37_DFU_2.1 / DFU_Dopolnenie_2cr

-колонка кварцова капілярна розміром 60 м Х 0.25 мм, покрита шаром макроголу 20000р,

-газ-носій: гелій для хроматографії Р,

-лінійна швидкість газу-носія 1 .5 мл/хв,

-поділ потоку 1 : 100.

Витримуютьтемпературу колонки 60 аС протягом 8 хв, потім підвищують температуру зі швидкістю 3 ас/хв до 1 80 ас, температуру 1 80 ас витримують протягом 5 хв. Температура блока вводу проб і детектора 270 ас.

Хроматографують близько 1 .0 мкл розчину порівнян­ ня. Порядок виходу піків має відповідати порядку за­ значення речовин у складі розчи ну порівняння . Відмічають часи утримування цих субстанцій.

Хроматографічна система вважається придатною, якщо число теоретичних тарілок, розраховане для піка-каріофілену при температурі 1 10 ас становить не менше 30000; коефіцієнт розділення піків евгенолу та ацетилевгенолу становить не менше 1 .5.

Хроматографують \ .0 мкл випробовуваної субстанції. Використовуючи часи утримування, визначені із хро­ матограми розчину порівняння, визначають положен­ ня компонентів розчину порівняння на хроматограмі випробовуваного розчину. Не враховують пік розчин­ ника.

Вміст кожного із трьох компонентів, у відсотках, ви­ значають методом внутріщньої нормалізації.

Вміст компонентів, увідсотках, маєзнаходитисяу та­ кихмежах:

-{З-каріофілен: від 5.0 % до 14.0 %,

-евгенол: від 75.0 % до 88.0 %,

-ацетилевгенол: від 4.0 % до 1 5.0 %.

ЗБЕРІГАННЯ

У захищеному від нагрівання місці.

ГЕНТАМІЦИНУ СУЛЬФАТ

Gentamicini sulfas

GENTAMICINSULPHATE

ІR1

HN"

RЗ ,

Сум іш сул ьфатів антибіотиків, продукованих Micromonospora ригригеа, "'основними компонентами яких є гентаміцини С І , С І а, С2, С2а та С2Ь.....

Вміст: не менше 590 М О/мг, у перерахунку на безвод­ ну речовину.

ВЛАСТИ ВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору.

,..Гігроскопічний.....

Розчинність. Легко розчинний у воді Р, практично не розчинний у 96 % спирті Р.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

Перша ідентифікація: С, D.

Друга ідентифікація: А, В, D.

А. Близько 1 0 мг субстанції розчиняють в 1 мл води Р і додають 5 мл розчину 400 г/л кислоти сірчаної Р. На­ грівають на водяній бані протягом 100 хв, охолоджу­ ють і доводять об'єм розчинуводою Рдо 25 мл. Ультра­ фіолетовий спектр поглинання (2.2.25) одержаного розчину в області від 240 нм до 330 нм не повинен мати жодного максимуму.

В. Тонкошарова хроматографія (2.2.27).

Випробовуваний розчин. 25 мг субстанції розчиняють у воді Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинни­ ком до 5 мл.

Розчин порівняння. ,..Вміст віали....ФСЗгентаміцинуСУЛЬ­

фату розчиняють у воді Рі доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 5 мл.

,..Пластинка: ТШХпластинка із шаром силікагелю Р.....

Рухома фаза: нижній шар суміші рівних об'єміврозчи­ ну аміаку концентрованого Р, метанолу Р, метилен­ хлориду Р.

Проби, щонаносяться: І О мкл (50 мкг) випробовуваного розчину та 10 мкл (50 мкг) розчину порівняння.

Відстань, що має пройти рухома фаза: ,..2/3 довжини

пластинки.....

Висушування: на повітрі.

Виявлення: обприскують розчином нінгідрину РІ і на­ грівають при температурі 1 10 ОСлротягом 5 хв.

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчи­ ну мають виявлятися три основні плями на рівні трьох основних плям на хроматограмі розчину порівняння, що відповідають їм за розміром і забарвленням.

с. Переглядають хроматограму, одержану у випробу­ ванні « Компонентний склад».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчи­ ну мають виявлятися 5 основних піків, що мають ті самі часи утримування, що і 5 основних піків на хро­ матограмі розчи ну порівняння (а).

о. Субстанція дає реакцію (а) на сульфати (2.3. 1).

ВИПРОБУВАН НЯ НА Ч ИСТОТУ

Розчин s. 0.8 г субстанції розчиняють у воді, вільній від вуглецю діоксиду, Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 20 мл.

Прозорість розчину (2.2. 1). Розчин S має бути прозо­ рим.

Кольоровість розчину (2.2.2, метод 11). Забарвлення розчину S має бути не інтенсивнішим за еталон 6 шка­ ли найбільш підхожого кольору.

рИ (2.2.3). Від 3.5 до 5.5. Вимірюють рН розчи ну S.

Питоме оптичне обертання (2.2. 7). Від + 1070до + 1 2 1 0,

у перерахунку на безводну речовину.

2.5 г субстанції розчиняють у воді Р та доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 25.0 мл.

,..КомпонентниЙсклад. Рідинна хроматографія (2.2.29): використовують метод внутрішньої нормалізації; до розрахунку беруть тільки піки, що відповідають ген­ таміцинам С І , С І а, С2, С2а, С2Ь; дЛЯ ідентифікації піків використовують хроматограму ФеЗгентаміцину сульфату.

Випробовуванийрозчин. 50 мг субстанції розчи няють у рухомій фазі та доводять об'єм розчину тією самою рухомою фазою до 1 00.0 мл.

Розчин порівняння (а). Вміст віали ФСЗ гентаміцину сульфату розчиняють у рухомій фазі та доводять тією самою рухомою фазою до одержан ня розч ину

0.5 мг/мл.

Розчин порівняння (Ь). 5.0 мл розчину порівняння (а) доводять рухомою фазою до об'єму 100.0 мл.

Колонка:

-розмір: 0.25 м х 4.6 мм,

-нерухома фаза: соnолімер стирол-дивінілбензолу Р

(8 мкм) із розміром пор І ОО нм,

-температура: 55 ос.

Рухома фаза: суміш: вода, вільна відвуглецю діоксиду, Р, щО містить 60 г/л натріюсульфатубезводного Р, 1 .75 г/л натріюоктансульфонату Р, 8 мл/л тетрагідрофурану р, 50 мл/л 0.2 Мрозчинукаліюдигідрофосфату, рН якого попередньо доводять до 3.0 кислотою фосфорноюроз­ веденою Р та дегазують.

Швидкістьрухомоїфази: 1 .0 мл/хв.

Пост-колонковий розчин: розчин натрію гідроксиду,

вільний від карбонату, Р, розведений І :25, попередньо дегазований, що подається без пульсації у струмінь рухомої фази після колонки із використанням по­ лімерної спіралі місткістю 375 мкл.

Швидкість подаваннярозчину: 0.3 мл/хв.

Детектор: пульсуючий амперометричний детектор або аналогічний із золотим індикаторним електродом, хлорсрібним електродом порівняння та допоміжним електродом із нержавіючої сталі, що розташований у тілі комірки; витримують потенціал + 0.05 V детекто­ ра, + 0.75 V електорода окиснення, - 0. 1 5 v електрода відновлення із пульсацією, що визначена для даного детектора.

Об'єм проби, що вводиться: 20 мкл.

Час хроматографування: у 1 . 2 рази більше часу утри­ мування гентаміцину С І .

Придатність хроматографічної системи: розчи н по­ рівняння (а):

-відношення Нр до Н• має становити не менше 2.0, де Нр - висота піка гентаміцину С2а над базовою лінією, Н• - висота над базовою лінією самої низь­ коїточки хроматограми між піком гентаміцину С2а

іпіком гентаміцину С2.

Нормування:

-гентаміцин СІ: від 20.0 % до 40.0 %,

-гентаміцин Сlа: від 10.0 % до 30.0 %,

-сума гентаміцинів С2, С2а, С2Ь: від 40.0 % до 60.0 %,

-не враховують: піки, площа яких відповідає площі піка гентаміцину С І на хроматограмі розчину порівняння (Ь).

Супровіднідомішки. Рідинна хроматографія (2.2.29), як зазначено у випробуванні « Компонентний склад» .

Нормування: (ДЛЯ супровідних домішок, що елююють­ ся перед гентаміцином С l а):

-будь-яка домішка: не більше 3.0 %,

-сума домішок: не більше 1 0.0 %.

Метанол (2.4.24, система В). Не більше 1 .0 %. АІІІ

Сульфати. Від 32.0 % до 35.0 %, у перерахунку на без­ водну речовину.

0.250 г субстанції розч иняють у І ОО мл води дистильованої Р і доводять рН розчину до 1 1 розчином аміаку концентрованим Р. ДО одержаного розчину до­ дають 10.0 мл 0. 1 М розчину барію хлориду, близько 0.5 мг фталеїнового nурnурового Р і титрують 0. 1 Мроз­ чином натрію едетату, додаючи 50 мл 96 % спирту Р,

коли забарвлення розчину почне змінюватися, і про­ довжують титрування до зникнення фіолетово-бла­ китного забарвлення.

1 мл 0. 1 Мрозчинубаріюхлориду відповідає 9.606 мг S04'

Вода(2.5. 12). Не більше 1 5.0 %. Визначення проводять із 0.300 г субстанції.

Сульфатна зола (2.4. 14). Не більше 1 .0 %. Визначен ня проводять із 0.50 г субстанції.

Бактеріальні ендотоксини (2. 6. 14). Менше

"-0.71 МО/МГАІІІяк, що субстанція призначена для ви­ робництва лікарських засобів для парентерального за­ стосування без подальшої процедури видалення бак­ теріальних ендотоксинів.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧЕННЯ

В изначення проводять мікробіологічним методом

(2. 7.2).

ЗБЕРІГАННЯ

У повітронепроникному контейнері. Я кщо субстанція стерильна, її зберігають у стерильному, повітронепро­ н икному контейнері з контролем першого розкриття.

"-ДОМІ Ш КИ

Сnецифіковані домішки: А, В, С.

Інші домішки, що виявляються (дані домішки, якщо вони наявні у достатній кількості, можуть визначати­ ся тим або іншим випробуванням монографії. Їх вміст нормується загальноприйняти ми критеріями для інших/неспецифікованих домішок і/або загальною монографією Субстанції для фармацевтичного засто­ сування. Тому немає необхідності Їх ідентифікувати, щоб показати відповідність вимогам. Див. також 5. 10.

Контроль домішок у субстанціях для фармацевтичного застосування): D, Е.

А. 2-деокси-4-0- [3-деокси-4-С-метил-3-(метиламі­ но)- -L-арабінопіранозил]-6-0-(2,6-діаміно-2,3,4,6-

тетрадеоки -а-D-гліцеро-гекс-4-єнопіранозил) -L­ стрептамін (сісоміцин),

В. 2-деокси-4-0- [3-деокси -4-С-метил-3-(метиламі­ HO)- -L-арабінопіраНОЗИЛ]-L-стрептамін (гарамін),

__ 0- ( > - NH2

R'

"

С. R = СНз, R' = ОН : 4-0-(6-аміно-6,1-дидеОКСИ-D­

гліцеро-а-D-глюко-гептопіранозил)-2-деокси-6-0-[3- деокси-4-С-метил-3-(метиламіНО)- -L-арабінопірано­ ЗИЛ]-D-стрептамін (гентаміцин ВІ)'

D . R = Н, R' = N H2 : 2-деокси-4-0-[3-деокси-4-С-ме­

тил-3-(метиламіно)- -L-арабінопіранозил]-6-0-(2,6- діаміно-2,6-дидеокси-а-D-глюко-гексопіраНОЗИЛ)-L­ стрептамін,

E. 2-деоксистрептамін.АІІІ

HEPARINSODIUM

Гепарин натрію - препарат, що містить натрієву сіль сульфатованого глюкозаміноглікану, яка наявнау тка­ нинах ссавців. При повному гідролізі субстанція ви­ вільнює D-глюкозамін, кислоту D-ГЛЮКУРОНОВУ, кис­ лоту L-ідуРОНОВУ, кислоту оцтову та кислоту сірчану. Субстанція має характерну здатність затримувати згор­ тання свіжозібраної крові.

Активність гепарину натрію, призначеногодля вироб­ ництва лікарських засобів для парентерального засто­ сування, має бути не менше 1 50 МОІмг, у перерахунку на суху реч:овину. Активність гепарину натрію, не при­ знач:еногодля виробництвалікарських засобів для па­ рентерального застосування, має бути не менше

1 20 МОІмг, у перерахунку на суху реч:овину.

ВИРОБНИЦТВО

Субстанцію одержують із легенів великої рогатої ху­ доби або зі слизової оболонки кишеч:ника великої ро­ гатої худоби, свиней або овець.

Спосіб виробництва субстанції має виключити або звести до мінімуму вміст речовин, що знижують кров'яний тиск.

ВЛАСТИВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору. Гігроскопіч:ниЙ.

Розчинність. Легко розчинний у воді Р.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

А. Субстанція має затримувати згортання рекальци­ фікованої із використанням цитрату плазми овець, як зазнач:ено в розділі « Кількісне визнач:ення».

Подають електрич:нийструм напругою від 1 мАдо 2 МА на 1 см ширини смужки при різності потенціалів 300 V протягом 1 0 хв. Забарвлюють смужки розчином 1 гjл толуїдинового синього Р, надлишок якого видаляють промиванням.

Відношення електрофоретичної рухливості основної смуги (смуг) на електрофореграмі випробовуваного розчину до електрофоретич:ної рухливості смуги на електрофореграмі розчину порівняння має бути від0.9

до 1 . 1 .

D. Залишок, одержаний у випробуванні «Сульфатна зола», як зазначено в розділі «Випробування на ч:ис­ тоту» , має давати реакцію (а) на натрій (2.3. 1).

В И ПРОБУВАННЯ НА Ч ИСТОТУ

Прозорість розчину (2.2. /). Кількість субстанції, екві­ валентну 50000 МО, розч:иняють У воді Р і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 1 О мл. Одер­ жаний розч:ин має бути прозорим.

Кольоровість розчину (2.2.2, метод /1). Забарвлення розч:ину, приготованого для випробування « Прозорість розч:ину» , має бути не інтенсивнішим за еталон 5 шка­ ли найбільш підхожого кольору.

рИ (2.2.3). Від 5.5 до 8.0. 0. 1 г субстанції розчиняють у

воді, вільній відвуглецю діоксиду, Р і доводять об'єм роз-

ч:ину тим самим розчинником до 1 О мл.

Білкові та нуклеотидні домішки. 40 мг субстанції роз­ ч:иняють у 1 О мл води Р. Оптич:на густина (2.2.25) одер­ жаного розчину, виміряна задовжини хвилі 260 нм, не має перевищувати 0.20; оптична густина, виміряна за довжини хвилі 280 нм, не має перевищувати 0. 15 .

Азот. Не більше 2.5 %, у перерахунку насуху реч:овину. Визначення проводять із 0. 1 оо г субстанції методом

визначення азоту після мінералізації сірчаною кисло­ тою (2.5.9).

"атрій. Від 9.5 % до 1 2.5 % (Na), у перерахунку на суху речовину. Визначення проводять методом атомно-аб­ сорбційної спектрометрії (2.2.23, метод f).

Випробовуваний розчин. 50 мг субстанції розчиняють у

0. 1 М розчині кислоти хлористоводневої, що містить

1 .27 мг цезіюхлориду Рв 1 мл і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 1 00.0 мл.

Розчини порівняння. Розчини порівняння із вмістом 25 ррт, 50 ррт і 75 ртт Na, готують відповідними розведеннями еталонного розчину натрію . (200ррт Na) Р 0. 1 Мрозчином кислоти хлористоводне­ вої, що містить 1 .27 мг цезіюхлориду Р в 1 мл.

Вимірюють поглинання одержаних розчинів задовжи­ ни хвилі 330.3 нм, використовуючи як джерело ви­ промінювання лампу із порожистим натрієвим като­ дом і полум'я підхожого складу (наприклад, 1 1 л повітря і 2 л ацетилену протягом 1 хв).

Важкі метали (2.4. 8, метод С). Не більше 0.003 % (30 ррт). 0.5 г субстанції мають витримувати випро­

бування на важкі метали. Еталон готують із викорис­ танням 1 .5 мл еталонногорозчину свинцю (10ррт РЬ) Р.

Втратав масі привисушуванні(2.2.32). Не більше 8.0 %. 1 .000 г субстанції сушать при температурі 60 аС над фосфору(V) оксидом Р і тиску не більше 670 Па протя­ гом 3 год.

Сульфатназола (2.4. 14). Від 30 % до 43 %. Визначення проводять із 0.20 г субстанції, у перерахунку на суху речовину.

Бактеріальніендотоксини (2.6. 14). Менше О.01 МО/МО гепарину, якщо субстанція призначена для виробниц­ тва лікарських засобів для парентерального застосу­ вання без подальшої процедури видалення бактеріаль­ них ендотоксинів.

КІЛЬКІСН Е ВИЗНАЧ ЕН НЯ

Визначення проводять як зазначено у статті (2. 7.5).

Визначувана активність має бути не менше 90 % і не більше 1 1 1 % від заявленої активності. Довірчий інтер­ вал похибки визначуваної активності (Р = 0.95) має бути не менше 80 % і не більше 125 % від заявленої ак­ тивності.

ЗБЕРІГАН НЯ

У повітронепроникному контейнері. Якщо субстанція стерильна, її зберігають у стерильному, повітронепро­ никному контейнері з контролем першого розкриття.

МАРКУВАННЯ

На етикетці зазначають:

-кількість МО/мг;

-назвута кількість доданої субстанції.

ГЕПАРИНИ НИЗЬКОМОЛЕКУЛЯРНІ

Нерагіпа massae molecularis minoris

HEPARINS, WW-MOLECUUR-MASS

Солі сульфатованих глюкозаміноглюканів із серед­ ньою (за масою) відносною молекулярною масою мен­ ше 8000, не менше 60 % загальної маси яких мають відносну молекулярну масу менше 8000. Низькомоле­ кулярні гепарини мають різну хімічну структуру на кінцях полісахаридних ланцюгів, що відновлюють, та що не відновлюють.

Активність не менше 70 М О активності анти-фактора Ха у міліграмі, у перерахунку на суху речовину. Відно­ шення активності анти-фактора Ха до активності анти-фактора І Іа, визначене, як зазначено в розділі

«Кількісне визначення» , становить не менше 1 .5.

ВИ РОБН И ЦТВО

Н изькомолекулярні гепарини одержують шляхом фракціонування або деполімерізації гепарину природного походження, що відповідає вимогам монографії

Гепарин натрію або монографії Гепарин кальцію, що придатні для парентерального застосування, якшо не зазначене інше. Для кожного типу низькомолекуляр­ ного гепарину відтворюваність якості серій забезпе­ чують доведенням, наприклад, того, що середня (за масою) відносна молекулярна маса та масова частка гепаринів із відносною молекулярною масою менше 8000 становить не менше 75 % і не більше 1 25 % серед­ нього значення, наведеного у відповідній специфі­ кації. Такі самі межі застосовують для відношення ак­ тивності анти-фактора Хадо активності анти-фактора І Іа.

Нуклеотидні та білкові домішки у вихідній сировині.

40 мг вихідної сировини перед фракціонуванням роз­ чиняють у 1 0 мл водиР. Оптична густина (2.2.25) одер­ жаного розчину, виміряна за довжин хвиль 260 нм і 280 нм, має бути не більше 0.20 і 0. 1 5, відповідно.

ВЛАСТИ ВОСТІ

Опис. Порошок білого або майже білого кольору. Гігроскопічний.

Розчинність. Легко розчинний у воді Р.

ІДЕНТИФІ КАЦІЯ

А. Спектрометрія ядерного магнітного резонансу

(2.2.33).

Підготування зразка. 0.200 г субстанції розчиняють у суміші 0.2 мл дейтерію оксиду Р і 0.8 мл води Р.

Зразокпорівняння. 0.200 г підхожоro стандартного зраз­ ка відповідного низькомолекулярного гепарину роз­

чиняють у суміші 0.2 мл дейтерію оксиду Р і 0.8 мл во­ ди Р.

Умови випробування: використовують імпульсний спек­ трометр із Фурьє-перетворювачем, що працює за час­ тоти 75 М Гц для 13с. Спектр записують при темпера­ турі 40 ОС, використовуючи комірки діаметром 5 мм тадейтерованийметанол Ряк внутрішній стандартпри

0 50.0 (м.ч.) ррт.

Результати: одержаний спектр має відповідати спек­ тру підхожого стандартного зразка відповідного низь­ комолекулярного гепарину.

В. Відношення активності анти-фактора Ха до актив­ ності анти-фактора І Іа, визначене, як зазначено в розділі « Кількісне визначення» , становить не менше

1 .5.

С. Ексклюзивна хроматографія (2.2.30).

Випробовуваний розчин. 20 мг субстанції розчиняють у 2 мл рухомої фази.

Розчин порівняння. 20 мг ФеЗ гепаринунизькомолекуляр­ ного для калібрування розчиняють у 2 мл рухомої фази.

Колонка:

-розмір: 0.30 м х 7.5 мм;

-нерухома фаза: підхожий пористий силікагель із розміром частинок 5 мкм, іздіапазоном фракціонуван­ ня для білків близько від 1 5000 до 100000;

-число теоретичнихтарілок: не менше 20000 на метр.

Рухома фаза: розчин 28 .4 г/л натрію сульфату безвод­ ного Р, рН якого доводятьдо 5.0 килотою сірчаноюроз­ веденою Р.

Швидкістьрухомоїфази: 0.5 мл/хв.

Детектор: диференціальний рефрактометричний.

Об'єм проби, що вводиться: 25 мкл.

Калібрування. Використовуютьдиференціальний раф­ рактометричний детектор (RI), з'єднаний із УФ-спек­ трофотометричним детектором (UV). Вимірювання проводять за довжини хвилі 234 нм. UV-детектор при­ єднаний до виходу із колонки, R І-детектор приєдна­ ний до виходу із UV-детектора.

Якщо необхідно, точно вимірюють час затримки між 2 детекторами, так щоб хроматограми, одержані з їх допомогою, були співставлені правильно.

Фактор нормалізації, що використовують для розра­ хунку відносної молекулярної маси із відношення RI/UV, обчислюють таким чином: розраховують за­ гальну площу піків UV234-хроматограми (SUV234) і RI­ хроматограми (SRI) шляхом чисельного інтегрування в досліджуваному діапазоні (тобто, виключають піки

солі та розчинника у кінці хроматограми). Відношен­ ня гобчислюють за формулою:

Фактор/обчислюють за формулою:

Мпа r

де:

Мпа - середня (за масою) відносна молекулярна маса

ФеЗ гепарину низькомолекулярного для калібру­ вання, зазначена у супровідній документації.

Після того, як UV234 і RI відклики вирівняні, відносну молекулярну масу (М) у будь-якій точці обчислюють за формулою:

Кінцева таблиця часів утримування та відносних мо­ лекулярних мас може бути використана для калібру­ вання хроматографічної системи шляхом підбору підхожої математичної залежності до експерименталь­ нихданих. Рекомендується використовувати поліном

3 ступеня. Слідзазначити, щоекстраполяція одержаної калібрувальноїзалежності на більш високі значення мо­ лекулярноїмаси не є коректною.

Хроматографують 25 мкл випробовуваного розчину протягом часу, необхідного для повного виходу піків зразка та розчинника.

Середню (за масою) відносну молекулярну масу обчис­ люють за формулою:

Будь-який низькомолекулярний гепарин, описаний в окремій статті, має відповідати вимогам ідентифіка­ ції С, зазначеним у відповідній монографії.

Я кщо окрема стаття на низькомолекулярний гепарин відсутня, середня (за масою) відносна молекулярна маса має становити не більше 8000 і не менше 60 % загальної маси повинно мати відносну молекулярну масу менше 8000. Крім того, параметри молекулярної маси (середня (за масою) відносна молекулярна маса та масова часткаланцюгів, для яких встановлено межі) мають відповідати відповідним показникам препара­ ту порівняння виробника.

D. Субстанція дає реакцію (а) на натрій або реакції на кальцій (у залежності від вихідної сировини) (2.3. 1).

ВИПРОБУВАННЯ НА Ч ИСТОТУ

рИ (2.2.3). Від 5.5 до 8.0. 0. 1 г субстанції розчиняють у

воді, вільній відвуглецю діоксиду, Рі доводять об'єм роз­ чину тим самим розчинником до 1 0 мл.

Азот (2.5.9). Від 1 .5 % до 2.5 %, у перерахунку на суху речовину.

Кальцій (2.5. /1). Від 9.5 % до 1 1 .5 %, у перерахунку на суху речовину, якщо субстанція одержана із гепарину, що відповідає вимогам монографії Гепарин кальцію. Випробування проводять із 0.200 г субстанції.

ИатріЙ. Від 9.5 % до 12.5 %, у перерахунку на суху ре­ човину, якщо субстанція одержана із гепарину, що відповідає вимогам монографії Гепарин натрію.

Атомно-абсорбційна спектрометрія (2.2.23, метод 1).

Випробовуванийрозчин. 50 мг субстанції розчиняють у

О. J М розчині кислоти X!lористоводневої, що містить

1 .27 мг цезіюX!lориду Р в І мл і доводять об'єм розчину тим самим розчинником до 1 00.0 мл.

Розчини порівняння. Розчини порівняння із вмістом 25 ррт, 50 ррт, 75 ррт Na готують відповідними роз­ веденнями еталонного розчину натрію (200ррт Na) Р 0.1 Мрозчином кислоти X!lористоводневої, що містить 1 .27 мг цезію X!lориду в І мл.

Джерело випромінювання: лампа із порожистим на­ трієвим катодом.

Довжина хвилі: 330.3 нм.

Спосібатомізації: полум'я підхожого складу (наприк­ лад, 1 1 л повітря і 2 л ацетилену протягом І хв).

Молярневідношеннясульфат-іонівдокарбоксилат-іонів

(2.2.38). Не менше 1 .8.

Зразки гепарину, використовувані у даному титру­ ванні, мають бути вільними від здатних до іонізації домішок, зокрема солей.

Зважують 0. 1 00 г субстанції із необхідними застере­ женнями, що пов'язані із гігроскопічністю субстанції, поміщають у близько 20 мл двічі дистильованої у скля­ ному пристрої води Р і охолоджують до температури 4 ас 2.0 мл одержаного розчину вводятьу передколонку (розміром близько І О см х І см), заповнену підхо- .

жою катіонообмінною смолою Р. Промивають колонку двічі дистильованою у скляному пристроїводоюР, про­ мивні води збирають у посудину для титрування до одержання кінцевого об'єму рідини близько І 0- 1 5 мл

(посудина для титруваннямаєбути достатньо великою, щоб вміщати електроди кондуктометра, невелику мішалкуувиглядістрижня та тонкугнучкутрубку, при­ єднану до виходу із бюретки місткістю 2мл). Одержа­ ну рідину перемішують задопомогою магнітної міщал­ ки.

Коли показання кондуктометра стають сталими, за­ писують їх і одержаний розчин титрують 0.05 Мроз­ чином натрію гідроксиду, додаючи порції близько

50 мкл. Відмічають рівень у бюретці та показання кон­ дуктометра через кілька секунд після кожного дода­ вання до досягнення кінцевої точки титрування.

Для кожного вимірювання обчислюють кількість міліеквівалентів доданого натрію гідроксиду із об'єму та відомої концентрації розчину натрію гідроксиду. Будують графік залежності електропровідності (вісьу) від міліеквівалентів натрію гідроксиду (вісЬХ). Графік повинен мати 3 майже лінійні ділянки: початкову - із крутим нисхідним нахилом, середню - із незначним підвищенням, кінцеву - із крутим підвищення. Че­ рез кожну ділянку графіка проводять прямі лінії, що найбільще відповідають експериментальним точкам. У точках перетину 10іта 20;ліній, 20; та ЗОі ліній будують перпендикуляри до осі Х для визначення точки, що відповідає кількості міліеквівалентів натрido гідрокси­ ду. Точка перетину І оі та 20і ліній показує кількість

міліеквівалентів натрію гідроксиду, що витрачена на титрування сульфатних груп. Точка перетину 20і та 30; ліній показує кількість міліеквівалентів, що витраче­ на на титрування сульфатних і карбоксильних груп разом. Різниця між цими значеннями є кількість міліеквівалентів, що витрачена на титрування карбок­ сильних груп.

Важкі метали (2.4.8, метод С). Не більше 0.003 %

(30 ррт). 0.5 г субстанції мають витримувати випро­ бування на важкі метали. Еталон готують із викорис­ танням 1 .5 мл еталонногорозчинусвинцю (10ррт РЬ) Р.

Втратавмасіпривисушуванні (2.2.32). Не більше 10.0 %. 1 .000 г субстанції сушать при температурі 60 ас над фосфору(V) оксидом Р і тиску не більше 0.67 кПа про­ тягом 3 год.

Бактеріальніендотоксини(2.6.14). Менше 0.01 МО/МО анти-Ха активності, якщо субстанція призначена для виробництва лікарських засобів для парентерального застосування без подальшої процедури видалення бак­ теріальних ендотоксинів. Для виконання валідаційних критеріїв може бути необхідним додавання двовален­ тних катіонів.

КІЛ ЬКІСНЕ ВИЗНАЧ ЕННЯ

Антикоагулянтну активність низькомолекулярних ге­ паринів визначають іn vitro за допомогою 2 методик кількісного визначення, за якими визначається здатність гепаринів активувати пригнічення фактора Ха (кількісне визначення анти-Ха) і тромбіну, факто­ ра І Іа (кількісне визначення анти- І Іа) за участю анти­ тромбіну І І І.

Міжнародні одиниці анти-Ха активності та анти-І Іа активності відповідають активності певної кількості

Міжнародного стандарту низькомолекулярного гепа­ рину.

Як стандартний препарат використовують БСЛгепа­ рину низькомолекулярного для кількісного визначення,

калібрований у Міжнародних одиницях шляхом по-

рівняння із Міжнародним стандартним зразком із ви­ користанням двох методик кількісного визначення, що наведені нижче.

АКТИВНІСТЬ АНТИ-ФАКТОРА Ха

Розчини стандартноrо препаратута випробовувані розчини

Готують 4 окремих серії 4 розведеннями субстанції та стандартного препарату у трис(гідроксиметuл)аміно­ метан-натріюхлорид буферномурозчинірН 7.4Р, Їх кон­ центрація має бути від 0.025 МО до 0.2 МО активності анти-фактора Ха у мілілітрі. Вибрані розведення ма­ ють давати лінійну залежність на графіку залежності оптичної густини від log концентрації.

Методика

Маркують 16 пробірок : ТІ' Т2, Тз, Т4для розведень суб­ станції та SI' S2' Sз, S4ДЛЯ розведень стандартного пре­ парату у двох повторюваностях. До кожної пробірки додають 50 мкл розчину антитромбіну ІІІ РІ і 50 мкл відповідного розведення субстанції або стандартного препарату. Після кожного додавання перемішують, не допускаючи утворення бульбашок. Обробляють про­ бірки у такому порядку: SI' S2' Sз, S4' ТІ ' Т2, Тз, Т4, ТІ ' Т2, Тз, Т4, SI' S2' Sз, S4' витримують пробірки при тем­ пературі 37 ос (водяна баня або нагрівальний прилад) протягом І хв, додають у кожну пробірку 1 00 мклроз­ чину фактора Ха бичачого Р, інкубують протягом точ­ но І хв і додають 250 мкл хромогенного субстрату РІ.

Реакцію припиняють через точ но 4 хв, додаючи 375 мкл кислоти оцтової Р. Одержані суміші перено­ сять у напівмікрокювети та вимірюють оптичну гус­ тину (2.2.25) за довжини хвилі 405 нм. У тих самих умовах проводять контрольний дослід із визначення амідолітичної активності на початку та наприкінці випробування, використовуючи замість розчину стан­ дартного препаратута випробовуваного розчину трис­

(гідроксиметил)амінометан-натрію хлорид буферний розчинрН 7.4 Р; 2 одержаних значення не мають знач­ но відрізнятися. Розраховують лінійну залежність оп­ тичної густини від log концентрації розчину субстанції та розчину стандартного препарату й обчислюють ак­ тивність субстанції в МО активності анти-фактора Ха у мілілітрі, використовуючи звичайні статистичні ме­ тоди з використанням моделі паралельних ліній.

АКТИВНІСТЬ АНТИ-ФАКТОРА ІІа

Розчини стандартноrо препарату та випробовувані розчини

Готують 4 окремих серії 4 розведеннями субстанції та стандартного препарату у трис(гідроксиметил)аміно­ метан-натріюхлоридбуферномурозчинірН 7.4Р, ЇХ кон­ центрація має бути від 0.0 1 5 М О дО 0.075 М О актив-

ності анти-фактора І Іа у мілілітрі. Вибрані розведен­ ня мають давати лінійну залежність на графіку залеж­ ності оптичної густини від log концентрації.

Методика

Маркують 1 6 пробірок: ТI , Т2, Тз, Т4для розведень суб­ станції та SІ ' S2' Sз, S4 дЛЯ розведень стандартного пре­ парату у двох повторюваностях. До кожної пробірки додають 50 мкл розчину антитромбіну ІІІ Р2 і 50 мкл підхожого розведення субстанції або стандартного препарату. Після кожногододавання перемішують, не допускаючи утворення бульбашок. Обробляють про­ бірки у такому порядку: SI' S2' Sз, S4' ТІ ' Т2, Тз, Т4, ТІ ' Т2, Тз, Т4, SI' S2' Sз, S4' витримують пробірки при тем­ пературі 37 ос (водяна баня або нагрівальний прилад) протягом 1 хв, додають у кожну пробірку І ОО мкл роз­ чинутромбінулюдського Р, інкубують протягом точно 1 хв і додають 250 мкл хромогенного субстрату Р2. Ре­ акцію припиняють через точно 4 хв, додаючи 375 мкл кислоти оцтової Р. Одержані суміші переносять у на­ півмікрокювети та вимірюють оптичну густину (2.2.25) за довжини хвилі 405 нм. У таких самих умовах прово­ дять контрольний дослід із визначення амідолітичної активності на початку та наприкінці випробування, використовуючи замість розчину стандартного препа­ ратута випробовуваного розчину трис(гідроксuметuл)­

амінометан-натрію хлорид буферний розчин рН 7.4 Р;

2 одержаних значення не мають значно відрізнятися. Розраховують лінійну залежність оптичної густини від log концентрації розчину субстанції та розчину стан­ дартного препарату й обчислюють активність суб­ станції в МО активності анти-фактора І Іа у мілілітрі, використовуючи звичайні статистичні методи із вико­ ристанням моделі паралельних ліній.

МАРКУВАН НЯ

Зазначають:

-кількість М О активності анти-фактора Ха у міліграмі;

-кількість МО активності анти -фактора І І а у міліграмі;

-середню (за масою) відносну молекулярну масу та відсотковий вміст молекул з певним інтервалом мо­ лекулярних мас.

якшо необхідно:

-субстанція є натрієвою сіллю;

-субстанція є кальцієвою сіллю.

ЗБЕРІГАННЯ

У повітронепроникному контейнері із контролем пер­ шого розкриття. Я кщо субстанція стерильна та вільна від бактеріальних ендотоксинів, П зберігають у сте­ рильному й апірогенному контейнері.

ГІБІСКУС

Hibisci sabdariffae f10s

ROSELLE

Цілі або різані, висушені чашечки та підчаші Hibiscus sabdariffaL., зібрані у період плоДоносіння.

Вміст: не менше 1 3.5 % кислот, у перерахунку на кис­ лоту лимонну (С6Н8О7; м.м. 192. 1 ) і суху сировину.

ВЛАСТИ ВОСТІ

Сировина кисла на смак.

ІДЕНТИФІКАЦІЯ

А Чашечка у нижній половині зрослолиста та має фор­ му глечика, у верхній половині розділена на 5 довгих, загострених, відігнутих назад зубців. Зубці маютьопук­ лу середню жилку що злегка видається назовні та ве­ ликий товстий нектарник близько І мм у діаметрі. Підчаша складається із від 8 до 1 2 невеликих оберне­ нояцеподібних листочків, що зрослися з основою ча­ шечки . Чашечка та підчаша м'ясисті, сухі, легко розді­ ляються на частини , від яскраВО-'Jервоного до насичено пурпурового кольору, дещо світліші біля ос­ нови із внутрішнього боку.

В. Сировину подрібнюють на порошок (355) (2.9. 12). Порошок від червоного до пурпурово-червоного ко­ льору. Переглядають під мікроскопом, використову­ ючирозчинх.лоральгідрату Р. У порошку виявляються: забарвлені у червоний колірфрагменти паренхіми, що містить численні друзи кальцію оксалату, та, зрідка, наповнені слизом порожнини, іноді поєднані з бага­ токутними клітинами епідерми та продиховими апа­ ратами анізоцитного типу (2.8.3); численні фрагмен­ ти провідних пучків зі спіральними та сітчастими судинами; волокна склеренхіми із широкими порож­ нинами; зрідка прямокутні пористі клітини паренхі­ ми; фрагменти одноклітинних, гладеньких, звивистих покривних волосків та, зрідка, залозисті волоски; ок­ руглі пилкові зерна із шипуватою екзиною.

С. Тонкошарова хроматографія (2.2.27).

Випробовуванийрозчин. До 1 .0 г здрібненої на порошок сирови н и (355) (2. 9. 12) додають 1 0 мл спирту (60 % об/об) Р, струшують протягом 1 5 хв і фільтрують.

Розчин порівняння. 2.5 мгхінальдинового червоного Рроз­ чиняють у 1 О мл 96 % спирту Р.

Пластинка: тшхпластинка із шаром сuлікагелю Р.

Рухома фаза: кислота оцтова Р - вода Р - бутанол Р

( 1 5:30:60).

Об'єм проби, що наноситься: 20 мкл, смугами.

Відстань, що має пройти рухома фаза: 1 О см від лінії старту.

Висушування: на повітрі.

Виявлення: приденному світлі.

Результати: нижче наведено послідовність зон нахро­ матограмах випробовуваного розчину та розчину по­ рівняння

Верхня частина пл астин ки

Іхінальдиновий червоний: оранжево-червона зона

ВИПРОБУВАН НЯ НА Ч ИСТОТУ

Сторонні домішки (2.8.2). Не більше 2 % фрагментів плодів: червоних сем'яніжок та частин п'ятигніздної коробочки із жовтаво-сірим оплоднем, тонкі стінки якого складаються із кількох шарів по-різному направ­ лених волокон; сплюснутого, ниркоподібного насіння зі штрихованою поверхнею.

Втратавмасіпривисушуванні (2.2.32). Не більше 1 1 .0 %. 1 .000 г здрібненої на порошок сировини (355) (2.9. 12) сушать при температурі 1 05 ОС протягом 2 год.

Загальна зола (2.4. 16). Не більше 1 0.0 %.

Забарвлюваність. 1 00 г сировини здрібнюють на гру­ бий порошок ( 1400) (2. 9. 12) і перемішують. 1 О г одер­ жаної суміші здрібнюють на порошок (355) (2.9. 12). 1 .0 г здрібненої на порошок сировини (355) (2.9. 12) поміщають у колбу місткістю 1 00 мл, додають 25 мл киплячоїводи Рі нагрівають на водяній бані протягом 1 5 хв при енергійному струшуванні. Одержану гарячу суміш фільтрують у мірну колбу місткістю 50 мл; кол­ бу місткістю 1 00 мл і фільтр послідовно обполіскують трьома порціями, по 5 мл кожна, теплої води Р, охо­ лоджують і доводять об'єм розчину водою Рдо 50 мл.

5 мл одержаного розчину доводять водою Рдо об'єму 50 мл. Вимірюють оптичну густину (2.2.25) одержано­ го розчину за довжини хвилі 520 нм, використовуючи воду Р як компенсаційну рідину. Оптична густина має становити не менше 0.350 для цільної сировини та не менше 0.250 для здрібненої сировини.

КІЛЬКІСНЕ ВИЗНАЧ ЕННЯ

1 .000 г здрібненої на порошок сировини (355) (2. 9. 12)

струшують із 1 ОО мл води, вільноївідвуглецю діоксиду, Р

протягом 1 5 хв і фільтрують. До 50.0 мл одержаного фільтрату додають 1 ОО мл води, вільноївідвуглецю діок-