Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка

Белки – сложные органические азотсодержащие полимерные со­единения, состоящие из аминокислот. Аминокислоты в белках соеди­няются ковалентными пептидными связями, возникающими при взаи­модействии аминогруппы одной аминокислоты с карбоксильной группы другой аминокислоты. Свободные амино- и карбоксильные группы диаминомонокарбоновых и моноаминодикарбоно­вых аминокислот и другие боковые радикалы белков определяют их кислотно-основные свойства (амфотерность) и заряд. Проявление этих свойств зависит от кислотности среды.

В кислой среде, в результате подавления диссоциации свободных карбоксильных групп, белки заряжаются положительно, т.е. стано­вятся катионами:

В щелочной среде подавляется диссоциация свободных амино-групп, молекулы белков заряжаются отрицательно и ведут себя как анионы:

Кислотность среды, при которой устанавливается ра­венство положительных и отрицательных зарядов и белок становится электронейтральным, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). Белки, у которых ИЭТ находится в кислой среде, называются кис­лыми. Белки, у которых значение ИЭТ находится в щелочной среде, называются основными. У большинства растительных белков ИЭТ находится в слабокислой среде.

В изоэлектрической точке белок обладает наименьшей раствори­мостью и легко выпадает в осадок при воздействиях, снижающих гид­ратацию его молекул (добавлении органических растворителей или солей). При этом молекулы белка слипаются, образуя более крупные частицы, и выпадают из раствора в виде осадка.

Цель работы. Определить значения ИЭТ белков различных фрак­ций (альбуминов, глобулинов, глютелинов, проламинов).

Ход работы. В 8 пронумерованных пробирок приливают воду, 0,01 н. или 0,1 н. раствор уксусной кислоты в количествах, указанных в табл. 5 и тщательно перемешивают, получая растворы с различ­ными значениями рН. В каждую пробирку приливают по 1 мл раствора белка и содержи­мое пробирок перемешивают. Затем в пробирки добавляют по 2 мл ацетона или спирта, снова перемешивают содержимое и оставляют на 30…40 мин при комнатной температуре. При значении рН, равном или близком к ИЭТ белка, раствор мутнеет или из него выпадает осадок. В таблице 5 отмечают интенсивность помутнения раствора (+), выпадение осадка (++) или его отсутствие (–). ИЭТ белка устанавливают по кислотности среды в пробирке, в которой выпадает больше осадка, либо в которой интен­сивность помутнения раствора наибольшая.

Т а б л и ц а 5. Схема приготовления растворов с различными значениями рН и результаты опыта

Номер пробирки	Внесено в пробирки, мл			рН	Помутнение (+), образование (++) или отсутствие (–) осадка
	воды	0,01 н. СН3СООН	0,1 н. СН3СООН
1.	8,40	0,60	-	5,9
2.	7,75	1,25	-	5,6
3.	8,75	-	0,25	5,3
4.	8,5	-	0,50	5,0
5.	8,0	-	1,0	4,7
6.	7,0	-	2,0	4,4
7.	5,0	-	4,0	4,1
8.	1,0	-	8,0	3,8

После выполнения работы сравнивают значения изоэлектрической точки анализируемых белков и делают выводы об их аминокислотном составе и свойствах.

Вопросы:

1. Как классифицируют белки (по строению и составу)?

2. Назовите свойства и функции белков.

3. Что понимают под изоэлектрической точкой белка? Значение этого показателя?

Материалы и оборудование: растворы белков или белковых фракций семян зерновых и зернобобовых культур (1,0 г белковых пре­паратов растворяют в 20 мл 0,5 н. раствора СН₃СООNа при нагревании на водяной бане, объем доводят водой до 100 мл), белок куриного яйца (разводят в 10 раз водой и фильтруют через два слоя марли), 0,1 н. рас­твор СН₃СООН (6 мл ледяной уксусной кислоты разбавляют водой до литра), 0,01 н. раствор СН₃СООН (0,1 н. раствор СН₃СООН разбав­ляют в 10 раз), этиловый спирт или ацетон, пробирки, штативы.