(По с. М. Гершензону)

справа показано, что кольцевую ДНК векторной плазмиды раз­резают рестриктазой и превращают ее в линейную форму, затем экзонуклеазой цепи укорачивают и концевой трансферазой при­шивают к ним поли-А-последовательности. На последнем этапе соединяют оба типа молекул ДНК и получают гибридную моле­кулу — векторную плазмиду со встроенным в нее синтезирован­ным геном. Разрывы в цепях ДНК воссоединяют лигазой.

В данном случае было известно, какой ген включен в вектор­ную плазмиду. Но в работах по трансгенозу чаще имеют дело со многими фрагментами ДНК, и среди них только единичные включают ген, который подлежит переносу. Для получения фраг­ментов ДНК с определенным геном применяют так называемый способ дробового ружья, который заключается в том, что ДНК механически или ферментами дробится на множество мелких фрагментов, после чего их вслепую гибридизируют с молекулами ДНК вектора. Перед этим ДНК вектора обрабатывают рестрик­тазой для придания им линейной формы и образования липких концов. После введения рекомбинантных молекул в кишечную палочку при помощи селективных сред выделяют те бактерии, в которые попал фрагмент ДНК с нужным геном. Включенный ген обнаруживают по продукту его действия в виде определенно­го вещества (фермент, гормон и т. д.). Размножение в бактериях

107

Генетический код

ДНК лактозного оперона

_I

Lac .Р .0. р-гал

I Химический синтез днк

Ген соматостатина

идентичных рекомбинантных ДНК называется клонированием. Каждый клон бактерий содержит свою рекомбинантную ДНК. Разрабатываются методы, позволяющие производить замены нуклеотидов в ДНК клонированного гена и тем самым изменять свойства кодируемого этим геном белка.

?■ ФРАГМЕНТЫ ДНК,

Xj обработанные рестриктазой

Л

Введение в клетку рекомбинантных молекул и синтез чужерод­ного белка. Чаще всего рекомбинантные молекулы вводятся в клетки бактерий методом трансформации. Сначала клетки бакте­рий с целью повышения их способности поглощать плазмидную ДНК обрабатывают хлористым кальцием или хлористым барием. После этого в клеточную взвесь вводят раствор с рекомбинантны-ми молекулами. Некоторые из этих молекул проникают внутрь клетки, и часть из них, прикрепясь к мембранам клетки, начинает размножаться и функционировать (рис. 26).

ПЛАЗМИДА pSC 101.

1 Действие днк-лигазы

ТРАНСФОРМАЦИЯ

ХРОМОСОМА

ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ БАКТЕРИЯ

ПЛАЗМИДА

ОБРАБОТАННАЯ РЕСТРИКТАЗОЙ

Трансформированные дочерние клетки

Рис. 26. Типичный опыт генетической инженерии (по Beckingeham—Smith, 1975)

108

4аАГщ|аТГ| ГЦТ ГГТ ТГТ ААГ ААЦ ТТЦ ТТТ Т Г

I I I

{ЦТАГ | ГАТ АГТ | ТГТ ГЦТ ТЦА ШТ Щ Г А

tin vivo Som

-Ала-Гли-Цис-Лиз -Асн -Фен -Фен—^ S

ДНК плазмидыpBR 322

Р-гал NH₂-

Трп Лиз

НО-Цис-Сер-Тре -Фен -Тре-обработка цианогенбромидом

фрагменты Д-г<м+М₂-Ала-Гли-Цис-Лиз-Асн-Фен-Фен->.

S Трп

S Лиз

НО-Цис-Сер-Тре-Фен-Тре-^ Активный соматостатин

Рис. 27. Функционирование химически синтезированного гена соматостатина человека в клетках Е. coli (по К. Итакуре и др.)

Одно из наиболее важных для практики направлений генной инженерии — конструирование микроорганизмов-продуцентов нужных веществ. Первыми в этом направлении были исследова­ния К. Итакуры и Г. Боейра с соавт. (1977). Им удалось добить­ся экспрессии гена, кодирующего гормон соматостатин в клетках кишечной палочки (рис. 27). Затем в разных странах клетки кишечной палочки использовались для синтеза ряда белков и гормонов человека и животных: инсулина, интерферонов, гормо­на роста, урокиназы, кальцитонина, альбумина, тимозина и др. В лабораториях А. А. Баева, Ю. А. Овчинникова, М. Н. Колосова, Е. Д. Свердлова и др. осуществлена экспрессия генов, кодирую­щих энкефалин, лейкоцитарный интерферон, брадикинин, сома-тотропин и др.

В последние годы уделяется много внимания созданию генно-инженерных вакцин. Получают антигены из рекомбинантных микроорганизмов или культур клеток, в которые введен опреде­ленный ген возбудителя болезни. Этим методом получен матери­ал для вакцинации против гепатита В, гриппа А, малярии, ящура, бешенства, паравируса свиней и др. В нашей стране произведена обратная транскрипция РНК вируса гепатита А. ДНК, кодирующая вирусный белок гепатита, была пришита к

109

ДНК вируса оспы. В результате ослабленная культура оспы вы­зывает иммунитет против опасной болезни — гепатита. Вакцина проходит производственное испытание.

Штаммы бактерий, продуцирующие вещества, активные в ор­ганизме человека и животных, могут быть использованы для промышленного производства лекарственных препаратов.

В нашей стране ведутся работы по получению методами ген­ной инженерии суперпродуцентов продуктов, свойственных клеткам, таких, как аминокислоты, витамины, ферменты, а также по созданию культур, активно разлагающих нефть, пласт­массы, разрушающих нафталин, фиксирующих азот, и т. д.