Работа 6. Обнаружение дегидрогеназ в растительных тканях

Скорость и направленность всех биохимических реакций, проте­кающих в живых клетках, регулируется биокатализато­рами белковой природы – ферментами. По строению ферменты делят на однокомпо­нентные и двухкомпонентные. Однокомпонентные состоят только из белка, в состав двухкомпонентных входит белко­вая часть (апофер­мент) и небелковая часть (простетическая группа или кофермент). Не­белковые части могут иметь различную химическую природу, чаще это нуклеотиды (НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД, КоА), витамины (В₁, В₂, В₆, РР и другие) или их произ­водные, микроэлементы (Fe, Cu, Zn, Mo и другие). Каждый фермент имеет активный центр, в котором происходит связы­вание и превращение субстрата. Некоторые ферменты имеют аллостерические центры, регулирующие активность ферментов.

Отличительными свойствами ферментов являются: высокая ка­талитическая активность, специфичность действия (катализируют строго определенные химические реакции), лабильность (зависимость активности от условий среды), обратимость действия (катализируют прямые и обратные реакции), не дают побочных продуктов (100 %-ный выход конечных продуктов реакции).

Все ферменты в зависимости от характера катализируемых реак­ций делят на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстанови­тельные реакции (дегидрогеназы, оксидазы, цитохромы).

2. Трансферазы – катализируют реакции переноса различных ради­калов или молекул (гликозилтрансферазы, ацил- и ацетилтрансферазы, аминотрансферазы).

3. Гидролазы – катализируют реакции гидролиза сложных органи­ческих соединений на простые (эстеразы, карбогидразы, протеазы).

4. Лиазы – катализируют реакции негидролитического расщепле­ния веществ (С-С-лиазы, С-N-лиазы, С-S-лиазы).

5. Изомеразы – катализируют реакции изомеризации (рецемазы, эпимеразы).

6. Лигазы (синтетазы) – катализируют реакции синтеза сложных веществ из простых (С-С-лигазы, С-N-лигазы, С-S-лигазы).

Основным типом окислительно-восстановительных реакций в жи­вых клетках является перенос водорода, при окислении веществ – отнятие водорода (дегидри­рование) и при восстановлении – присоединение водорода (гидриро­вание). Ферменты, катализирующие эти реакции относятся к классу оксидоредуктаз и называются дегидрогеназами. Реакции протекают по схеме:

АН₂ + В ^{дегидрогеназа} А + ВН₂

Дегидрогеназы – двухкомпонентные ферменты, коферментами ко­торых являются соединения нуклеотидного типа: НАД⁺ и НАДФ⁺ (пиридиновые коферменты), ФАД и ФМН (флавиновые коферменты). Действие дегидрогеназ лежит в основе таких важнейших физиологиче­ских процессов как фотосинтез и дыхание. Представителями дегидро­геназ являются изоцитратдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, сукци­натдегидрогеназа, алкагольдегидрогеназа, катализирующие окисление соответственно щавелево-уксусной, яблочной, янтарной кислот и эти­лового спирта. Дегидрогеназы делят на анаэробные (переносят водород на промежуточные переносчики) и аэробные (переносят водород на кислород воздуха).

В основе метода обнаружения дегидрогеназ лежит их способность восстанавливать метиленовую синь водородом, отщепляемым от окисляемых веществ, до бесцветной лейкоформы.

Цель работы. Обнаружить действие и активность анаэробных де­гидрогеназ в прорастающих семенах бобовых культур или других рас­тительных объектах.

Ход работы. Обнаружение дегидрогеназ. С 10…20 набухших се­мян гороха, фасоли или люпина снимают кожуру, каждое семя делят на две семядоли, помещая их в разные пробирки. В одной пробирке семена заливают водой и кипятят 5 минут. Затем горячую воду сли­вают, и семена в обеих пробирках заливают раствором метиленовой сини на 10 мин. После этого окрашенные семена промывают, и в про­бирки заливают дистиллированную воду до верха. Для создания ана­эробных условий пробирки закрывают резиновыми пробками и поме­щают в водяную баню или термостат при температуре 30 С на 1,0…1,5 часа. В течение опыта наблюдают за окраской семян, измене­ние которой связано с действием анаэробных дегидрогеназ.

В живых семенах дегидрогеназы отнимают водород от окисляемых веществ и передают его метиленовой сини, адсорбированной на их поверхности. Метиленовая синь при этом восстанавливается и перехо­дит в бесцветную лейкоформу. По окончании опыта воду из пробирок сливают и семена высыпают в фарфоровые чашки. На воздухе обес­цвеченные живые семена снова приобретают синюю окраску.

Объясните причину потери активности ферментов при кипячении и появления синей окраски в живых семенах на воздухе.

Определение активности дегидрогеназ. Отвешивают 1 г расти­тельного материала (проросших семян, клубня картофеля, корнеплода редьки) и растирают в ступке, приливая 5 мл раствора К₂НРО₄. Растер­тую массу переносят в разные пробирки, добавляют 1 мл раствора ме­тиленовой сини, хорошо перемешивают, поверхность заливают тонким слоем масла. Подготовленные пробирки помещают в водяную баню с температурой 30 С, отмечая время начала опыта. В течение опыта наблюдают за изменением окраски растительных тканей и определяют время, в течение которого произойдет их полное обесцвечивание. По­лученные данные заносят в табл. 6 и определяют активность дегид­рогеназ.

Т а б л и ц а 6. Активность дегидрогеназ растительных тканей

Исследуемый объект	Время проведения опыта, ч		Время обесцвечивания тканей, мин	Активность дегидрогеназ (высокая, низкая)
	начало	окончание

Полученные результаты анализируют и делают выводы.

Вопросы:

1. Какое строение имеют ферменты? Перечислите их свойства и функции.

2. Назовите классы ферментов, дайте краткую характеристику классам.

3. К какому классу относят дегидрогеназы, какие реакции они катализируют и какое строение имеют?

4. Назовите ферменты, катализирующие окисление этилового спирта, пировиноградной, яблочной, янтарной, щавелево-уксусной кислот.

Материалы и оборудование: набухшие и проросшие семена го­роха, фасоли, люпина, клубни картофеля, корнеплоды редьки, 0,005 %-ный раствор метиленового синего, пробирки с пробками, штативы, весы, водяная баня, термометры, препаровальные иглы, пипетки на 1 мл.