Клеточная инженерия

Под клеточной инженерией понимают метод конструирования клеток нового типа на основе их культивирования, гибридизации и реконструкции.

К у*л ь т у р а клеток — метод сохранения жизнеспособ­ности клеток вне организма в искусственно созданных условиях жидкой или плотной питательных сред. Использование культуры клеток начато в 50-е годы нашего столетия, когда была показана возможность выращивания вирусов в культивируемых клетках. Затем развитие вирусологии и методов культивирования клеток животных и человека позволило ученым приступить к созданию вирусных вакцин.

Для культивирования могут быть использованы клетки опухо­левых тканей, клетки различных органов, лимфоциты, фибро-бласты, эмбрионы, клетки почек животных и человека, раковые клетки человека и т. д. Культуры, приготовленные непосредст­венно из тканей организма, называются первичными. В большин­стве случаев клетки первичной культуры можно перенести из культуральной чашки и использовать для получения вторичных культур, которые можно последовательно перевивать в течение недель и месяцев. Многие клетки при этом сохраняют признаки дифференцировки тех тканей, из которых они были получены. Например, фибробласты продолжают секретировать коллаген, клетки скелетных мышц эмбриона сливаются и образуют гигант­ские мышечные волокна, которые спонтанно сокращаются в чашке для культуры тканей, и т. д. Так как все это происходит в культуре, то является доступным для изучения с помощью при­емов, которые неприемлемы при работе с интактными тканями.

Клетки животных и человека выращивают на специальных средах в виде суспензии или монослоя на стекле. Технология культивирования некоторых клеток животных настолько хорошо отработана, что может быть использована в производственных целях для получения различных продуктов. В настоящее время клонировано много генов, кодирующих синтез белков разной

110

биологической ценности. Некоторые из таких генов удалось перенести в клетки животных, и они стали продуцентами биоло­гически активных белков. В промышленных масштабах в биоре­акторах с использованием клеток животных налажено производ­ство таких белков. Они используются как медицинские препара­ты. Например, эритропоэтин (гормон, стимулирующий образование красных кровяных тел), активатор плазминогена (используется для предотвращения образования тромбов), фак­тор свертывания крови III (используется при гемофилии), инсу­лин (для лечения диабета), поверхностный белок вируса гепатита В, интерлейкины и др.

Соматическая гибридизация. Одним из важных направлений клеточной инженерии является гибридизация соматических кле­ток. Сущность ее заключается в соединении клеток с хромосом­ными наборами систематически далеких форм.

Впервые гибриды соматических клеток обнаружил в I960 г. французский биолог Ж. Барский. В культуре ткани клеток двух линий мышей он выявил третий тип клеток. Клетки эти оказа­лись гибридными. Они содержали хромосомы клеток обеих ис­ходных линий. Морфологические и биохимические признаки гибридных клеток были промежуточными между признаками ис­ходных. Однако спонтанное слияние клеток наблюдается редко. В связи с этим разработана техника гибридизации соматических клеток с использованием вируса Сендай. Вирус инактивируют ультрафиолетовыми лучами или алкилирующим мутагеном. Инактивированный вирус вносят в смешанную культуру двух типов клеток. Некоторые клетки при этом сливаются с образова­нием одной с двумя ядрами. После митотического деления из двухъядерной клетки формируются две одноядерные гибридные соматические клетки. В каждой гибридной клетке содержится по одному набору хромосом каждого типа родительских клеток.

При помощи вируса Сендай к настоящему времени получены гибриды клеток многих далеких видов (мыши и курицы, мула и мыши, кролика и обезьяны, человека и курицы, коровы и норки и др.). Гибридные клетки могут размножаться в течение длитель­ного времени, но межвидовая несовместимость имеет место и при соматической гибридизации. Так, в культуре клеток с тече­нием времени образуются клоны, которые почти совсем или совсем утрачивают хромосомы второго вида. Это явление откры­вает возможности для изучения локализации и характера дейст­вия тех или иных генов.

Можно изучить клеточный клон, в котором сохранилась толь­ко одна хромосома другого вида, и по наличию или отсутствию в клетке определенных соединений решить вопрос, имеется ли в той или иной хромосоме определенный ген. Можно установить, какой, например, фермент прекращает вырабатывать клетка при утрате той или иной хромосомы. На этом основании можно

111

Антиген 7. 3

Антигенная

детерминанта

(зпнтоп)

Лимфоциты

клешни мивламы ГГФГ

Слияние д полиэтилен -гликоле

-У Среда ГАТ ОтВор гибридных клеток

*€>

Антиген АнтисыЬаротка

Клон!

Анти-

определить, что ген, кодирующий данный фермент, сцеплен с ушедшей хромосомой. Таким путем была определена локализа­ция многих генов в определенных хромосомах человека.

Соматическая гибридизация может быть использована для картирования хромосом, а также для изучения регуляции дейст­вия генов, дифференцировки клеток в онтогенезе и механизма взаимодействия ядра и цитоплазмы.

ГИБРИДОМНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Введение антигена (бактерий, вирусов и т. д.) вызывает обра­зование разнообразных антител против многих детерминант антигена. В 1975 г. Г. Кёлер и К. Мильштейн (лауреаты Нобе­левской премии) получили моноклональные антитела с помощью гибридомной технологии.

Моноклональные антитела — это иммуноглобулины, синтези­руемый одним клоном клеток. Моноклональное антитело связы­вается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

Гибридомная технология — слияние с помощью полиэтиленгли-коля лимфоцитов селезенки предварительно иммунизированных организмов определенным антигеном с миеломными (раковыми) клетками, способными к бесконечной пролиферации (делению). Гибридные клетки селекционируют в среде ГАТ (среда, содержа­щая гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Неслившиеся лим­фоциты погибают в любой тканевой культуре. Миеломные клетки на этой среде также погибают, так как они были дефектны по ГГФТ (гипоксантин-гуанозин-фосфорибозилтрансферазе). Отби­рают клоны клеток, синтезирующие необходимые антитела (рис. 28). Нужные клоны можно хранить в замороженном состоянии.

Таким образом, гибридомы представляют собой бессмертные клоны клеток, синтезирующие моноклональные антитела.

Получение и использование моноклональных антител — одно из существенных достижений современной иммунологии. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество. В медицине меченные изотопами или иным способом монокло­нальные антитела можно использовать для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Получены моноклональные антитела к различным возбудителям: малярии, трипаносомозу, лейшманиозу, токсо-плазмозу и др. Ученые считают, что в самом ближайшем буду­щем моноклональные антитела займут доминирующее положе­ние в диагностике болезней. Для использования в терапии моно­клональные антитела можно соединять с лекарством (например, с токсическими веществами) благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам

112

Отбор Вариантов и размножение желательных* клинад(1,4)

| Выращивание \ в массовой

культуре

Смешанные антитела

Манокланалыные антитела

Рис. 28. Получение моноклональных антител (по Милыптейну, 1982)

или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Можно использовать моно­клональные антитела (против Н — Y-антигена) для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развития, а также для стандартизации методов типирования тка-

113

ней при трансплантации органов, при изучении клеточных мем­бран (так были изучены антигены Т-лимфощггов), для постро­ения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней.

ЭМБРИОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Эмбриогенетическая инженерия — это активная перестройка генома животных путем вмешательства в их развитие на самых ранних стадиях онтогенеза. Перестройка генома — это рекон­струкция эмбрионов путем клонирования, слияния или непо­средственной инъекции в их ядра чужеродной ДНК. Однако получение эмбриональных клонов, химер или трансгенных жи­вотных возможно лишь в результате успешной трансплантации реконструированного эмбриона.

Трансплантация — метод ускоренного воспроизводства высо­копродуктивных животных путем получения и переноса одного или нескольких эмбрионов от высокоценных животных (доно­ров) менее ценным животным (реципиентам). Использование трансплантации позволяет получать от одной генетически цен­ной самки в десятки раз больше потомства.

Технология трансплантации опирается на крупные достиже­ния в области биологии размножения животных и включает следующие приемы: 1) гормональное вызывание суперовуляции; 2) осеменение доноров семенем производителей, оцененных по качеству потомства; 3) извлечение и оценку качества эмбрионов, сохранение и пересадку или криоконсервирование эмбрионов в жидком азоте, оттаивание и пересадку.

Трансплантацию эмбрионов применяют для следующих целей:

1. размножения генетически ценных особей; с помощью этого метода может быть решен вопрос быстрого создания высокопро­ дуктивных линий и семейств, резистентных к болезням;

2. получения идентичных животных путем разделения ранних эмбрионов. Это дает возможность изучить взаимодействие гено­ тип — среда, выяснить влияние наследственности на хозяйствен­ но полезные признаки. Технология разделения эмбрионов позво­ ляет одну половину полученной бластоцисты подвергнуть глубо­ кому охлаждению, а из другой вырастить животное. Если производитель (из одной половины бластоцисты) окажется гене­ тически ценным, то имеется возможность воспроизвести его копию через определенный промежуток времени;

3. сохранения мутантных генов, малых популяций и генофон­ да пород;

4. получения потомков от бесплодных, но генетически цен­ ных по генотипу животных;

5) выявления вредных рецессивных генов и хромосомных аномалий;

114

6. повышения устойчивости животных к болезням;

7. борьбы с болезнями путем замены импорта и экспорта животных на импорт и экспорт криоконсервированных эмбрио­ нов;

8. акклиматизации импортных животных иностранных пород;

9. определения пола эмбриона и получения животных опреде­ ленного пола;

10. межвидовых пересадок;

11. получения химерных животных, которые развиваются из ранних эмбрионов, сконструированных из бластомеров разных животных.

КЛОНИРОВАНИЕ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Истинные клоны позвоночных животных — амфибий были получены путем пересадки ядер соматических клеток в энуклеи-рованные яйцеклетки. Получение эмбриональных клонов осно­вано на свойстве тотипотентности эмбриональных клеток.

В 1952 г. Р. Бриггс и Т. Кинг разработали метод пересадки ядер соматических клеток зародышей в энуклеированные яйце­клетки лягушек. Дж. Гёрдон в 1962 г. усовершенствовал технику пересадки. Он разрушал ядра яйцеклеток лягушки ультрафиоле­товыми лучами, затем в каждое из яиц вводил ядро из диффе­ренцированной клетки кишечного эпителия плавающего голо­вастика (рис. 29). В ряде случаев такие ядра вызывали развитие генетически идентичных эмбрионов и взрослых лягушек. Впе­рвые были получены истинные клоны позвоночных животных. Затем был использован метод культивирования in vitro клеток кожи взрослых лягушек. Пересадка ядер из таких клеток привела к получению генетических клонов головастиков, но вероятность успеха при трансплантации ядер из клеток кожи взрослых лягу­шек очень мала. При использовании ядер соматических клеток взрослых животных развитие клонов ограничивалось стадией го­ловастиков. Ядра взрослых организмов и даже поздних эмбрио­нов по каким-то причинам утрачивают свои потенции. В послед­ние годы установлено, что в ядрах эритроцитов взрослых амфи­бий имеются гены, контролирующие развитие эмбриона до .стадии головастика, включение таких ядер в цитоплазму ооцитов ведет к реактивации репрессированных участков генома.

В последние 10 лет разработан метод пересадки ядер, соче­тающий приемы микрохирургии и технику слияния клеточных фрагментов, начато проведение опытов по трансплантации ядер у овец и крупного рогатого скота.

Несмотря на сложность проведения работ по трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированную зиготу, проблема эта является актуальной, так как открывает возможности копи-

115

Гй ЯСК

© © © яск

\ \ \

{КС 9

Рис. 29. Серийные ядерные пересадки (по Дж. Гёрдову):

© ©

иксз

ЯСК для ШКСЭ

ЯР — яйцо-реципиент; ГД ЯСК — голо­вастик—донор ядер соматических кле­ток; ЭЯР — энуклеированное яйцо-реци­пиент; ЯСК — ядра соматических клеток; Бл — бластула; КСЭ — клон серийных эмбрионов

рования выдающихся по продуктивности животных и создания стад с высоким генетическим потенциалом.

Клоны можно получить путем разделения эмбрионов на ранней стадии развития. Установлено, что, если количество клеток эмбриона (бластомеров) не превышает 16, они еще не дифференцированы. Это позволяет разъединять эмбрио­ны (бластулы) на 2 и большее число и получать однояйцевых близнецов. К настоящему времени получены монозиготные близнецы телят, жеребят, ягнят и поросят. В перспективе пред­полагается, что обеспечение оптимальных условий для культиви-

116

рования ранних эмбрионов in vitro создаст возможность выращи­вать половинки эмбрионов с последующим неоднократным их разделением, что позволит в значительной степени увеличить число годных для трансплантации зародышей, происходящих от одного эмбриона, и получить более многочисленные клоны эмб­рионов у сельскохозяйственных животных, что будет способство­вать более успешной их селекции.