Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_5555_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 141
однако более высокая степень активации достигается при присоединении к ней
комплекса Са
2+
-кальмодулин.
Кальцинейрин обладает более высокой субстратной специфичностью по сравне-
нию с РР-1, которая частично перекрывается с Са
2+
-кальмодулинзависимой протеин-
киназой II, благодаря чему повышение уровня Са
2+
в цитоплазме клетки не приводит
к возникновению «холостого цикла» фосфорилирования и дефосфорилирования при
участии этих Са
2+
-кальмодулин-зависимых ферментов, катализирующих противопо-
ложные реакции. Тем не менее кальцинейрин и Са
2+
-кальмодулинзависимая проте-
инкиназа II проявляют разную степень сродства к комплексу Са
2+
-кальмодулин. По
этой причине слабая или низкочастотная стимуляция может селективно активиро-
вать кальцинейрин, в то время как мощные или высокочастотные стимулы могут,
напротив, активировать Са
2+
-кальмодулинзависимую протеинкиназу II. Данный ме-
ханизм может участвовать в двунаправленном контроле интенсивности синаптиче-
ской передачи при низко- и высокочастотной стимуляции.
Дополнительная регуляция активности кальцинейрина может осуществлять-
ся при связывании с шарнирным участком ингибиторов, таких как циклофилин и
FKBP, представляющих собой белки, связывающие иммуносупрессорные агенты
(циклоспорин и FK506 соответственно). Белок FKBP широко представлен в клет-
ках головного мозга, и его распределение в отдельных типах клеток сходно с та-
ковым для кальцинейрина. Как FK506, так и циклоспорин способны проникать
через клеточные мембраны и являются мощными и селективными ингибиторами
кальцинейрина. Данные белки также иногда называют иммунофилинами из-за их
способности блокировать активность кальцинейрина при активации лимфоцитов
и проявлять таким образом иммуносупрессорное действие. Рентгеноструктурный
анализ комплекса кальцинейрин-FK506 выявил формирование тройного комплек-
са, в котором FK506 заключен между FKBP и субъединицей CnA. В отличие от каль-
модулина субъединица CnB не охватывает связывающийся с нею лиганд полно-
стью. Связывание CnB происходит на одной стороне выступающего регуляторного
домена, в то время как связывание комплекса FKBP-FK506 происходит на другой
его стороне. Комплекс FKBP-FK506 оказывается заключенным между регулятор-
ным доменом и каталитическим центром и ингибирует активность кальцинейрина,
блокируя доступ фосфопротеина к активному центру. В настоящее время остается
неясным, существуют ли в организме человека и животных эндогенные FK506-
подобные молекулы, способствующие взаимодействию кальцинейрина и FKBP.
Взаимоотношение активностей протеинкиназ и протеинфосфатаз играет
ключевую роль в интеграции поступающих к нейронам сигналов, что хорошо ил-
люстрируется на примере взаимодействия цАМФ- и Са
2+
-зависимых сигнальных
механизмов, реализующихся при участии ПКА и кальцинейрина соответственно.
Нейроны полосатого тела получают импульсы от возбуждающих глутаматергиче-
ских нейронов коры головного мозга, а также от тормозных дофаминергических
нейронов черной субстанции. Схема возможной регуляции этих сигнальных про-
цессов представлена на рис.6.22.
142 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Рис. 6.22 — Взаимодействие протеинкиназ и протеинфосфатаз
(Greengard et al., 1998).
Уровень фосфорилирования/дефосфорилирования белков регулируется
взаимоотношением активностей протеинкиназ и протеинфосфатаз. Например,
в нейронах полосатого тела дофамин активирует ПКА, которая фосфорилирует
DARPP-32, превращая его таким образом в эффективный ингибитор РР-1. Это
приводит к увеличению уровня фосфорилированных белков — субстратов раз-
личных протеинкиназ. Этому эффекту противодействует активация рецепторов
NMDA под действием импульсов, поступающих от других нейронов, что приво-
дит к повышению уровня внутриклеточного Са
2+
и активации кальцинейрина.
Кальцинейрин дефосфорилирует DARPP-32, в результате чего последний перехо-
дит в неактивное состояние и ингибиторное действие на РР-1 прекращается.
Ключевым событием в данном регуляторном механизме является фосфори-
лирование/дефосфорилирование DARPP-32 (Greengard etal., 1998). Связывание
глутамата с рецепторами NMDA приводит к повышению уровня Са
2+
в цитоплаз-
ме клетки, активации кальцинейрина и дефосфорилированию и, соответственно,
инактивации DARPP-32. В результате дефосфорилированный DARPP-32 перестает
оказывать ингибирующее действие на РР-1, которая, в свою очередь, дефосфо-
рилирует широкий спектр белков, включая Na
+
/K
+
-АТФазу, что приводит к деполя-
ризации клеточной мембраны. Противоположный эффект оказывает дофамин,
который активирует аденилатциклазный сигнальный каскад и, соответственно,
ПКА. ПКА фосфорилирует DARPP-32, переводя его тем самым в активное состоя-
ние, т.е. способное к ингибированию РР-1. Таким образом, ПКА и кальцинейрин
действуют как антагонисты в процессах регуляции активности множества бел-
ков, включая ферменты, ионные каналы, а также факторы транскрипции.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 143
6.10. Взаимодействие между различными сигнальными
механизмами в нейронах головного мозга
Понимание природы сигнальных процессов, с помощью которых нейроме-
диаторы оказывают свое физиологическое воздействие на нейроны-мишени, а
также механизмов, ответственных за координирование работы различных сиг-
нальных каскадов и согласованное их действие, является одной из центральных
задач клеточной и молекулярной нейробиологии. Наиболее детально характер
взаимодействия различных сигнальных путей, активируемых различными фак-
торами, в настоящее время исследован на нейронах полосатого тела (рис.6.23).
Рис. 6.23 — Взаимодействие сигнальных путей в нейронах полосатого тела
(Greengard, 2001).
Активация дофамином рецепторов D1 приводит к увеличению уровня цАМФ и,
соответственно, активности ПКА. Активированная ПКА фосфорилирует DARPP-32
по остатку Thr-34. Напротив, глутамат, действуя через NMDA-рецепторы, увели-
чивает концентрацию Са
2+
в цитоплазме ([Ca
2+
]
i
), что приводит к активации РР2В
144 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
(протеинфосфатаза 2В; кальцинейрин) и дефосфорилированию фосфо-Thr-34-
DARPP-32. Вазоактивный интестинальный пептид (ВИП), NO, а также некоторые
другие нейромедиаторы увеличивают уровень фосфорилирования DARPP-32 по-
средством различных механизмов. Дофамин, действуя через рецепторы D2, так
же как холецистокинин и ГАМК, регулирует уровень фосфорилирования DARPP-32
через изменение уровня [Ca
2+
]
i
и, следовательно, активности РР2В. Казеинкиназы
I и II (CKI и CKII) осуществляют фосфорилирование DARPP-32 по остаткам, отлич-
ным от Thr-34, что приводит к конформационным перестройкам в этом белке.
Врезультате такого фосфорилирования фосфо-Thr-34-DARPP-32 становится ме-
нее предпочтительным субстратом для РР2В (в случае фосфорилирования CKI) и,
напротив, более предпочтительным для ПКА (в случае фосфорилирования CKII).
Нейролептики, такие как галоперидол, увеличивают уровень фосфорилирования
DARPP-32 по остатку Thr-34, блокируя активацию РР2В, вызванную действием
дофамина на рецепторы D2.
Физиологические последствия фосфорилирования DARPP-32 по остатку
Thr-34 весьма значительны. Например, фосфо-Thr-34-DARPP-32 является мощ-
ным ингибитором РР-1, являющейся главной фосфопротеинфосфатазой, регу-
лирующей уровень фосфорилирования (и, следовательно, активности) множе-
ства белков в головном мозге, включая Na
+
-каналы, Са
2+
-каналы L-, N- и Р-типов,
Na
+
/K
+
-АТФазу и подкласс NR-1 рецепторов глутамата.
В целом можно сказать, что каскад DARPP-32/РР-1 представляет собой ме-
ханизм, посредством которого различные нейромедиаторы действуют в составе
сложной координированной системы, регулирующей активность различных ион-
ных каналов, насосов и рецепторов.
6.11. Механизмы внутриклеточной сигнализации, действующие
на уровне регуляции экспрессии генов
В предыдущих параграфах нами были рассмотрены сигнальные механизмы,
в основе работы которых лежала посттрансляционная регуляция активности
клеточных белков. Еще один важный уровень регуляции клеточных процессов
состоит в способности регуляторных систем контролировать уровень синтеза
различных клеточных белков, оказывая влияние на эффективность экспрес-
сии соответствующих генов. Регуляция экспрессии генов внутриклеточными
сигналами является фундаментальным
механизмом, регулирующим процессы
развития, поддержания гомеостаза и адаптацию к изменяющимся условиям
окружающей среды. Фосфорилирование белков и регуляция экспрессии генов
также лежат в основе механизмов, определяющих высокий уровень пластично-
сти клеток нервной ткани. Изменения в уровне экспрессии тех или иных генов
может приводить к длительным изменениям в активности отдельных нейронов,
которые могут иметь продолжительность от нескольких часов до многих лет.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 145
Геном человека содержит порядка 40 000 генов, кодирующих как структур-
ные РНК различных типов, так и мРНК, представляющие собой матрицы для по-
следующей трансляции и синтеза белков. В структуре генов различают участки,
отвечающие за синтез РНК (в частности, мРНК синтезируется при транскрипции
генов, кодирующих белки), а также участки, осуществляющие регуляторные
функции и
сами по себе не несущие информации о структуре белков. Некоторые
из таких регуляторных участков определяют точки начала и конца транскрип-
ции участков структурных генов и синтеза соответствующих РНК. Другие регу-
ляторные элементы определяют возможность экспрессии тех или иных генов
в различных типах клеток при различных условиях. Такой механизм регуляции
экспрессии генов, осуществляемый собственными участками ДНК, расположен-
ными в участках, непосредственно прилегающих к регулируемым ими генам, по-
лучил название цис-регуляции. Цис-регуляторные элементы представляют собой
сайты связывания для регуляторных белков, называемых факторами транскрип-
ции или транс-регуляторными элементами, поскольку они могут кодироваться
генами, расположенными в различных участках генома, не обязательно локали-
зованными вблизи контролируемого ими гена.
Транскрипция структурных генов (или синтез мРНК) осуществляется фермен-
том РНК-полимеразой II (pol II). Данный процесс принято подразделять на 3ста-
дии: инициации, трансляции и терминации. Подробнее с механизмами, лежащи-
ми в основе транскрипции, можно ознакомиться в соответствующей литературе
по молекулярной биологии. Несмотря на то что регуляция транскрипции может
осуществляться на разных стадиях этого процесса, основные регуляторные эф-
фекты со стороны нейромедиаторов, гормонов и факторов роста осуществляют-
ся именно на стадии инициации транскрипции.
Инициация транскрипции включает в себя два чрезвычайно важных процес-
са: 1)правильное расположение РНК-полимеразы II в соответствующем старто-
вом сайте транскрибируемого гена и 2)регуляция эффективности инициации для
достижения требуемого уровня транскрипции соответствующего гена в данной
клетке при данных физиологических условиях. Цис-регуляторные элементы,
определяющие точку начала транскрипции, называются промоторами. Другие
цис-регуляторные элементы осуществляют связывание различных активирую-
щих или, наоборот, репрессорных белков, оказывающих влияние на эффектив-
ность транскрипции (рис.6.24).
Таковыми регуляторными элементами являются два сайта связывания ак-
тивирующих регуляторных белков и ТАТА-бокс. ТАТА-бокс является сайтом свя-
зывания соответствующего ТАТА-бокс-связывающего белка (TBP). С ТВР, в свою
очередь, связываются различные факторы транскрипции (IIA, IIB, IIF, IIH) и РНК-
полимераза II (pol II). Этот комплекс взаимодействует с активаторными белка-
ми1 и 2, связывание которых также осуществляется в соответствующих сайтах.
Белок-активатор2 является также субстратом фосфорилирования.
146 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Рис. 6.24 — Схематическое изображение структуры промотора с тремя регуляторными
цис-элементами (приводится по: Squire et al., 2003).
Промоторы структурных генов представляют собой участки ДНК, располо-
женные с 5ʹ-стороны транскрибируемого гена, на которых формируется транс-
крипционный комплекс. Транскрипционный комплекс представляет собой на-
бор белков, часть из которых распознают определенные последовательности и
топологические структурные элементы в ДНК, в то время как другие связывают
pol II и участвуют в ее правильном позиционировании на промоторе. Промоторы
большинства структурных генов представляют собой участки ДНК, богатые А и
Т, локализованные на 25–30оснований выше точки инициации транскрипции.
Такие участки получили название ТАТА-бокса. Промоторы некоторых генов, в ос-
новном так называемых генов «домашнего хозяйства», конститутивно экспрес-
сирующихся в клетках, не имеют ТАТА-бокса, роль которого у
них выполняют
другие регуляторные участки, богатые остатками G и C.
Транскрипционный аппарат сам по себе способен инициировать только не-
высокий уровень транскрипции. Для достижения необходимой эффективности
необходимо также участие активаторов транскрипции, которые распознаются и
связываются с цис-регуляторными элементами, расположенными в различных
участках гена. Такие активаторы транскрипции представляют собой белки, полу-
чившие название сайт-специфических факторов транскрипции. Обычно цис-регу-
ляторные элементы располагаются в пределах нескольких сотен пар оснований от
сайта инициации транскрипции. Однако в некоторых случаях они могут находиться
за несколько тысяч пар оснований от стартовой точки, а также с любой стороны от
нее. Такие регуляторные элементы, как правило, представляют собой небольшие
участки ДНК длиной порядка 7–12пар оснований, имеющие структуру палиндро-
мов (обращенных повторов). Каждый такой участок представляет собой специ-
фический сайт связывания для одного или нескольких факторов транскрипции.
Каждый структурный ген обладает определенной комбинацией цис-регуляторных
элементов, природа, количество и пространственное расположение которых опре-
деляют уникальный характер экспрессии данного гена в различных типах клеток,
на разных этапах развития, а также уровень его экспрессии в клетках зрелых тка-
ней как в состоянии покоя, так и при физиологической стимуляции.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 147
Факторы транскрипции, специфические в отношении последовательностей
ДНК, как правило, имеют в своем составе специализированные функциональные
домены: 1) домен, отвечающий за распознавание и связывание с определенны-
ми участками ДНК, т.е. с цис-регуляторными элементами; 2) домен, отвечающий
за активацию транскрипции, который взаимодействует с общими факторами
транскрипции с образованием активного транскрипционного комплекса и 3)до
-
мен, отвечающий за образование мультимерных гомо- и гетерокомплексов с дру-
гими факторами транскрипции (Tjian, Maniatis, 1994).
Многие факторы транскрипции способны проявлять биологическую актив-
ность только в виде димеров или же комплексов более высокого уровня орга-
низации. Домены факторов транскрипции, ответственные за полимеризацию,
весьма разнообразны и содержат структуры, известные под названием «лей-
циновых молний», домены SH2 (от англ. Src-homology domains), а также α-спи-
ральные участки. В транскрипционных факторах, имеющих форму димеров (как
гомо-, так и гетеро-), обе субъединицы принимают участие в формировании как
ДНК-связывающего домена, так и домена, ответственного за активацию транс-
крипции. Таким образом, димеризация может представлять собой механизм как
положительной, так и отрицательной регуляции уровня транскрипции.
Сайт-специфические факторы транскрипции (как активаторы, так и ингиби-
торы) могут образовывать активный транскрипционный комплекс посредством
взаимодействия с одним или несколькими белками. Чаще всего такие факторы
транскрипции вступают во взаимодействие с основным транскрипционным ком-
плексом не напрямую, а при участии адаптерных белков (рис.6.25).
Рис. 6.25 — Образование петли ДНК позволяет белку-активатору (или репрессору),
имеющему сайт связывания, находящийся на большом расстоянии от сайта инициации
транскрипции, вступать во взаимодействие с транскрипционным аппаратом —
комплексом РНК-полимеразы II, связанным с ТАТА-боксом
(приводится по: Squire et al., 2003).
148 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Белок-активатор (CREB, от англ. carbohydrate response element binding protein)
подвергается фосфорилированию, в результате чего он приобретает способность
связывать адаптерный белок CBP (от англ. CREB-binding protein).
В любом случае транскрипционные факторы, сайты связывания которых на-
ходятся на удалении от основного промотора, получают способность к взаимо-
действию с основным транскрипционным аппаратом, поскольку ДНК способна
образовывать петли, благодаря чему удаленные друг от
друга участки полину-
клеотидной цепи оказываются сближенными в пространстве. Во многих случаях
адаптерные белки, участвующие в таких взаимодействиях, обладают фермен-
тативной активностью и способны модифицировать другие белки, связанные с
ДНК. Кроме того, ДНК в ядре клетки представляет собой не линейную вытянутую
молекулу, а компактную структуру в комплексе с белками-гистонами. В соста-
ве этого комплекса ДНК наматывается на гистоновый кор, образуя структуры,
известные под названием нуклеосом. Некоторые из адаптерных белков, такие
как СВР, представляют собой гистоновые ацетилтрансферазы, которые осущест-
вляют ацетилирование гистонов по остаткам Lys и Arg, что снижает суммарный
положительный заряд гистоновых белков, ослабляя тем самым их электростати-
ческие взаимодействия с ДНК, увеличивая доступ транскрипционных комплек-
сов к промоторам соответствующих генов и активируя транскрипцию. Другие
адаптерные белки представляют собой гистоновые деацетилазы (HDAC), уда-
ляющие ацетильные группы из молекул гистонов. Деацетилирование, напротив,
приводит к увеличению положительного заряда молекул гистонов, усилению их
взаимодействия с ДНК и подавлению транскрипции генов, расположенных в со-
ответствующих участках. Кроме того, существуют также гистоновые метилазы
и деметилазы, осуществляющие схожие эффекты. Итоговым результатом всех
этих процессов является правильная ориентация РНК-полимеразы II на промото-
ре гена, необходимая для его эффективной транскрипции в соответствии с физи-
ологическими потребностями клетки.
6.11.1. Внутриклеточные сигналы, оказывающие влияние
на уровень транскрипции
Внутриклеточные сигнальные системы могут активировать транскрипци-
онные факторы различными способами, однако каждый из этих механизмов
обязательно включает в себя стадию транслокации, посредством которой сиг-
нал передается через цитоплазму в ядро клетки. Некоторые факторы транс-
крипции непосредственно транслоцируются из цитоплазмы в ядро клетки.
Например, транскрипционный фактор NF-κB удерживается в цитоплазме клет-
ки в комплексе с белком IκB, который препятствует его перемещению в ядро.
Когда белок IκB подвергается фосфорилированию под действием ПКС или дру-
гих протеинкиназ, NF-κB диссоциирует из комплекса с ним и перемещается в
ядро клетки (рис.6.26).
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 149
Рис. 6.26 — Сигнальный путь NF-κB. IKK — киназа белка IκB
(приводится по: Squire et al., 2003).
Другие транскрипционные факторы должны подвергнуться фосфорилирова-
нию или, наоборот, дефосфорилированию для того, чтобы они могли связаться
с ДНК. Например, многие цитокины способны активировать сигнальный путь
JAK/STAT, описанный выше, при котором связывание цитокинов с рецепторами
приводит к димеризации рецептора и присоединению к нему Янус-киназ JAK.
Присоединение JAK к рецептору вызывает их активацию, в результате чего JAK
подвергаются аутофосфорилированию, а также фосфорилируют рецептор по
остаткам Tyr. Это, свою очередь, является сигналом для присоединения белков
STAT. Белки STAT также подвергаются фосфорилированию под действием JAK и
образуют димеры. Димеры фосфорилированных белков STAT проникают затем
в ядро клетки, где действуют как факторы транскрипции. Образование димера
STAT является необходимым условием для их транслокации в ядро, а также для
формирования сайта связывания с ДНК. Существуют также транскрипционные
факторы, которые изначально связаны в ядре со своими цис-регуляторными
элементами и приобретают способность активировать транскрипцию после
того, как подвергнутся фосфорилированию. Например, транскрипционный фак-
тор CREB (carbohydrate response element binding protein) конститутивно связан с
цАМФ-зависимым регуляторным элементом CRE (CREB-response element), кото-
рый присутствует во многих генах. Главной стадией в активации CREB является
при этом не само действие транскрипционного фактора, а транслокация в ядро
150 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
каталитической субъединицы ПКА, которая фосфорилирует CREB, переводя его
в активное состояние, в котором он приобретает сродство к адаптерному белку
СВР. Комплекс CREB-СВР связывается в свою очередь с основным транскрипци-
онным аппаратом и активирует транскрипцию (рис.6.25).
6.11.2. Роль цАМФ и Са
2+
в регуляции экспрессии генов
Как уже отмечалось выше, аденилатциклазный механизм передачи сигнала
является одним из наиболее хорошо изученных сигнальных механизмов. Одним
из основных направлений действия данного сигнального пути также является
регуляция экспрессии многих генов. Установлено, что многие гены, экспресси-
руемые в клетках нервной ткани, содержат цАМФ-зависимые регуляторные эле-
менты с консенсусной последовательностью TGACGTCA.
Изучение структуры консенсусных последовательностей регуляторного
элемента CRE показало, что большинство из них являются палиндромами (об-
ращенными повторами). Например, было показано, что последовательности
TGACGTCA, расположенные в двух комплементарных антипараллельных цепях
ДНК, идентичны, т.е. читаются одинаково в обоих направлениях:
TGACGTCA
ACTGCAGT
Многие другие цис-регуляторные элементы также представляют собой па-
линдромы. Такое строение регуляторных элементов в
ДНК имеет важное биоло-
гическое значение, поскольку многие транскрипционные факторы связываются
с ДНК в виде димеров. При этом каждая из двух субъединиц димера распознает
и связывается с одной «половиной» сайта связывания. Например, CREB связы-
вается с CRE в форме гомодимера и проявляет более высокое сродство к па-
линдромным формам CRE, чем к ассиметричным. CREB при связывании с CRE
подвергается фосфорилированию по остатку Ser-133, после чего приобретает
способность связывать адаптерный белок СВР. СВР в свою очередь осущест-
вляет ацетилирование гистоновых белков, что приводит к деконденсации хро-
матина (перехода гетерохроматина в эухроматин) и, как следствие, к активации
транскрипции.
Регуляция активности CREB наглядно демонстрирует несколько важных
принципов внутриклеточной сигнализации, таких как необходимость транслока-
ции протеинкиназ в ядро клетки в тех случаях, когда транскрипционный фактор
изначально присутствует в ядре, а также роль процессов фосфорилирования/
дефосфорилирования в регуляции белок-белковых взаимодействий. Кроме того,
пример CREB-зависимого механизма регуляции транскрипции отражает принцип
конвергенции сигнальных механизмов. Например, CREB может фосфорилиро-
ваться при участии свободной каталитической субъединицы цАМФ-зависимой
протеинкиназы А (ПКА) (рис.6.27).
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана