишечник.

Синтез ГГТП в організмі людини кодує один локус гена, тому гетерогенність ферменту пов’язана з його постсинтетичними змінами і залежить від ступеня глікозилювання, приєднання сіалових кислот та ін. Деякі модифікації ферменту можуть виявлятися в крові лише при певних захворюваннях. Так, зв’язування ГГТП із ліпопротеїном-Х (ЛП-Х) виявляється при холестазі, зміна сіалізації молекули характерна для гепатоцелюлярної карциноми; окремі ж модифікації є фізіологічними, наприклад, зв’язування ферменту з апопротеїнами.

ГГТП займає важливе місце в метаболізмі амінокислот. Комплекс біохімічних реакцій реабсорбції амінокислот із первинної сечі, профільтрованої через гломерулярну мембрану, називається глутаміловим циклом. Цей процес починається з дії ГГТП, яка розміщена на зовнішній поверхні клітинної мембрани і зв’язує амінокислоту первинної сечі з клітиною епітелію канальців за участі природного субстрату – глутатіону, утворюючи потрійний комплекс: амінокислота-ГГТП-глутатіон.

Активність ГГТП у сироватці крові підвищується при будь-яких патологіях печінки та жовчних шляхів, і, навпаки, при нормальній активності ферменту ймовірність захворювання печінки дуже мала. Залежно від механізму ушкодження печінки ступінь збільшення активності ГГТП у сироватці крові, як правило, помітно відрізняється, що дозволяє успішно використовувати цей маркер для диференціальної діагностики захворювань печінки.

Істотне збільшення активності ГГТП спостерігається при холестазі, й лише незначне – при ушкодженні паренхіми печінки (некрозі гепатоцитів). Оскільки в останньому випадку, як уже зазначалося раніше, різко зростає активність АлАТ, то визначення індексу АлАТ/ГГТП дозволяє з високою достовірністю диференціювати гострий вірусний та обструктивний гепатити. У хворих на хронічний гепатит активність ГГТП збільшена в 75 % випадків, тоді як показники АлАТ можуть знаходитися на рівні нормальних значень. Тому тест на ГГТПіз більшою достовірністю підтверджує діагноз захворювання. ГГТП– більш інформативний маркер ураження гепатобіліарноїсистеми, ніж ЛФ. Активність ГГТП зростаєнаранніхтермінахзахворюваньтаутримується на підвищених рівнях довший час, причому відносне збільшення активності ГГТП вище, ніж ЛФ. Крім того, ГГТП – високоспецифічний індикатор ураження печінки, оскільки на відміну від ЛФ її активність у здорових дітей, вагітних жінок і пацієнтів із захворюваннямикісткової системи знаходиться на рівні нормальних значень.

Визначення активності ГГТП має велике значення для диференціації жовтяниць. При паренхіматозній жовтяниці, властивій інфекційним і токсичним захворюванняміз ураженням паренхіми печінки, активність ГГТП підвищується,як правило,лише незначноюмірою(у2– 3 рази).Вусіх хворих з обтураційною (механічною) жовтяницею, викликаною порушеннями відтоку жовчі жовчовивіднимишляхами, такими,як закупоренняжовчних проток каменем, здавлення їх пухлинами, збільшеними лімфовузламитаін., активність ГГТПусироватці крові перевищує верхню межу норми в 15– 140 разів.

Один із механізмів підвищення активності ГГТП – індукція синтезу ферменту “de novo”.

Підвищення активності ГГТП у сироватці крові може бути і наслідком вивільнення мембранозв’язаної ГГТП. Солі жовчних кислот являють собою поверхнево активні речовини, і їх дія як детергента викликає вивільнення ГГТП із мембранозв’язаного стану. Активність ГГТП у жовчі приблизно в 10 разів вища, ніж у сироватці крові здорових людей. Надходження жовчі у кров, імовірно, підвищує активність ферменту в сироватці крові.

Доситьважливою сферою застосування тесту для визначення ГГТП є онкологія. Показано, що у 100 % хворих на злоякісні пухлини з метастазами в печінку (з наявністю жовтяницітабез неї) активність ГГТПусироватці крові значно(у 12 і більше разів) підвищена.Утойсамийчас у хворих без метастазівупечінку активність даного ферменту перевищує норму в основному лише за наявності захворювань гепатобіліарноїсистеми непухлинного походження.

Визначення активності ГГТП використовується для діагностики алкогольного ураження печінки, а також для контролю лікування алкоголізму. Алкоголь підсилює продукцію ГГТП упечінціісприяє її виходу з клітинних мембран, що призводить до підвищення активності ферменту в сироватці крові навіть за відсутності патології печінки. При припиненні зловживання алкоголем рівень активності ГГТП поступово знижується (через 10 днів на 50 %) і потім нормалізується. Томутест на ГГТП дозволяє проконтролювати сумлінність лікування від алкоголізму. Якщо прийманняалкоголю однозначно припинене, а активність ГГТП у колишнього алкоголіка не знижується, то високаймовірність наявності у нього алкогольного гепатиту або цирозу печінки.

Існують також певні відмінності між активністю ГГТП у крові хворих на алкоголізм і людей, що прийняли значну дозу алкоголю. У перших активність ГГТП підвищується до 140% нормальних значень із піком активності через 18 годин, у других навіть після сильного сп’яніння підвищення активності ГГТП не перевищує 15% впродовж 12 годин.

Ряд наркотиків і лікарських препаратів (нестероїдні протизапальні препарати, диклофенак, парацетамол, барбітурати та ін.) також індукують активність ГГТП у печінці. Тому моніторинг ГГТП у сироватці крові хворих використовується для виявлення гепатотоксичної дії препаратів і своєчасної зміни курсу лікування.

Крім основного використання як «печінкової» проби,тестізвизначенняактивності ГГТП застосовується для діагностики захворювань підшлункової залози. Причому в країнах Західної Європи останнім часом він використовується частіше, ніж тест на альфа-амілазу,– традиційний маркер патологій підшлункової залози. Це пов’язано з тим, що у 100 % хворих,що страждають нагострийпанкреатит, активність ГГТПусироватці крові, як правило, в 10–20 разів перевищує нормальні значення.

Клініко-діагностичного значення набуло також дослідження активності ГГТП при ураженнях головного мозку. У тканині мозку активність ферменту розподілена нерівномірно: найбільша активність виявлена в гліальних клітинах і стінках капілярів, що беруть участь у здійсненні функції гематоенцефалічного бар’єра. При закритій травмі головного мозку у різному ступені ушкоджується речовина мозку, що супроводжується виходом ферменту в ліквор і збільшенням активності ГГТП у спинномозковій рідині. При забиттях головного мозку з клінічною картиною ушкодження ЦНС (парези, паралічі, координаційні порушення та ін.) на фоні загальномозкових проявів (кома, психомоторне збудження, підвищення температури тіла, блювання, менінгіальні симптоми) спостерігається в 5–6 разів більш значне підвищення активності ГГТП, ніж при струсі мозку. Таким чином, активність ГГТП може бути використана як додатковий тест для здійснення диференціальної діагностики закритої травми головного мозку.

Новою сферою застосування такого тесту є лабораторна діагностика захворювань нирок. Виявлено, що при пієлонефриті, гломерулонефриті, жовчно-кам’яній хворобі активність ГГТП у сечі хворих істотно зростає. Визначення активності ферменту в сечі дозволяє діагностувати початкові стадії патології нирок, що супроводжуються ураженням проксимальних відділів канальців.У сечі ідентифіковано 2 форми ГГТП – з молекулярною масою 55 і 200 кДа. Значне підвищення активності ГГТП виявлено при нирковій недостатності, спричиненій отруєнням ртуттю. Зниження активності ферменту відмічено в пацієнтів, хворих на полікістоз нирок. Визначення активності ГГТП набуло великого значення й для оцінки нефротоксичності різних препаратів.

Дослідження активності ГГТП у сечі є важливим для оцінки медикаментозної терапії (індометацин, преднізолон) при аутоімунних ураженнях нирок.

Визначення активності ГГТП в амніотичній рідині запропоновано як пренатальний тест діагностики хромосомних порушень. Зниження активності ГГТП в амніотичній рідині виявлено в багатьох випадках трисомії по хромосомах 21 і 18. Зменшення активності ГГТП в амніотичній рідині може бути викликане сповільненням росту плода. Впродовж вагітності, особливо в перші тижні, активність ГГТП у крові знижується.

При інфаркті міокарда впродовж перших 3 діб після початку його розвитку активність ГГТП у сироватці крові залишається нормальною (крім випадків, ускладнених іншими захворюваннями). Починаючи з 4-ї доби активність ферменту трохи підвищується (83 %) і досягає максимуму через 2–3 тижні, а потім у більшості випадків поступово нормалізується. Підвищення активності ферменту відображає перебіг репаративних процесів у печінці й міокарді та розцінюється як загальна відповідь організму, передусім печінки, на патологічний стан, що розвивається.

Причини підвищення активності ГГТП у сироватці крові наведені в табл. 2.

Таблиця 2 – Причини підвищення активності ГГТП у сироватці крові

Тип змін	Причини
Перевищення верхньої межі норми >10 разів	алкогольне ураження печінки; холестаз; рак підшлункової залози з обструкцією жовчної протоки
Перевищення верхньої межі норми в 5–10 разів	гепатит (гострий і хронічний); цироз (без холестазу); інші захворювання печінки; панкреатит
Перевищення верхньої межі норми <5 разів	алкоголізм; ятрогенні отруєння (антиконвульсанти, фенобарбітал, фенітоїн); застійна серцева недостатність

Аналіз зведених даних про активність «печінкових» ферментів усироватці крові при деяких захворюваннях і станах (табл.А.2) показує, що активність ГГТП є високочутливим індикатором захворювань печінки, жовчовивідних шляхів і підшлункової залози. Особливо ефективне застосуваннятакого маркера в діагностиці в комплексі з іншими ферментами печінкового профілю.

Визначення активності ГГТП базується на вимірюванні швидкості ферментативної реакції перенесення гамма-глутамілової групи з субстрату-донора на субстрат-акцептор. У першому методі визначення активності ферменту був використаний його природний субстрат глутатіон. Проте цей метод складнийу виконанні, тому в клінічній біохіміїзначногопоширення ненабув. Сучасні лабораторні способи визначення активності ГГТПбазуютьсяна застосуванні синтетичних хромогенних субстратів-донорів. Починаючи з 60-х роківХХ ст. як такийсубстрат більшість біохімічних лабораторій використовувалигамма-глутаміл-р-нітроанілід, а як субстрат-акцептор гамма-глутаміловоїгрупи– гліцилгліцин.Цей колориметричний тестбазуєтьсянатакій ферментативнійреакції:

L-гамма-глутаміл-р-нітроанілід + гліцилгліцин ---> L-гамма-глутамілгліцилгліцин + р-нітроанілін.

Активність ГГТП визначається за швидкістю розщеплювання хромогенного субстрату з утворенням р-нітроаніліну, інтенсивність забарвлення якого (оптична густина при довжині хвилі 405 нм) пропорційна активності ферменту в аналізованій пробі. Широке застосування такого методу на практиці та в наукових дослідженнях дозволило встановити нормальні значення активності ГГТП у сироватці крові пацієнтів різного віку й статі, а також величин, що відповідають різним патологічним станам, на які орієнтуються і сьогодні.

До недоліків застосування гамма-глутаміл-р-нітроаніліду як хромогенного субстрату належить його низька розчинність, що утруднює приготування його розчину з необхідною концентрацією, а також недостатня стабільність робочого розчину, в якому при зберіганні спонтанно утворюється р-нітроанілін. Цих недоліків позбавлений широковживаний на сьогодні для аналізу ГГТП гамма-глутаміл-3-карбокси-4-нітроанілід (ГГКНА). Цей субстрат із розчинністю, в 50 разів вищою, ніж гамма-глутаміл-р-нітроанілід, утворює високостабільні розчини. Кінетичні константи ферментативної реакції для обох субстратів подібні.

Міжнародна федерація клінічної хімії (IFCC) рекомендує як референтний метод визначення активності ГГТП колориметричний кінетичний метод із ГГКНА в концентрації, що забезпечує максимальну швидкість ферментативної реакції (6 мМ). Проте для рутинного аналізу в лабораторіях частіше застосовують модифікований метод Зейца (Szasz), в якому концентрація з ГГКНА нижча (3–4 мМ). Результати визначення активності ГГТП,що отримуютьпри цьому, нижчі(приблизно на 7 %), ніжзаметодомIFCC, проте вони повністюзбігаютьсязізначеннями активності ферменту,що визначаютьіз застосуванням яксубстратугамма-глутаміл-р-нітроанілід.