posobie_hirurg_sepsis

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

митогены и специфические антигены; установление цитотоксичности (ЕК- клеток и Т-киллеров);

v тесты 3-го уровня включают: определение активности энзи- мов (аденозиндезаминазы, пуриннуклеозидфосфорилазы), ассоциированных с иммунодефицитными состояниями; определение синтеза цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, В-ростовых факторов и др.); выявление уровня гормонов тимуса в сы- воротке крови и других биологических жидкостях; анализ фагоцитоза, хемо- люминесценции, поглощения и киллинга бактерий, их адгезии и хемотак- сиса; определение системы комплемента; анализ смешанных клеточных структур с целью оценки иммуноглобулинпродуцирующей функции В-лим- фоцитов; генетический и цитологический анализ хромосомного материала.

Наряду с таким подходом, А.Н. Чередеевым и Л.В. Ковальчуком (1997) предложены: принципы изучения иммунного статуса, основанный на патогенетической оценке дефектов иммунной системы, и, с этих же позиций, подходы к его коррекции. Принципы состоит в изучении и оценке основных

этапов иммунного ответа – распознавания, активации, пролиферации, дифференцировки и иммунорегуляции.

При этом, для оценки

распознавания - определяется ответ в смешанной культуре лимфоцитов, оценивается кооперация макрофагов и лимфоцитов при распо- знавании специфического антигена;

активации – определяется экспрессия HLA-DR-антигенов, ре- цепторов к ИЛ-2, трансферрина, активность цАМФ, цГМФ, Са2+ и т.д.;

пролиферации – определяется характер пролиферативного от- вета на митогены (фитогемагглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса, липополисахарид) и антигены (туберкулин, кандидин, трихофитин);

дифференцировки – по цитотоксическим тестам определя- ется лизис клеток-мишеней Т-лимфоцитами, макрофагами, нейтрофилами и ЕК-клетками;

иммунорегуляции – изучается синтез макрофагами цитоки- нов, метаболитов арахидоновой кислоты, проводится анализ субпопуляций Т-клеток, В-лимфоцитов и других клеток, выполняющих медиаторные функ- ции.

В основе данного способа лежит концепция позитивной или негативной клеточной активации. Известно, что позитивная активация пред- ставляет собой нормально протекающий процесс активации лимфоцитов, за- вершающийся реализацией их эффекторных функций. При негативной акти- вации (характерной для сепсиса), процесс активации лимфоцитов заканчива- ется апоптозом, представляющим собой генетически запрограммированную клеточную гибель. В связи с этим, ключевым звеном оценки негативной ак-

тивации является выявление апоптозных маркеров на иммунокомпетентных клетках. К таким маркерам относятся FAS-антиген, мембранный белок, ко-

66

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

дируемый bcl-2. Для этого же должен быть установлен характер экспрессии р 53 или экспрессии У-антигена на мембране Lewis, а также выраженность апоптозной фрагментации ДНК.

Установлено, что при соответствующей микробной нагрузке (на на- чальном этапе сепсиса) активированные нейтрофилы и моноциты начинают выделять противовоспалительные цитокины, простагландины, лейкотриены, фактор активации тромбоцитов (Platelet Activation Factor или PAF), кисло- родные радикалы со строго определённым временным интервалом. Так, кон- центрация ФНО-α нарастает в течение первых 12 часов и сохраняется на этом уровне на протяжении 48 часов, а затем снижается. «Пик» концентрации ИЛ- 6, являющегося регулятором антителопродукции, приходится на исход пер- вых суток (24 часа) и сохраняется на таком уровне до 48 часов, после чего содержание этого медиатора уменьшается. При этом ИЛ-6 стимулирует син- тез и высвобождение в системную циркуляцию белков острой фазы воспале- ния (СРБ, фибриногена, α2-макроглобулина и др.). Последние связываются с отдельными микроорганизмами, в состав мембран которых входит фосфо- рилхолин. Образовавшийся комплекс активирует систему комплемента по классическому пути, что способствует опсонизации микроба и облегчает его фагоцитоз. При этом ИЛ-6 синтезируется в ответ на увеличение в крови кон- центрации ИЛ-1 и ФНО-α. По данным J. Friedland с соавт. (1992) содержание ИЛ-6 в плазме крови больных сепсисом более 1000 нг/мл сопровождается ле- тальностью 75%.

Уменьшение содержания основных цитокинов после 48 часов объяс- няется компенсаторным выбросом некоторых противовоспалительных ме- диаторов (ИЛ-10, простагландина Е2 и др.) моноцитами и Т-хелперами 2-го типа. При этом ИЛ-10 действует через цАМФ, ингибируя избыточную про- дукцию ФНО-α и выступая в роли потенциального медиатора, запускающего компенсаторный противовоспалительный ответ. Лизоцим, выбрасываемый моноцитами и нейтрофилами, разрушает бактерии с формированием боль- шого количества липополисахаридов. Липополисахаридные комплексы за- пускают альтернативный путь активации комплемента – уменьшается содер- жание С3, увеличивается концентрация С3а при постоянном уровне С4. Про- дукты лизиса бактерий и цитокины активируют рецепторы адгезии нейтро- филов на эндотелии (CD 11b/CD 18). Этот процесс наиболее выражен в пер- вые 6 часов при молниеносной форме сепсиса, сопровождающейся практиче- ски абсолютной летальностью. Увеличение продукции CD 11b/CD 18 на по-

верхности нейтрофилов может служить маркером септического процесса ещё до появления бактериемии.

Наступление летального исхода от сепсиса коррелирует с некото-

рыми закономерностями:

v у больных отмечается постоянно высокая концентрация С4- компонента системы комплемента, свидетельствующая о непрерывном «за- пуске» этой системы от комплексов «антиген-антитело»;

67

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

v более 48 часов сохраняется высокий уровень противовоспа- лительных медиаторов, обуславливающий внутрисосудистую генерализо- ванную реакцию; повреждение эндотелия с увеличением сосудистой прони- цаемости капилляров и уменьшением ОЦК, микротромбозами и блокадой микроциркуляции; прогрессирование анаэробного метаболизма и клеточной дисфункции.

Высокие концентрации в биологических средах организма ФНО-α, ИЛ-1, γ-ИФ и эндотоксина вызывают усиленный синтез NO в эндотелии, макрофагах, нейтрофилах нейронах мозга, ведя к уменьшению сосудистого сопротивления и развитию гипотензии. Всё это способствует формированию полиорганной дисфункции.

В свою очередь, этот процесс сопровождается существенным увели- чением количества противовоспалительных цитокинов. Их избыток ведёт к возникновению феномена эндотоксиновой толерантности моноцитов, т.е. на- рушению их способности реагировать на бактериальные стимулы. Этот фе- номен отмечается при значительном уменьшении HLA-DR (в норме этот по- казатель должен быть более 50%).

При грамположительном сепсисе маркером неблагоприятного про- гноза заболевания может служить увеличение у больных концентрации ре- цептора моноцитов (CD 14). Оно указывает на миелоидную дифференциа-

цию антигенных структур на поверхности зрелых моноцитов и повышение экспрессии на моноцитах CD 16-антигена (Fc-рецептора). Важно отметить, что даже в случае генерализованного грамположительного сепсиса не ис-

ключено влияние на организм больного грамотрицательного эндотоксина вследствие транслокации последнего из кишечника в системный кровоток. При этом развивается картина микст-инфекции, когда нельзя уже ориентиро- ваться на клинический анализ крови (лимфоцитоз или лимфопению), и очень опасна неправильная интерпретация результатов микробиологического ис- следования. в такой ситуации, независимо от результатов оценки гемокуль- туры, для лечения сепсиса необходимо использовать антибактериальные препараты или их комбинации, влияющие как на грамнегативные, так и на грампозитивные возбудители.

При развитии сепсиса регистрируется депрессия специфического ан- тителообразования (чаще всего, на вторые сутки после операции). Само опе- ративное вмешательство влияет на Т-лимфоциты – оно повышает функцио-

нальную активность Тh2-хелперов, способствуя генерализации инфекцион- ного процесса. Активация Тh1-хелперов при этом способствует развитию септического шока.

Изучение гуморального звена иммунитета при сепсисе выявило сле- дующие закономерности:

v в начальной стадии заболевания у больных сепсисом отмечается увеличение уровня иммуноглобулина G;

68

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

v наиболее характерным для сепсиса является снижение содержа- ния иммуноглобулинов G, M, A на фоне значительного увели- чение концентрации Ig E; увеличение иммуноглобулина Е при

сепсисе носит преходящий (транзиторный) характер и связано с нарушением ИЛ-4-опосредованной регуляции выработки этого класса иммуноглобулинов В-лимфоцитами;

vпри сепсисе отмечается резкое увеличение Ig M-антител к липо- полисахаридному комплексу на начальном этапе заболевания;

vотмечается уменьшение аффинности (снижение интенсивности взаимодействия антигена с антителом) у больных с септиче-

скими осложнениями.

Существует тесная взаимосвязь нервной, гуморальной и иммунной систем, определяемая, в первую очередь, нейроиммунотрансмиттерами – клеточными посредниками, осуществляющими физиологические контакты между клеточными структурами данных систем и отражающими происходя- щие в них изменения.

В настоящее время получила дальнейшее развитие концепция рецеп- торно-лигандовых взаимодействий липополисахаридного комплекса (ЛПСК), выявляемых с помощью иммунохимических реакций. Уровень этих взаимо-

действий определяется интенсивностью образования окисленных везикул (пузырьков), количество которых увеличивается при специфически опосре- дованном эндотелиозе.

При взаимодействии адгезивных рецепторов плазмолеммы эндоте- лиоцитов с ЛПСК бактерий происходит активация эндоцитотоксический ре- акций с дезорганизацией внутриклеточных органелл и цитоскелета. За счёт этого основная структура липополисахаридного комплекса – КДО (2-кето-3- дезокси-Д-манно-октоновая кислота) соединяется со своим специфическим рецептором, липид А – с гликолипидами и фосфолипидами, а полисахарид- ные цепочки – с лектиноподобными рецепторами. Похожее взаимодействие лежит в основе образования специфических контактов ЛПСК с моноци- тами/макрофагами или другими соматическими клетками. При этом часть КДО липополисахаридного комплекса связывается с рецепторами CD-14 данных клеток, а другая часть присоединяется к липополисахарид-связы- вающему белку (binding protein), комплементу или С-реактивному белку.

Этот процесс значительно облегчает их взаимодействия с другими типами клеток. Доказано, что подведение моноклональных антител (МКАТ) к рецеп- торам CD-11в или CD-18, локализованным на нейтрофилах, значительно (почти на 50%) снижает выраженность реакции на ЛПСК. Моноклональные антитела к антигену CD-14 блокирует цитостатический эффект ЛПСК бакте- рий по отношению к различным эндотелиальным клеткам. Связывание ЛПСК грамотрицательных бактерий с иммуноглобулином G при участии Fc- рецепторов полиморфноядерных лейкоцитов обеспечивает антиэндотоксиче- скую защиту организма.

69

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

Учитывая всё вышеперечисленное, авторами настоящего пособия со- вместно с сотрудниками кафедры нормальной анатомии Белорусского госу- дарственного медицинского университета (В.В. Руденок), а также Медицин- ским Университетом и Институтом анатомии г. Любека [Германия] (Univ. Dr. med. Dr. h. c. Wolfgang Kuhnel) по теме «Исследование нейротрансмиттерной пластичности нейронов вегетативной нервной системы», методом непрямой иммуногистохимии выявлен ряд структурных изменений со стороны различ- ных органов и систем человека при абдоминальном сепсисе. Объектами ис- следования служили участки органов и тканей (печени, тонкой и толстой кишки, мезентериальных лимфоузлов), взятые во время операции у больных перитонитом, а также тканевой материал умерших от абдоминального сеп- сиса. Забранные тканевые фрагменты фиксировали в течение 24 часов в рас- творе Замбони (2% параформальдегиде с добавлением 0,2% пикриновой ки- слоты [рН 7,4]). После этого материал последовательно промывали в фос- фатном буфере (0,1 М) и 20%-ном растворе сахарозы. Затем приготавливали криостатные серийные срезы толщиной 8-10 μм. После просушивания (в те- чение 30-60 минут) и промывания в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) препа- раты обрабатывали 10%-ным раствором нормальной козьей сывороткой (Dakopatts; X 907) и помещали на 10 минут в темную увлажненную камеру. По- сле удаления нормальной козьей сыворотки на каждый срез наносили сы- воротку, содержащую антитела против синаптофизина (Synaptophysin, DAKO A010) и нейрофиламента (Neurofilaments coctail, AFFINITI, NA1297). Стёкла помещали на 12 часов в тёмную увлажненную камеру. Затем, после про- мывки в фосфатном буфере, на препарат наносили антисыворотку (CY3TM- conjugated Affiniti Pure Goat Anti-Rabbit IgG; Jacson, N30254) в разведении

1:100 и стекла помещали на 2 часа в увлажненную камеру. После удаления антисыворотки фосфатным буфером срезы помещали в глицерин/фосфатный буфер (3:1) под покровные стекла. В качестве контроля реакцию осуществ- ляли без использования первичных антител. Исследование проводили с по-

мощью микроскопа Axiophot (Zeiss).

Проведенные исследования позволили выявить зависимость струк-

турных изменений нейронов межмышечного кишечного сплетения,

верхнебрыжеечного, поясничных и нижнегрудных симпатических узлов, характера межнейрональных связей от выраженности абдоминального сеп- сиса. Чем дальше заходил патологический процесс, чем более были выра- жены признаки сепсиса и энтеральной недостаточности, тем отмечались бо- лее существеннее иммуногистохимические изменения со стороны нейронов, сопровождающиеся соответствующей перестройкой внутриклеточных орга- нелл и цитоскелета. Эти изменения проявляются резким снижением образо- вания окаймлённых везикул с синаптофизином в реакциях, опосредованных эндоциторецепторами. Иммуногистохимическое исследование тонкой кишки больных перитонитом выявило различные изменения нейронов межмышеч- ного кишечного сплетения в зависимости от стадии патологического про-

70

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

цесса. Чётко определена тенденция уменьшения интенсивности образования в них окаймлённых везикул с синаптофизином – от многочисленных [на на- чальных этапах развития абдоминального сепсиса] до практически полного отсутствия [в терминальной стадии заболевания, при далеко зашедшем сеп- тическом процессе] (рис. 19-21).

В

В

С

Рис. 19. Стенка тонкой кишки при абдоминальном сепсисе в начальную стадию заболевания (энтеральная недостаточность I степени). Окраска иммуногистохимическим способом по К. Wolgang + гематоксили- ном-эозином.

Общее ув. Ð 400 (окуляр Ð 10, объектив Ð 40). Наблюдение авторов.

Примечание: В – везикулы с медиатором (синаптофизином) – скопления об-

ведены кружками; С – артериола с пристеночными тромботическими масса-

Существенную информацию о состоянии иммунной системы у боль- ных сепсисом может дать углубленное изучение антигенраспознающего Т- клеточного рецептора, учитывая тот факт, что Т-клетки с γ/δ-рецепторами осуществляет первую линию защиты организма от патогенной микрофлоры.

Чем большей информативностью будет обладать диагностика нарушений иммунной системы при сепсисе, тем более эффективной и результативной окажется проводимая иммунотропная терапия.

71

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

6.1. ОЦЕНКА ПРОЯВЛЕНИЙ СИНДРОМА СИСТЕМНОГО ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА И ЕГО ТИПОВЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ ХИРУРГИЧЕСКИМ СЕПСИСОМ

Согласно решений Международной Согласительной конференции (1991), тяжесть синдрома системного воспалительного ответа (ССВО) опре- деляется числом и суммой имеющихся признаков: при наличии двух призна- ков синдром оценивается как умеренной степени тяжести; трёх – как средней тяжести, четырёх – как тяжёлый.

В

Тр

Рис. 20. Стенка тонкой кишки при абдоминальном сепсисе (энтеральная недостаточность II степени). Окраска иммуногистохимическим способом по К. Wolgang + гематоксилином-эозином. Общее ув.

Ð 400 (окуляр Ð 10, объектив Ð40).

Примечание: В – везикулы с медиатором (синаптофизином) – единичные

скопления обведены кружками; Тр – тромб в просвете сосуда.

При трёх и четырёх признаках ССВО резко возрастает риск прогрес- сирования заболевания, развития полиорганной недостаточности и наступле- ния летального исхода.

Наряду с признаками ССВО, для оценки выраженности эндогенной интоксикации при сепсисе в клинической практике используют формулы, основанные на оценке соотношений ряда гематологических показателей:

72

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

Очаговый некроз ворсинки

1

Рис. 21. Стенка тонкой кишки при абдоминальном сепсисе в терминальной стадии (энтеральная недостаточность III степени). Виден очаговый некроз слизистой (ворсинки). Видны тромботические массы в приносящей артериоле ворсинки (1). Везикулы с белковой субстанцией синаптофизином не выявляются.

Окраска иммуногистохимическим способом по К. Wolgang + гематокси- лином-эозином. Общее ув. Ð 400 (окуляр Ð 10, объектив Ð40).

1). Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) по Я.Я. Каль-Калифу

(1941) -

где Пл – плазматические клетки, Ю – юные формы, С – сегментоядерные нейтрофилы, П – палочкоядерные нейтрофилы, Мо – моноциты, Э – эозино- филы, Ми - миелоциты, Л - лимфоциты. ЛИИ в норме варьирует от 0,5 до 1,5 усл. ед. (в среднем составляет 1,0 + 0,6).

2). Индекс сдвига лейкоцитов Н.И. Ябучинского:

73

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

где ЛИЯ – лейкоцитарный индекс сдвига Н.И. Ябучинского, С – сегментоя- дерные нейтрофилы, П – палочкоядерные нейтрофилы, Э – эозинофилы. Б – базофилы. В норме этот показатель составляет 1,91-1,97 усл. ед.

где Ми – миелоциты, Ю – юные формы, Пл – плазматические клетки, С – сегментоядерные нейтрофилы, Э – эозинофилы, Б – базофилы, Л - лимфо- циты.

При оценке уровня эндогенной интоксикации считают, что при ЛйИИ 1-2 усл. ед. имеет место интоксикация лёгкой степени, при 2,1-7 – средней степени тяжести, при 7.1-12 – тяжёлой и при ЛйИИ более 12 усл. ед. следует говорить о терминальной интоксикации.

4). Индекс интоксикации лейкоцитов по Островскому:

где Н – нейтрофильные лейкоциты, Пл – плазматические клетки, Э – эози- нофилы, Л – лимфоциты, М - моноциты. В норме ЛИИО составляет 1,6 усл. ед.

5). Лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИХ) по С.Д. Химичу

где Лк – лейкоциты, Н – нейтрофилы. ЛИИХ в норме составляет 1,8.

74

& Хирургический сепсис. Учебное пособие

6). Лимфоцитарный индекс интоксикации (ЛмИИ) -

Н · 100

Л (%)

где Н – нейтрофилы, Л – лимфоциты (определяются в лимфе грудного про- тока). ЛмИИ в норме составляет 1,0.

7). Лейко-Т-клеточный индекс (ЛТИ) – это отношение количества лейкоцитов к числу Т-лимфоцитов в 1 мкл крови. ЛТИ более точно отражает истинное содержание Т-лимфоцитов в периферической крови. Нежели их аб- солютное и относительное количество (Земсков А.М., 1997). В норме этот показатель составляет 4-7 усл. ед. Чем больше его значение у пациента, тем более существенный у него Т-клеточный дефицит.

Для оценки сепсиса очень важным показателем является тип гемограммы. Гемограмма может иметь нейтрофильный или лимфоцитарный тип (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1991).

Нейтрофильный тип встречается в гемограмме у пациентов с сепсисом, в начале клинической картины у которых наблюдается макси- мально расширенная во времени нейтрофильная фаза, переходящая в лимфо- цитарную. Последняя не имеет клинической выраженности и характерна больше всего для этапа выздоровления.

Лимфоцитарный тип отмечается в гемограмме, когда нейтро- фильная фаза сокращена до минимума и проявляется в самом начале заболе- вания (при этом лимфоцитарная фаза занимает основное время на протяже- нии периода болезни).

Клиническая картина сепсиса имеет достаточно выраженную стадий- ность. При этом со стороны периферической крови отмечаются специфиче- ские и неспецифические изменения, отражая сдвиги со стороны системы им- мунологической резистентности организма:

v в начальной стадии происходит умеренное уменьшение про- центного содержания эозинофилов, снижение относительного и абсолютного количества базофилов, процентного содержания Т-лимфоцитов и повышение содержания нулевых лимфоцитов;

v в фазе напряжения отмечается максимально выраженный лейкоцитоз; происходит увеличение уровня моноцитов при нормализации или снижении содержания нейтрофилов (в конце этого периода болезни) за счёт появления юных форм, свидетельствуя об активации иммунной сис- темы; в случае прогрессирования эндотоксикоза уменьшается фагоцитарная

75