16. Фосфатази

Фосфатази – ферменти, що каталізують розриви складноефірних зв’язків у моноефірах фосфорної кислоти з утворенням вільного ортофосфату (аніону ортофосфорної кислоти); належать до класу гідролаз.

Лужна фосфатаза. Лужна фосфатаза (фосфомоноестераза, фосфогідролаза моноефірів ортофосфорної кислоти, ЛФ; КФ 3.1.3.1) значно поширена в тканинах людини, особливо у слизовій оболонці кишечника, остеобластах, стінках жовчних проток печінки, плаценті та лактуючій молочній залозі. Вона каталізує відщеплення фосфорної кислоти від її органічних сполук; назву отримала у зв’язку з тим, що оптимум рН лужної фосфатази лежить у лужному середовищі (рН 8,6–10,1). Фермент міститься на клітинній мембрані й бере участь у транспорті фосфору. Двовалентні іони, такі, як Mg²⁺, Co²⁺, Mn²⁺, є активаторами ферменту, Zn²⁺ входить до структури активного центра. Фосфати, борати, оксалати пригнічують активність усіх форм ферменту. У сироватці крові є декілька ізоферментів ЛФ, сім із яких мають найбільше клініко-діагностичне значення. Рівень активності лужної фосфатази в нормі наведений у таблиці 4. Із діагностичною метою найчастіше проводять визначення активності кісткової та печінкової форм ЛФ.

Таблиця 4 – Рівень активності лужної фосфатази в нормі (реакція з фенілфосфатом)

(за Г. І. Назаренкота ін.)

Вік	Загальна, МО/л	Кісткова, %
Новонароджені	35-106
1 міс.	71-213	85
3 роки	71-142	85
10 років	106-213	85
Дорослі до 31 року	39-92	60
Дорослі старші 31 року	39-117	40

1. Кісткова ЛФ. У кістковій тканині ЛФ секретується остеобластами, її роль у формуванні кістки до кінця не з’ясована. Припускають, що вона бере участь у дозріванні матриксу і його мінералізації. Специфічність кісткової ЛФ, а також такі її характеристики, як час напівжиття в крові, що становить 1–2 дні, відсутність процесів за її участі в печінці, виділення з крові за допомогою нирок, наближають кісткову ЛФ до ідеальних маркерів активності остеобластів. Кісткова ЛФ найбільш термолабільна, інактивується при 55 °С. Синтез кісткової ЛФ зростає в процесі диференціювання остеобластів при прискореному формуванні кістки. Значне збільшення її активності в сироватці крові спостерігається при підвищеній діяльності остеобластів: ріст кісток (у дітей активність вища, ніж у дорослих; збільшується вона в останній триместр вагітності), відновленні рухів після тривалого постільного режиму, переломах, деформівному оститі, рахіті. Це характерно і для процесів остеомаляції (злоякісні пухлини кісток, мієлома), а також кісткового туберкульозу і лейкозу. Підвищення активності кісткової ЛФ при рахіті відмічається частіше, ніж збільшення вмісту неорганічного фосфору; при видужанні активність ЛФ нормалізується пізніше, ніж рівень кальцію та фосфору, приблизно на ті ж терміни, що і рентгенологічні показники. Первинний і вторинний гіперпаратиреоз може супроводжуватися підвищенням активності ЛФ, що пояснюється залученням метаболізму кісткової тканини до патологічного процесу при тиреотоксикозі.

Інтерпретація даних досліджень кісткової ЛФ, проте, буває утруднена, що пов’язане, з одного боку, зі статевими й віковими особливостями її активності, а з іншого – з недостатньою специфічністю методів, що використовуються для її визначення. Найадекватнішими методами дослідження кісткової ЛФ на сьогодні вважаються радіоімунний та імуноферментний аналізи з використанням моноклональних антитіл.

2. Печінкова ЛФ. Представлена двома ізоферментами. Перший підвищується в сироватці крові при застої в печінці і зниженій елімінації ферменту з жовчю, його підвищення відбувається також у другій половині вагітності. Це основний ізофермент, що має значення для діагностики патології гепатобіліарного тракту. Другий ізофермент підвищується при гепатоцелюлярній патології – вірусні гепатити, цирози. Це збільшення, проте, значно поступається підвищенню активності амінотрансфераз. Підвищення активності ЛФ спостерігається у 20% хворих на первинний рак печінки і при метастазах у печінку. Різко зростає її активність при отруєннях алкоголем на фоні хронічного алкоголізму. Вона може підвищуватися під час приймання лікарських препаратів, що проявляють гепатотоксичний ефект (тетрациклін, парацетамол, фенацетин, 6-меркаптопурин, саліцилати та ін.).

3. ЛФ жовчі– фермент холестазу – недостатність виділення жовчі, зумовлена порушенням її вироблення печінковими клітинами (внутрішньопечінковий холестаз) або припиненням відтоку жовчі жовчними протоками (позапечінковий холестаз). Фермент вивільняється з ушкоджених жовчних проток. Найвищі значення активності ферменту в сироватці крові спостерігаються при обтураційних жовтяницях, коли затримка екскреції ферменту з жовчю призводить до того, що він знову надходить у кров. Важливим є й індуктивний синтез ізоферменту в жовчних канальцях. У жінок, що приймають естрогеновмісні контрацептиви та прогестерон, може розвинутися холестатична жовтяниця й підвищитися активність ЛФ. За клінічною чутливістю та специфічністю стосовно обтурації тест поступається таким маркерам холестазу, як ГГТП і 5’-НТ.

4. Кишкова ЛФ.Синтезується ентероцитами, надходить у просвіт тонкого кишечника й частково всмоктується у кров. Унесок її в загальну активність ЛФ невеликий. Її активність може бути збільшена у осіб з I або III групою крові, особливо після приймання їжі, при захворюваннях кишечника, що супроводжуються діареєю.

5. Ниркова ЛФ.Частково всмоктується в кров, але в основному екскретується із сечею. Тест використовується в діагностиці захворювань нирок (гломерулонефрит, пієлонефрит, нефропатії).

6. Плацентарна ЛФ. З’являється в сироватці крові при вагітності. Найбільший її вміст виявляється в третьому триместрі. Це найбільш термостабільний ізофермент ЛФ. Дуже високі значення активності ЛФ спостерігаються у жінок із прееклампсією, що є наслідком ушкодження плаценти. Низька активність ЛФ у вагітних свідчить про недостатність розвитку плаценти.

7. Неідентифіковані ізоферменти ЛФ (так звані ізоферменти Регана) пухлинного походження (найчастіше визначаються при раку легені). Термостабільність, електрофоретична рухливість та імунологічні характеристики наближені до таких для плацентарного ізоферменту.

Сироваткова активність ЛФ може знижуватися через генетичний блок у синтезі будь-якого з її ізоферментів, а також при гіпопаратиреозі, гіповітамінозі С, квашіоркорі, ахондроплазії, кретинізмі, накопиченні радіоактивних речовин у кістках.

Наявність великої кількості ізоферментів ЛФ робить малоінформативним визначення її загальної активності. Слід розділяти ізоферменти і потім оцінювати внесок кожного з них у загальну активність. Розділити ізоферменти ЛФ, користуючись температурною інактивацією, не вдається. Проте для диференціальної діагностики обтураційних жовтяниць і жовтяниць при біліарному цирозі можна користуватися вибірковою тепловою денатурацією: визначають активність ЛФ у нативній сироватці крові й у прогрітій при 56 °С упродовж 15 хв. Потім обчислюють коефіцієнт, у чисельнику якого активність ЛФ у нативному матеріалі, а в знаменнику – активність у прогрітій сироватці крові. У хворих на біліарний цироз середнє значення цього коефіцієнта становить 1,8, а на обтураційну жовтяницю – 3,8. Гарні результати розділення ізоферментів ЛФ можна отримати при електрофорезі на плівках із ацетату целюлози, але кращим методом розділення слід вважати електрофорез у ПААГ. Найрухливішими при електрофорезі (від катода до анода) є печінкові та жовчний ізоферменти, потім йдуть кісткова, плацентарна, ниркова та, нарешті, кишкова фракції ЛФ.

Упродовж тривалого часу активність ЛФ у сироватці крові досліджували в реакції з β-гліцерофосфатом. Звільнений у результаті гідролізу фосфат визначали в реакції з фосфомолібденовою кислотою з утворенням жовтого комплексу, який при дії відновників (аскорбінова кислота, ейконоген) переводили у фосфомолібденовий синій і колориметрували при довжині хвилі 620–640 нм. У цьому методі використовували природний субстрат, але реакція багатостадійна і тривала. Як субстрат для визначення ЛФ запропоновано застосовувати фенілфосфат з подальшим визначенням звільненого при гідролізі фенолу в реакції з фосфорно-вольфрамовою кислотою або ж при ідентифікації фенолу в реакції з 4-аміноантипірином за утворенням кольорового хромогену. На цей час такі методи становлять лише історичний інтерес.

Першим кінетичним методом визначення ЛФ, що не вимагає попередньої депротеїнізації сироватки крові, була реакція з п-нітрофенілфосфатом. У результаті гідролізу субстрату утворюється п-нітрофенол, що має жовте забарвлення; саме цей метод був уперше автоматизований. На сьогодні цей метод визначення активності ЛФ запропонований як референтний.

Кисла фосфатаза. Фосфатаза кисла (КФ, КФ 3.1.3.2) – фермент із широкою субстратною специфічністю, що каталізує розщеплення складноефірних зв’язків із утворенням вільного ортофосфату, за спектром активності наближений до ЛФ, від якої відрізняється іншою дією на сірковмісні ефіри, оптимумом рН (4,7–6,0; а у ЛФ – 8,4–9,4) та іншими властивостями; часто використовується як популяційно-генетичний маркер.

Під назвою «кисла фосфатаза» мають на увазі всі фосфатази, що проявляють оптимальну активність при рН<7,0. Це ферменти, які містяться в клітинах різних тканин у лізосомах і поза ними. Найвища концентрація КФ визначається в передміхуровій залозі (простатичний ізофермент). Фермент наявний у клітинах печінки, селезінки, еритроцитах, тромбоцитах, кістковому мозку. Висока активність КФ визначається також у макрофагах і остеокластах.

Активність КФ сироватки крові низька за нормальних умов, у чоловіків приблизно наполовину складається з активності простатичної фосфатази, решта активності пов’язана з ферментом, що походить із печінки й зруйнованих тромбоцитів і еритроцитів. У жінок КФ сироватки крові походить переважно з печінки, еритроцитів і тромбоцитів.

Визначення КФ у сироватці крові, як правило, використовують для виявлення або моніторингу карциноми простати у чоловіків. Активність цього ферменту в сироватці збільшена у 60% пацієнтів із локалізацією карциноми в простаті, особливо за наявності кісткових метастазів – фермент продукується неопластичними клітинами. Рівень активності КФ в останньому випадку може підвищуватися до 40–50 разів від верхньої межі референтних значень. Якщо карцинома залишається локалізованою в передміхуровій залозі, активність КФ може бути лише злегка збільшеною або знаходитися в межах референтних значень, таким чином, нормальний рівень сироваткової активності КФ не виключає раку простати.

Тимчасове збільшення активності КФ у сироватці крові можуть викликати діагностичні або лікувальні маніпуляції на передміхуровій залозі (пальпація, біопсія і т. п.). Доброякісна гіпертрофія простати не супроводжується зростанням активності ферменту в сироватці. Активність КФ сироватки крові може підвищуватися також при гіперпаратиреоїдизмі, хворобі Педжета, деяких формах раку молочної залози і злоякісних метастазах у кісткову тканину цих пухлин. В останньому випадку джерелом ферменту, імовірно, є остеокласти.

Збільшені концентрації КФ спостерігаються у пацієнтів із хворобою Гоше, хворобою Німана-Піка, мієлоцитарною лейкемією та при деяких інших гематологічних захворюваннях.

Для того щоб визначити в плазмі крові вміст тільки фракції КФ передміхурової залози, було запропоновано багато методів, але повного успіху досягти не вдалося. Один із кращих біохімічних методів ґрунтується на використанні тартрату для пригнічення активності КФ передміхурової залози. Аналіз проводять в присутності і за відсутності тартрату, і різниця між результатами вимірювань у цих двох пробах характеризує тартрат-чутливу КФ передміхурової залози.

На сьогодні можливо, використовуючи радіоімунологічний метод, виміряти не активність ферменту, а його вміст як білка. Цей метод відрізняється надмірною чутливістю, оскільки він не дозволяє відрізнити ранні стадії розвитку злоякісного новоутворення від доброякісного збільшення об’єму передміхурової залози. Зазначений метод також не є специфічним: одержані результати можуть свідчити про наявність аномалій у випадках злоякісних новоутворень, локалізованих поза передміхуровою залозою. При проведенні скринінгового дослідження на карциному передміхурової залози такий метод застосовувати не слід.

КФ при кімнатній температурі швидко втрачає свою активність. Тому кров рекомендують центрифугувати відразу після її взяття на аналіз, а сироватку відділяти від згустка впродовж 2 год із моменту взяття крові у пробірку. У процесі визначення активності КФ у сироватці крові слід остерігатися гемолізу, а сироватку використовувати негайно або зберігати при 4 °С або, краще, в замороженому стані при -20 °С (бажано підкислити оцтовою кислотою або цитратним буфером). Для виконання імунологічних досліджень сироватку можна зберігати замороженою до 3–4 діб.

Тартрат-резистентна кисла фосфатаза (TRACP 5в).

TRACP 5в – фермент, що секретується винятково остеокластами й потрапляє в підвищеній кількості у кровотік при збільшенні кількості та зростанні активності остеокластів. TRACP представлена двома субформами – 5а і 5в, з яких лише субформа 5в продукується остеокластами. Визначення рівня тартрат-резистентної кислої фосфатази 5в може бути використане як маркер метастатичного ураження скелета, оскільки такий процес супроводжується збільшенням інтенсивності остеолізу й підвищенням у сироватці крові активності TRACP5B у результаті її виходу в циркуляторне русло. Тест має високу діагностичну чутливість і специфічність: у пацієнтів, хворих на рак молочної залози, ці показники становили 82 і 87 %, у хворих на рак передміхурової залози – 71 і 83,4 % відповідно. Визначення цього маркера в онкологічних хворих сприяє підвищенню точності ранньої діагностики метастазів у кісткову тканину, оцінки ступеня метастатичного ураження скелета. Дослідження цього маркера особливо корисне для моніторингу лікування остеопорозу, хвороби Педжета, онкологічних захворювань із метастазами в кістки при застосуванні різних препаратів, що пригнічують резорбцію кісткової тканини (бісфосфонати, естроген та ін.). Активність TRACP 5в у сироватці крові не залежить від функціонального стану печінки й нирок і відображає інтенсивність кісткової резорбції за останні 24 год.