Работа 7. Газометрическое определение активности каталазы растительных тканей

В процессе окисления ряда веществ в растениях под действием ок­сидаз образуется пероксид водорода, повышенные концентрации кото­рого токсичны для организма. Под действием фермента каталазы про­исходит обезвреживание пероксида водорода путем его разложения на воду и молекулярный кислород:

2Н₂О₂  2Н₂О + О₂

Каталаза – двухкомпонент­ный фермент класса оксидоредуктаз, состоящий из белка и простетической группы, относя­щейся к Fе-порфиринам (4 пирольных кольца образуют порфирино­вое ядро, в центре которого находится атом железа). Каталаза содер­жится в живых клетках всех организмов, кроме облигатных анаэробов.

Газометрический метод определения активности каталазы основан на учете объёма кислорода, выделившегося при воздействии на перок­сид водорода водными экстрактами растительных тканей, содержащих фермент. Определение проводят на специальном приборе – каталаз­нике (рис. 1), состоящем из конической колбочки (1), пробирки с боковым отвер­стием (2), бюретки на 50 мл (3), крана (4), стеклянной груши (5).

	1 2 3 4 5
Рис. 1. Прибор для определения активности каталазы

Цель работы. Определить активность каталазы в различных рас­тительных объектах.

Ход работы. Отвешивают 1,0 г растительного материала (семена, корнеплоды, клубни, листья), помещают их в ступку, добавляют для нейтрализации естественной кислотности 0,5 г СаСО₃ и тщательно растирают. Затем в ступку приливают 3 мл воды и продолжают расти­рать растительную массу до однородного состояния. Растертый мате­риал аккуратно, без потерь, используя стеклянную палочку, переносят в коническую колбочку прибора, трижды обмывая ступку и пестик водой (по 5 мл). Притертую поверхность конической колбочки тща­тельно очищают от растертого материала влажной фильтровальной бумагой. В пробирку прибора через боковое отверстие наливают 5 мл 3 %-ного раствора пероксида водорода и прибор проверяют на герме­тичность.

Проверка герметичности прибора.

1. Установить уровень воды в бюретке на ноль, передвигая стек­лянную грушу на штативе.

2. Закрыть кран бюретки и вставить пробирку в коническую колбу. При этом уровень воды в бюретке снизится и, если все соедине­ния прибора герметичны, установится на некоторой отметке.

3. При отсутствии герметичности уровень воды в бюретке будет медленно повышаться. В последнем случае нужно устранить причину негерметичности прибора (повреждение трубок, несоответ­ствие пробирки и колбы, наличие остатков растительной ткани на при­тертой поверхности пробирки или колбы).

Определение активности каталазы.

1. После проверки герметичности прибора кран открыть – уровень воды в бюретке установится на ноль, после чего кран следует снова закрыть.

2. Снять грушу со штатива и удерживать ее в положении, при кото­ром уровень воды в бюретке будет оставаться на исходном (нуле­вом) значении.

3. Через боковое отверстие в пробирке выливают пероксид водо­рода в колбу с растертой массой, содержащей каталазу, и отмечают время начала реакции.

4. Колбу, держа за горлышко и прижимая пробирку указательным пальцем, непрерывно встряхивают в течение всего опыта. Выделяю­щийся при реакции кислород вытесняет воду из бюретки в грушу. Для устранения противодавления воды, грушу следует перемещать вниз, следя, чтобы уровень воды в груше и бюретке был одинаковым.

5. Опыт выполняют в течение 3 мин, записывая объем выделяе­мого кислорода за каждую минуту в табл. 7.

Т а б л и ц а 7. Результаты определения активности каталазы

Исследуемый материал	Выделилось мл О2 за			Активность каталазы
	1 мин	2 мин	3 мин	мл О2/г·мин	высокая, низкая

После окончания опыта делают вывод об активности каталазы в различных растительных тканях.

Вопросы:

1. К какому классу ферментов относится каталаза? Укажите осо­бенности её строения и роль.

2. На чем основан газометрический метод определения активно­сти каталазы?

Материалы и оборудование: растительный материал (листья, зерно и другие), 3 %-ный раствор Н₂О₂ (пероксид водорода), CaCO₃, при­бор для определения активности каталазы, ступки с пестиками, весы, стеклянные палочки, часы, мерные цилиндры.