Работа 8. Влияние кислотности среды на активность каталазы

Важным свойством ферментов является их лабильность – зависи­мость активности от условий среды: концентрации фермента и суб­страта, температуры, активаторов и ингибиторов, кислотности среды.

Влияние кислотности среды на активность ферментов объясняется непосредственным действием концентрации водородных ионов на свойства каталитического центра, которые определяют образование фермент-субстратного комплекса, на степень ионизации субстрата и ферментативного белка.

Каждый фермент проявляет наибольшую активность только в определенном, характерном для него интервале рН. При отклонении кислотности среды в любую сторону от оптимальной активность ферментов снижается. Для большинства растительных ферментов оптимальной является ней­тральная или слабокислая среда.

Цель работы. Определить активность каталазы при разной ки­слотности среды: естественной для исследуемого материала, слабоще­лочной, кислой.

Ход работы. Берут 3 навески проросших семян по 1 г. При первом анализе навеску рас­тирают в ступке, ничего к ней не добавляя, кроме воды (слабокислая реакция среды). Во втором анализе при растирании семян в ступку добавляют 0,5 г СаСО₃ (слабощелочная среда). При третьем анализе к семенам добавляют 1…2 капли 10 %-ного раствора H₂SО₄ (кислая среда). Далее работу выполняют так же, как в работе 7.

По­лученные результаты записывают в табл. 8 и делают выводы о влиянии кислотности среды на активность каталазы.

Т а б л и ц а 8. Влияние кислотности среды на активность каталазы

Кислотность среды (рН)	Выделилось мл О2 за			Активность каталазы
	1 мин	2 мин	3 мин	мл О2/г·мин	высокая, низкая

Вопросы:

1. Какие факторы влияют на активность ферментов?

2. Как и почему кислот­ность среды влияет на активность ферментов?

3. Укажите оптимум рН каталазы, уреазы, амилазы, аргиназы, пеп­сина.

Материалы и оборудование: проросшие семена злаков, 3 %-ный раствор пероксида водорода, CaCO₃, приборы для определения актив­ности каталазы, ступки с пестиками, весы, стеклянные палочки, часы, мерные цилиндры.

Работа 9. Влияние температуры на скорость гидролиза крахмала амилазами

Ферментативные реакции очень чувствительны к температуре. При повышении температуры от минимальной до оптимальной скорость реакций возрастает, при дальнейшем повышении температуры – она снижается. Это объясняется тем, что ферменты являются белками.

Влияние температуры на скорость фер­ментативных реакций и активность ферментов можно изучить на примере амилаз (класс гидро­лазы, подкласс гидролазы гликозильных соединений), гидролизующих крахмал в прорастающих семенах злаков.

Крахмал – неоднородное вещество, состоящее из двух компонен­тов (амилозы и амилопектина). Амилоза – линейный спиралевидный полимер, у которого остатки α,D-глюкопиранозы соеди­нены гликозидными α(1-4)-связями. Амилоза йодом окрашивается в синий цвет, в горячей воде хорошо растворяется, не образуя клейстера. Амилопектин имеет разветвленное строение, в точках ветвления остатки α,D-глюкопиранозы соединены гликозидными α(1-6)-связями. В горячей воде амилопектин набухает с образованием крахмального клейстера, йодом окрашивается в фиолетовый цвет.

К амилазам относят несколько ферментов, различающихся по ха­рактеру действия. Фермент α-амилаза расщепляет гликозильные α(1-4)-связи внутри молекулы крахмала (эндоамилаза) без определенной закономерности, при этом образуются декстрины, состоящие из не­скольких десятков или сотней глюкозных остатков, и незначительное количество мальтозы и глюкозы. Фермент β-амилаза расщепляет вто­рую от конца молекулы крахмала гликозильную α(1-4)-связь, при этом образуется дисахарид мальтоза. Фермент глюкоамилаза расщепляет последнюю от конца молекулы крахмала гликозильную α(1-4)-связь (экзоамилаза) с образованием глюкозы. Фермент амилопектин-1,6-глюкозидаза расщепляет гликозильные α(1-6)-связи амилопектина с образованием декстринов.

Таким образом, под действием ферментов гидролиз крахмала идет по схеме:

крахмал^{амилопектин-1,6-глюкозидаза} декстрины ^{-амилаза} мальтоза ^{глюкоамилаза} глюкоза

^{α-амилаза мальтаза}

Крахмал окрашивается раствором йода в иодиде калия в синий и фиалетовый цвета, декстрины – в розовый, мальтоза и глюкоза йодом не окрашиваются. Таким образом, по йодной реакции можно определить оконча­ние гидролиза крахмала, протекающего при участии ферментов.

Цель работы. Определить активность амилаз в проросших семе­нах злаков при различных температурах.

Ход работы. Приготовление ферментативной вытяжки. Взвешивают 5 г проросших семян, помещают их в ступку и растирают пестиком в течение 2…3 мин. Затем в ступку приливают 10…15 мл воды и семена про­должают растирать до однородного состояния. Полученную массу фильтруют через вату, жидкость переносят в центрифужные пробирки и центрифуги­руют в течение 3…4 мин при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость аккуратно, не взбалтывая, сливают в чистую сухую пробирку и ис­пользуют для опыта.

Приготовление индикаторных растворов на крахмал. В 10 про­бирок наливают по 10 мл воды и добавляют по 3 капли раствора йода в растворе йодида калия.

Определение скорости гидролиза крахмала. В одну чистую сухую пробирку наливают 10 мл 2 %-ного раствора крахмального клейстера, в другую – 1 мл вытяжки амилазы. Обе пробирки помещают в водяную баню заданной температуры (температуру поддерживают в течение всего опыта путем приливания горячей воды). Через 10 мин крахмальный клейстер быстро переливают в пробирку с вытяжкой, содержимое перемешивают и опять помещают в эту же водяную баню, отмечая время начала гидролиза. Затем берут первую пробу на крах­мал – 3…4 капли смеси крахмала с амилазой вносят в пробирку с ин­дикаторным раствором. Все это нужно сделать быстро, так как сразу после внесения крахмального клейстера в вытяжку начинается ее гид­ролиз, особенно интенсивно идущий при оптимальных температурах. Последующие пробы на крахмал ориентировочно берут при 10 С – через 5 мин, при 20 С – 3 мин, при 30 С – 2 мин, при 40…70 С – 1 мин.

Гидролиз крахмала идет постепенно. По мере гидролиза изменя­ется окраска индикаторных растворов при добавлении в них смеси крахмального клейстера с вытяжкой. В первой пробе, куда добавлен еще негидролизованный крахмал, будет синяя окраска. При после­дующих пробах промежуточные продукты гидролиза крахмала – дек­стрины будут давать окрашивание от сине-фиолетового до розового. Конечные продукты гидролиза – мальтоза и глюкоза не дают реакции на йод (окраска остается слабо желтой). После этого отмечают время окончания гидролиза крахмала и рассчиты­вают активность амилаз по формуле:

Х = ,

где Х – активность амилаз, выраженная количеством мл крахмала, гидролизованного 1 мл вытяжки амилазы за 1 час;

10 – количество мл крахмала, гидролизованного 1 мл вытяжки амилазы при определенной температуре;

60 – коэффициент перевода минут в часы;

Т – время гидролиза 10 мл крахмала при заданной температуре, мин.

Полученные результаты записывают в табл. 9.

Т а б л и ц а 9. Время гидролиза крахмала и активность амилаз при различных температурах

Температура, С	Время гидролиза крахмала, мин	Активность амилазы (мл крахмала/1 мл амилазы·час)
10
20 и т.д.

На основании полученных результатов строят график зависимости активности амилаз от температуры и делают выводы.

Вопросы:

1. Из каких компонентов состоит крахмал, особенности их строения и свойства?

2. Какие ферменты гидролизуют крахмал в растениях (класс, подкласс, характер действия, продукты реакции)?

3. На чем основан метод определения активности амилаз?

4. Как и почему температура влияет на активность ферментов?

Материалы и оборудование: проросшие семена пшеницы, ячменя или другие, 2 %-ный раствор крахмального клейстера, 0,3 %-ный раствор йода в 3 %-ном растворе йодида калия, штативы с пробирками, во­ронки, вата, центрифуга, фарфоровые стаканы на 0,5…1 л, пипетки мерные на 10 мл, пипетки глазные, весы, ступки с пестиками, термо­метры, часы.