4.3. Альфа-амілаза

Альфа-амілаза (діастаза, α-1,4-D-глюканглюкано-гідролаза; КФ 3.2.1.1) належить до класу гідролаз, що каталізують гідроліз полісахаридів, що містять α-D-глюкозу, до простих моно- і дисахаридів (мальтоза, глюкоза). Розриваються зв’язки між α-1 і 4 атомами вуглецю, зв’язки в полісахаридах між α-1 і 6 атомами вуглецю не атакуються ферментом. Існує другий тип амілази – β-амілаза (виділена з рослин і бактерій); вона здатна розщеплювати тільки термінальні зв’язки на кінцях вуглеводів. Висока активність альфа-амілази виявляється в печінці, скелетних м’язах, у мікроворсинках ентероцитів, слізній рідині, секреті молочних залоз. Активність ферменту виявлена також у різних пухлинах. Найбільш багаті на амілазу підшлункова і слинні залози. Амілаза секретується в кров головним чином із цих органів. Плазма крові людини містить альфа-амілазу двох ізозимних типів: панкреатичну (Р-тип), яка виробляється підшлунковою залозою, і слинну (S-тип), яка продукується слинними залозами. У кожному з цих типів амілаз є декілька ізоформ. Так, виявлено 7 фенотипів амілази слини і 3 фенотипи амілази панкреатичного соку.

У фізіологічних умовах амілаза сироватки крові складається на 40 % із панкреатичної амілази і на 60 % із слинної амілази. На електрофореграмах кожний із цих ізоферментів виявляється у вигляді двох основних фракцій. Ізоферменти слинних залоз мають нижчу ізоелектричну точку та при електрофорезі мігрують швидше. Визначення вмісту кожного ізоферменту амілази можна здійснити за допомогою імунологічних методів. При цьому використовують моноклональні антитіла до ізоферментів слинних залоз, які вибірково інгібують активність слинної амілази. Активність, виміряна після інгібування, відповідає активності панкреатичного ізоферменту. Віднімаючи від загальної активності амілази активність панкреатичної амілази, можна отримати значення активності ізоферменту слини.

Обидва ізоферменти амілази мають молекулярну масу приблизно 45 кДа, тому фільтруються в нирках і екскретуються із сечею. Проте у складі сечі більша питома вага припадає на панкреатичний ізофермент.

Визначення активності альфа-амілази має велике значення в діагностиці захворювань підшлункової залози. Підвищення активності альфа-амілази в сироватці крові в 2 і більше разів повинно розцінюватися як симптом ураження підшлункової залози. Невелика гіперамілаземія дає підставу запідозрити патологію підшлункової залози, але іноді спостерігається при захворюваннях інших органів. Із сечею виділяється в основному Р-амілаза, що є однією з причин більшої інформативності про функціональний стан підшлункової залози уроамілази, ніж амілази сироватки крові. Вважають, що 65 % амілазної активності сечі зумовлено панкреатичною амілазою. Цим пояснюється та обставина, що при гострому панкреатиті саме її вміст збільшується в сироватці (до 89 %) і особливо в сечі (до 92%) без зміни показників амілази слинних залоз. При гострому панкреатиті активність амілази крові та сечі збільшується в 10–30 разів. Гіперамілаземія настає на початку захворювання (вже через 4–6 год), досягає максимуму через 19–24 год, потім швидко знижується і нормалізується на 2–6-й день. Рівень підвищення сироваткової амілази не корелює з тяжкістю панкреатиту. Звичайно гіперамілазурія триває довше, ніж гіперамілаземія.

Гіперамілазурія в 75% хворих на гострий панкреатит і загострення хронічного панкреатиту реєструється в період до 8 год від початку захворювання, у 50% хворих – через 8–12 год, у 25% – через 12–18 год, у 66,6% – через 18– 24 год, у 75% – через 24–36 год, у 100% – через 36–48 год і у 62,5% – через 48–72 год. Діагностична чутливість визначення амілази в сироватці крові для гострого панкреатиту становить 95%, специфічність – 88%.

Можливий перебіг гострого панкреатиту і без підвищення активності амілази (зокрема, при тотальному панкреонекрозі). У першу добу від початку захворювання нормальний рівень амілазної активності сечі виявляється в 25% хворих на абортивний, у 20% – жировий і в 10% – геморагічний панкреатит. Точнішу інформацію отримують при дослідженні активності амілази в добовому об’ємі сечі. Важливе, а у ряді випадків вирішальне значення для розпізнавання рецидивної форми гострого панкреатиту має повторне підвищення активності амілази крові й сечі під час рецидивів больового синдрому, які повторюються. Ця ознака має велике значення для розпізнавання легких форм рецидивного гострого панкреатиту. Тому слід ще раз підкреслити необхідність повторних досліджень активності альфа-амілази сечі впродовж перших двох діб захворювання.

Відомо, що активність альфа-амілази пригнічується при дії великої кількості молекул нейтральних жирів на активний центр ферменту. У зв’язку з цим слід особливо уважно підходити до інтерпретації результатів дослідження активності альфа-амілази у хворих на панкреатит із супутнім порушенням ліпідного обміну.

При різних формах гострого панкреатиту динаміка підвищення альфа-амілази в крові й сечі має різний характер. Так, для абортивного (набрякового) панкреатиту характерна короткочасна амілаземія в 1–3-тю добу захворювання; для жирового панкреонекрозу – висока й тривала амілаземія, а для геморагічного панкреонекрозу – короткочасна гіперамілаземія на 3-тю добу захворювання. Патогенетично гіперамілаземія розвивається в результаті блокади набряклою інтерстиціальною тканиною вивідних проток підшлункової залози й найбільш характерна для жирового панкреонекрозу. При геморагічному панкреонекрозі відзначають різке підвищення активності альфа-амілази в крові з подальшим швидким її зниженням, що відображає прогресування некрозу в підшлунковій залозі.

Виявлення гіперамілаземії та гіперамілазурії є важливим, але не специфічним для гострого панкреатиту; окрім того, підвищення активності ферменту може бути короткочасним. Для підвищення інформативності отриманих результатів дослідження корисним є поєднання визначення активності амілази крові й сечі з паралельним визначенням концентрації креатиніну в сечі й сироватці крові. На підставі цих даних розраховують індекс амілазо-креатинінового кліренсу за формулою:

АС · КрК · 100 / (КрС · АК),

де AС – активність α-амілази сечі; АК – активність α-амілази сироватки крові; КрС – рівень креатиніну в сечі; КрК – вміст креатиніну в сироватці крові.

Із формули бачимо, що визначення відношення кліренсів альфа-амілази й креатиніну має три основних переваги: не залежить від об’єму сечі, а отже, і не пов’язане із трудомісткою процедурою її збирання; від часу збирання сечі й сироватки (передбачає лише одночасне встановлення активності альфа-амілази й концентрації креатиніну в окремих пробах біологічної рідини); від використаного методу виявлення активності альфа-амілази і креатиніну (що дозволяє порівнювати результати, отримані в різних лабораторіях). Для зручності використання наведене співвідношення множать на 100 і виражають у відсотках.

У нормі амілазо-креатиніновий індекс не вище 4%. Величина його більше 6 % свідчить про наявність панкреатиту, оскільки при панкреатиті зростає рівень істинно панкреатичної альфа-амілази, а її кліренс здійснюється на 80 % швидше за кліренс амілази слини. Проте встановлено, що при гострому панкреатиті значно збільшується кліренс Р- і S-амілази. У здорових людей амілаза сироватки спочатку фільтрується в ниркових клубочках, а потім реабсорбується в канальцях. При гострому панкреатиті механізм канальцевої реабсорбції пригнічується внаслідок надмірної фільтрації клубочками Р- і S-амілази. Оскільки амілазна активність сироватки при гострому панкреатиті зумовлена в основному Р-амілазою, то при підвищенні кліренсу загальної амілази підвищується кліренс Р-амілази. При гострому панкреатиті рівень амілази сироватки й показник амілазо-креатинінового кліренсу звичайно підвищені за рахунок пригнічення ниркового механізму канальцевої реабсорбції амілази. При захворюваннях, що мають «замаскований» під панкреатит перебіг, уміст амілази сироватки крові може збільшуватися, але показник амілазо-креатинінового кліренсу залишається нормальним, оскільки відсутній канальцевий дефект. Дуже важливо для цього дослідження брати кров і сечу в один і той самий час. Незмінний або навіть знижений амілазо-креатиніновий кліренс виявляється також при деяких непанкреатичних захворюваннях, що супроводжуються гіперамілаземією, зокрема при захворюваннях слинних залоз і макроамілаземії.

При хронічному панкреатиті активність амілази в крові та сечі підвищується (у 10–88 % та у 21–70 % хворих відповідно) в період загострення процесу і при порушенні відтоку панкреатичного соку (запалення, набряк голівки підшлункової залози, здавлювання проток та ін.). При склеротичній формі панкреатиту гіперамілаземія визначається також ступенем порушення прохідності проток і функціональною здатністю частини залози, що залишилася. Для підвищення чутливості дослідження активності амілази крові й сечі при хронічному панкреатиті рекомендується проводити їх аналіз у першу добу перебування хворого в стаціонарі, потім не менше 2 разів після інструментальних досліджень (фіброгастродуоденоскопія, рентгенологічне дослідження шлунка й кишечника та ін.), а також у момент посилення болю в животі. При цьому чутливість тесту підвищується від 40 до 75–85 %.

При хронічному панкреатиті з фіброзними змінами підшлункової залози загострення супроводжуються порівняно невеликим підйомом активності амілази.

Унаслідок порушення функціональної здатності підшлункової залози гіперамілаземія нерідко може бути відсутньою при гострому гнійному панкреатиті (при обширних «тотальних» некрозах підшлункової залози). При раку підшлункової залози іноді підвищується рівень амілази в крові та сечі; в інших випадках їх активність може бути в межах норми або навіть знижена.

Оцінювання результатів дослідження активності амілази в крові та сечі утруднене тим, що фермент міститься у слинних залозах, товстій кишці, скелетних м’язах, нирках, легенях, яєчниках, маткових трубах, передміхуровій залозі. Тому рівень амілази може бути підвищений при цілому ряді захворювань, що мають подібну картину до гострого панкреатиту: гострому апендициті, перитоніті, перфоративній виразці шлунка й дванадцятипалої кишки, кишковій непрохідності, холециститі, а також при феохромоцитомі, діабетичному ацидозі, після операцій з приводу вад серця, після резекції печінки, при прийманні великих доз етанолу, вживанні препаратів опію, сульфаніламідів, морфіну, пероральних контрацептивів. Підвищення амілазної активності при цих захворюваннях зумовлене низкою причин і має у більшості випадків реактивний характер. Унаслідок значних запасів амілази в ацинарних клітинах будь-яке порушення їх цілісності або найменше утруднення відтоку секрету підшлункової залози може призвести до значного потрапляння амілази у кров. У хворих на перитоніт збільшення амілазної активності є наслідком розмноження бактерій, що синтезують амілазу. Звичайно активність альфа-амілази при перелічених захворюваннях підвищується в крові у 3–5 разів.

Активність слинної амілази збільшується в сироватці крові при пневмоніях, стоматитах, невралгії лицьового нерва, паркінсонізмі, раку легені, яєчника, гострому інфаркті міокарда, черепно-мозковій травмі, діабетичному кетоацидозі. Проте це збільшення не буває значним. Зменшення слинної амілази відмічається при психічному збудженні або депресії, при анацидному стані шлункової секреції.

Незважаючи на те що гіперамілаземія майже постійно супроводжується гіперамілазурією, визначення активності альфа-амілази сечі не завжди може бути точним показником діагностики, оскільки вихід амілази в сечу пов’язаний із функцією нирок. Дослідження активності альфа-амілази в добовій сечі – більш надійний біохімічний тест виявлення захворювання підшлункової залози, ніж дослідження, що базуються на аналізуванні її разової порції. Після того як активність альфа-амілази крові після нападу панкреатиту повертається до норми, вона може залишатися підвищеною в сечі до 7 діб.

З великою постійністю гіперамілазурія виявляється при гострому панкреатиті, загостренні хронічного панкреатиту, обструктивному хронічному панкреатиті, паротиті.

Підвищення активності альфа-амілази в сироватці крові у хворих із хронічними захворюваннями нирок і гострою уремією можна пояснити зменшенням або припиненням виділення ферменту через нирки. Визначення активності альфа-амілази в крові та сечі може дати деякі висновки про функціональний стан ниркового фільтра. У хворих, що страждають на нефротичний синдром, гломерулонефрити та ін., активність альфа-амілази збільшена, в той час як у сечі вона різко знижена. Коефіцієнт «активність альфа-амілази крові/ активність альфа-амілази сечі» є показником функціональної повноцінності ниркового фільтра.

У деяких пацієнтів може мати місце висока амілазна активність сироватки крові через низьку екскрецію ферменту із сечею. Характерно, що при цьому ниркова фільтрація в нормі. Цей симптомокомплекс пояснюється зв’язуванням амілази із сироватковими білками або з агрегацією ферменту. Макромолекулярні комплекси, що мають амілазну активність, позначаються як макроамілаза. Це найчастіше результат зв’язування амілази з імуноглобулінами (амілаза–IgA). У зв’язку з наявністю в крові пацієнта макроамілази можуть виникати проблеми при інтерпретації результатів. Справа в тому, що ця форма може існувати в крові багато років і виявлятися як у пацієнтів із нормальною, так і підвищеною активністю амілази. У випадках гіперамілаземії цей комплекс визначається в 3–10 % випадків. Розмір молекули макроамілази (210 кДа) набагато більший, ніж α-амілази, в результаті вона не потрапляє в сечу й акумулюється в крові незалежно від клінічного стану хворого. Є дані, що за наявності макроамілази визначення панкреатичного ізоферменту методом імунопреципітації може дати хибнопозитивний результат. Це відбувається тому, що макроамілазні комплекси не зв’язуються антитілами і, отже, визначаються на другому етапі як панкреатична амілаза. Вплив макроамілази на кінцевий результат визначення активності панкреатичного ізоферменту вважається помилкою методу, що виникає через неможливість повного зв’язування амілази із слинних залоз відповідними антитілами. Макроамілаземія може бути діагностована методом ультрацентрифугування, електрофорезу, гель-хроматографії, запропонований також простий тест преципітації комплексу поліетиленгліколем. Кожний випадок виявлення макроамілазних комплексів у пацієнта повинен бути зафіксований в історії хвороби, і пацієнт повинен бути інформований про це.

Гіпоамілаземія в клінічній практиці зустрічається рідко. Вона відмічається у хворих на захворювання печінки (гепатити, цирози), злоякісні пухлини (особливо за наявності метастазів у печінку), при обширних опіках шкіри, цукровому діабеті, гіпотиреозі, загальному розладі харчування, зниженні маси тіла, кахексії, а також під впливом інтоксикації (наприклад, при токсикозі вагітних). Зниження активності альфа-амілази найчастіше свідчить про недостатність екзокринної функції підшлункової залози. До зменшення активності ферменту призводить введення в організм цитратів і оксалатів.

Незважаючи на велику різноманітність запропонованих методів визначення активності альфа-амілази, вони можуть бути об’єднані в 3 групи:

• амілокластичні;

• глюкокластичні;

• хромогенні.

У амілокластичних методах вимірюють розпад крохмального субстрату, використовуючи турбо-диметричний, йодометричний або нефелометричний принципи. Йодометричні методибазуютьсяна здатності надлишку негідролізованого субстратудавати в реакції з йодом забарвленісполуки. Інтенсивність забарвлення залежить від складу субстрату: молекули декстринів, що мають більше 30 гексозних залишків, дають червоне забарвлення; молекули, що складаютьсяіз 45 гексозних залишків, забарвлених продуктівуреакціїіз йодом не дають. Залежність забарвлення від властивостей і складу крохмального субстратуставить питання про його уніфікацію. Активність ферменту визначаютьзаспадомоптичної густини субстратупісля гідролізу амілазою.

Хромогенні методи. Інша група методів визначення активностіальфа-амілази базується на використанні хромогенних нерозчинних субстратів. Хромогенний субстрат – полісахарид, який унаслідок ковалентного зв’язування з барвником стає нерозчинним. Методи відрізняються як субстратом (крохмаль, амілопектин, амілоза), так і зв’язаним із ним барвником. α-Амілаза гідролізує субстрат із утворенням розчинного хромогену. Після зупинення реакції нерозчинний субстрат, що не прореагував, видаляють центрифугуванням і в супернатанті визначають оптичну густину хромогену; для кращої відтворюваності бажано провести фільтрування супернатанту. Активність ферменту розраховують порівняно зі стандартом (препаратом альфа-амілази) або контрольною сироваткою з відомою активністю ферменту, враховуючи спонтанний гідроліз хромогенного субстрату. Одиницю активності альфа-амілази в цій групі методів розраховують за коефіцієнтом екстинкції хромогену.

Глюкокластичні методи.Останнім часом набули поширення сахарогенні методи визначення активності альфа-амілази, що базуються на ферментативному визначенні продукту реакції – глюкози. Субстрат і ферменти, що сприяють утворенню глюкози, відрізняються в комерційних наборах різних фірм. Широкого застосування набули методи з використанням УФ-спектроскопії.

У цих методах утворення цукрів поєднане з відновленням НАД, активність альфа-амілази визначають за швидкістю збільшення абсорбції при довжині хвилі 340 нм, зумовленої формуванням НАДН. Ферментативні методи визначення активності альфа-амілази особливо зручні за наявності автоматичного автоаналізатора, вони дозволяють використовувати мікрокількості (2-5 мкл) біологічного матеріалу, прості у виконанні. Проте вони не позбавлені недоліків, обумовлених складом субстратуі комплексомпов’язаних реакцій; проміжні продукти можутьвикривити кінцевий результат.