4.9. Креатинкіназа

Креатинкіназа, або креатинфосфокіназа (АТФ: креатин-фосфотрансфераза, КК; КФ 2.7.3.2), каталізує оборотну реакцію фосфорилювання креатину за участю АТФ, унаслідок чого утворюються креатинфосфат і AДФ.

Молекула ферменту містить дві активні тіолові групи, що відіграють важливу роль у здійсненні його каталітичної функції. У зв’язку з цим деякі тіолові сполуки (глутатіон, цистеїн) справляють на КК активуючу дію. Активність ферменту підвищується під впливом тироксину, іонів магнію, марганцю, кальцію та знижується під дією іонів цинку, міді, ртуті.

КК є димером, що складається з двох субодиниць, кожна з молекулярною масою приблизно 40 кДа. Субодиниці В (від brain – мозкова) і М (від muscle – м’язова) закодовані в різних генах. Фермент існує у вигляді трьох ізоферментів: КК-ВВ (КК-1) – мозковий, КК–МВ (КК-2) – серцевий і КК-ММ (КК-3) – м’язовий. У електричному полі найбільшу рухливість має КК-ВВ, найменшу — КК-ММ, гібридна форма КК-МВ займає проміжне положення.

КК-ВВ наявний у значних кількостях у мозку, простаті, шлунку, легенях, сечовому міхурі, уретрі, плаценті, щитовидній залозі. КК-МВ в основному знаходиться в серцевому м’язі(25–46 % від загальної активності КК кардіоміоциту) і в невеликійкількостів скелетних м’язах (менше 5% загальної активності). КК-ММ наявний в основному в клітинах скелетних і серцевого м’язів. Активність КК-ММ у сироватці крові становить 94–96% від загальної активності КК, КК-МВ – 4–6 %, КК-ВВ – активністьслідоваабо не визначається. Усі три ізоферменти знайдені в цитозолі клітин або зв’язані з міофібрилами. Виявлена й четверта мітохондріальна форма креатинкінази (КК-Mt), яка відрізняється від інших форм імунологічно, а також за електрофоретичною рухливістю. Вона локалізована між внутрішньою й зовнішньою мітохондріальними мембранами, в серці становить до 15% загальної КК активності.

Активна КК може міститисяв сироватцікрові у виглядідвохмакромолекулярних комплексів: макро-КК тип1 і тип 2. Тип 1 – це КК-ВВ,зв’язана з IgG, або КК-ММ,зв’язана з IgA; тип 2 – це олігомери КК-Mt.Нормальна активність КК (загальна) може варіювати залежно від методу: 10–195 МО/л.

Загальна КК підвищується при багатьох захворюваннях та станах: травми, операції, інфаркт міокарда, зменшення кровопостачання м’язів, міопатії, дерматоміозит, м’язова дистрофія, міокардит, отруєння, що супроводжуються комою, гіпотиреоз, інфекційні хвороби (наприклад, черевний тиф), дегідратація, ураження електричним струмом та ін.

Ширшого застосування визначення активності КК отримало для діагностики інфаркту міокарда. Оскільки у хворих на гостру коронарну недостатність скелетна мускулатура і ЦНС, як правило, не залучені до патологічного процесу, підвищення активності КК у цих випадках, як правило, свідчить про ураження міокарда. При неускладненій стенокардії активність КК залишається нормальною. При дрібновогнищевому інфаркті міокарда чутливість тесту становить 92 %.

При інфаркті міокарда реєстроване підвищення активності КК спостерігається вже впродовж 3–6 год після ангіозного нападу. Проте визначення активності раніше 8 год дає позитивні результати в 31% випадків. Активність КК є достовірним тестом інфаркту міокарда, починаючи з 8–10 год після початку больового нападу. Максимальний рівень активності досягається впродовж 24 год, і навіть при обширному інфаркті активність КК може повернутися до норми упродовж подальших 48 год. Відносне підвищення активності КК при інфаркті міокарда вище, ніж інших ферментів. Найбільш інформативне дослідження активності КК у динаміці – кожні 4–6 год упродовж доби.Хоча активність КК при інфаркті міокарда є дуже чутливим тестом, проте на нього не можна покладатися при одноразовому визначенні та відсутності інших показників, оскільки підвищення може бути викликане і рядом інших причин, зазначених вище, а також вживанням алкоголю, інтенсивним фізичним навантаженням, станом щитовидної залози, отруєнням снодійними засобами, введенням деяких лікарських препаратів (клофібрат, карбеноксолон). До речі, при інфаркті легені активність КК не перевищує норми, що має диференціально-діагностичне значення. Іноді невелике збільшення активності КК відмічається при застійній серцевій діяльності, тахікардії, емболії легеневої артерії. У 50–80% випадків дистрофії Дюшена, яка має асимптоматичний перебіг, активність КК сироватки крові підвищена в 3–6 разів, при цьому рівень ферменту може нормалізуватись у період м’язового спокою.

Активність КК у сироватці, як правило, має зворотну залежність із тиреоїдною функцією щитовидної залози. Близько 60% хворих на гіпотиреоз мають рівень КК, вищий за норму, з перевищенням верхньої межі в середньому в 5 разів. Основний ізофермент при цьому КК-ММ, хоча у13% хворих підвищена і КК-МВ, що свідчить про залучення до патологічного процесу не лише скелетних, але й серцевого м’яза. У той самий час у хворих на гіпертиреоз є тенденція до низьких значень активності КК у сироватці крові.

Різке підвищенняактивностіКК (більш ніж у 10 разів) виникає на 1–2-й день порушення мозкового кровообігу, досягаючи максимуму на 3-й день.

Активність фермента значно підвищується у хворих із гострим перебігом ревматизму (ревмокардиту). При ревматоїдному артриті відмічено 5–6-кратне збільшення активності КК у сироватці крові, яке не залежить від ступеня активності запального процесу в цілому. Відмічено залежність ступеня підвищення активності КК від тривалості патологічного процесу, причому максимальні значення отримані у хворих з тривалістю захворювання від 5 до 10 років. У пацієнтів, що хворіють більше 10 років, виявлено деяке зниження активності КК, що, очевидно, пов’язано з переважанням атрофічних змін у скелетних м’язах. Найвища активність фермента відмічалася при ураженні великої кількості суглобів та патологічних змінах у скелетних м’язах.

Активність фермента підвищується при алкогольній інтоксикації (вживання алкоголю може викликати “гострий м’язовий синдром”).

До збільшення активності КК призводить гемоліз, що зумовлено виділенням у сироватку крові аденілатциклази.

Підвищені значення активності КК виявляються і в практично здорових людей після енергійних фізичних вправ, при важкій фізичній праці, спортивних навантаженнях.

Значне зменшення активності КК спостерігається при дії на пробу сироватки крові прямих сонячних або ультрафіолетових променів.

КК-ММ збільшується в сироватці при тих самих станах, що й загальна КК.

КК-МВ значно збільшується при інфаркті міокарда, визначення ізоферменту має діагностичне значення, якщо загальна активність ферменту в сироватці крові підвищується більш ніж у 1,5 раза порівняно з верхньою межею норми. Максимальна активність КК-МВ спостерігається через 20 год після прояву перших клінічних симптомів інфаркту міокарда, зниження до нормального рівня, як правило, відбувається через 40–50 год від початку захворювання. Підвищення активності КК-МВ у сироватці крові корелює з наявністю вогнища ураження міокарда, а при тривалому динамічному спостереженні – і з розміром зони некрозу. Вірогідність встановлення діагнозу інфаркту міокарда підвищується, якщо крім збільшення активності окремих ферментів крові враховувати зміну їх співвідношення. Так, у гострому періоді інфаркту міокарда співвідношення КК-МВ/загальна КК збільшується від 3 до 40%. Крім інфаркту міокарда КК-МВ може незначно збільшуватися при міокардиті, стенокардії, затяжній аритмії, тяжких отруєннях.

Необхідно зазначити, що на цей час як специфічні маркери загибелі кардіоміоцитів використовують міокардіальні ізоформи тропоніну Т (Тн Т) і тропоніну І (Тн І). Визначення вмісту Тн Т дозволяє провести діагностику інфаркту міокарда як на ранніх, так і на пізніх термінах. Вміст Тн Т у крові підвищується вже через декілька годин після нападу стенокардії. Рівень Тн Т виявляється високим у ті терміни неускладненого інфаркту міокарда, коли рівень міоглобіну й активність КК-МВ вже стали у нормі. Тому особливо важливим є дослідження Тн Т у хворих, які госпіталізовані у стаціонар через 2–3 дні після нападу стенокардії, коли показники КК і КК-МВ можуть вже нормалізуватися. Крім того, порівняно з КК і КК-МВ вміст тропонінів у крові підвищується більшою мірою, що характеризує їх вищу діагностичну чутливість. Порівняльне дослідження Тн Т і Тн І виявило більш високу діагностичну чутливість Тн І. Так, рівень у крові Тн І при інфаркті міокарда може майже у 100 разів перевищувати верхню межу норми. Визначення Тн І можна використовувати з метою діагностики інфаркту міокарда у пацієнтів із супутнім пошкодженням скелетних м’язів. Так, виявлено, що гострі та хронічні пошкодження скелетних м’язів, надмірне фізичне навантаження, хірургічні операції (крім операцій на серці), м’язові травми не викликають підвищення рівня Тн І. Визначенню обох форм Тн Т і Тн І надається перевага при діагностиці інфаркту міокарда, що розвивається у післяопераційному періоді та після активних реанімаційних заходів.

Вважають, що активність КК-ВВможе бути тестом аноксіїтканин. Активність КК-ВВ у крові може бути також наслідком гіпоксичного ушкодження мозку, особливо в умовах перинатальної гіпоксії. Активність КК-ВВ збільшена у 53 % новонароджених із асфіксією. КК-ВВ наявний у гладкій мускулатурі, але не визначається в сироватці крові у осіб із доброякісними захворюваннями цих тканин. Одним із можливих пояснень підвищення активності КК-ВВ у крові при судинних операціях є припущення, що стінки вен, як, втім, і аорти, містять тільки одну ізоформу КК, а саме КК-ВВ.

КК-ВВ у сироватці крові незначно підвищується при деяких формах раку (легені, кишечника, сечового міхура, передміхурової залози), травмі серцевого м’яза, захворюваннях сполучної тканини.

Метастазування раку передміхурової залози супроводжується дуже високими цифрами активності КК-ВВукрові. Дослідники сходяться на думці, що активність КК-ВВможе бути використана як неспецифічний маркер пухлинного процесу. Слід зазначити, що при пухлинному процесі активність КК-ВВукровінаявнау формі макроКК-1.

Під час пологів КК-ВВ може збільшуватися в сироватці до 6 разів (джерелом є плацента).

МакроКК тип 1 виявляється в сироватці дорослих при захворюванні шлунково-кишкового тракту, аденомі, карциномі, ушкодженнях серцевого і скелетного м’язів і у стані з високою імовірністю летального наслідку. Іноді макроКК тип 1 трапляється у жінок старше 50 років.

МакроКК тип 2 виявляється в сироватці дорослих із тяжкою формою раку або хвороби печінки, а також у дітей з ураженням серцевого м’яза. Поява КК-Mt – погана прогностична ознака, серед таких хворих висока смертність.

Аналітичні методи, що використовуються в клінічній біохімії для визначення активності КК, можуть базуватися як на прямій, так і на зворотній реакції. Уході реакції можна визначити кількість креатину або концентрацію креатинфосфату. Першими методами визначення активності КК були методи кінцевоїточки;нацей час домінують кінетичні методи.

Креатинфосфат у кислому середовищі гідролізує з більшою швидкістю, ніж АДФ і АМФ, при цьому утворюються креатин і ортофосфат. Далі кількість звільненого при гідролізі ортофосфату визначають за формуванням молібденового синього в реакції Фіске-Суббароу (прямий метод). У інших реакціях звільнений при гідролізі креатин взаємодіє з нінгідрином, діацетилом або α-нафтолом із формуванням флюорофорів. Флюоресценцію останніх вимірюють при специфічних довжинах хвиль на флюоресцентному спектрофотометрі.

На сьогодні для визначення активності КК використовують кінетичну УФ-спектроскопію – референтний метод, запропонований Олівер і співавт., який базується на зворотній реакції – кінетичному визначенні креатинфосфату, що утворюється в реакції. Збільшення абсорбції реакційної суміші при довжині хвилі 340 нм і кінетичному вимірюванні дозволяє визначити активність КК у великому інтервалі активності. Подальше вдосконалення методу стосується введення в реакцію АМФ для інгібування аденілаткінази і додавання N-ацетилцистеїну з метою захисту тіолових груп ферменту від окиснення.

Існує три загальновизнані методичні підходи до розділення ізоферментів КК: електрофорез, хроматографічні та імунологічні методи.

Електрофоретичним методом (на агарі, агарозіабо ацетаті целюлози) можна розділити фракції КК. Візуалізація електрофоретичних смуг ізоферментів проводиться, як правило, з використанням НАДФН флюоресценції в ультрафіолетовій області спектра (360 нм). Тому ця процедура доситьтрудомісткайвимагає оснащенняспеціальною технікою.

Іонообмінною або абсорбційною хроматографією розділяють ізоферменти КК на декілька фракцій. Ізоферменти КК, як правило, абсорбуються на гелі, з якого потім проводиться їх елюція буферами. Випускаються спеціальні комерційні мініколонки: метод простий і швидкий, основна складність – розділення фракцій при значному підвищенні кількості КК-ММ у патологічних випадках.

Імунологічні методи базуються на вимірюванні активності КК за наявності специфічної антисироватки, що містить моноклональні або поліклональні антитіла проти М або В субодиниць. Комерційні набори, що ґрунтуються на техніці преципітації, дозволяють виявляти КК-МВ за умов її істотного підвищення з коефіцієнтом варіації 10–20 %, проте ці тести виконуються швидко, як правило, не вимагають спеціальної апаратури і можуть використовуватися індивідуально, що є особливо зручним при експрес-діагностиці. Випускаються комерційні набори для фотометричного визначення КК-МВ, що базуються на визначенні активності КК при інгібуванні М-субодиниці. Норми для відсоткового розподілу активності ізоферменту КК-МВ у загальній КК-активності в цьому випадку істотно відрізняються від електрофоретичного розподілу.