Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_5555_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной
сигнализации в нервной ткани
Практически все процессы жизнедеятельности нейронов и глиальных клеток,
включая их пролиферацию, дифференцировку, рост, время жизни, организацию
цитоскелета, экспрессию генов, передачу сигналов с помощью нейромедиато-
ров и изменение биоэлектрической активности в соответствии с потребностями
организма, определяются характером протекания процессов внутриклеточной
сигнализации, берущими свое начало у клеточной поверхности. Ответ нейрона
или глиальной клетки на воздействие нейромедиаторов или факторов роста
определяется активацией соответствующих рецепторов, запускающих каскад
процессов, отвечающих за передачу соответствующего сигнала внутрь клетки
к определенным органеллам, клеточным компартментам, ферментам, ионным
каналам, белкам цитоскелета, которые опосредуют эффекты медиаторов (пер-
вичных мессенджеров) на уровне цитоплазмы или ядра клетки. Молекулы,
участвующие в трансдукции клеточных сигналов, весьма
разнообразны и ши-
роко представлены как у млекопитающих, так и у беспозвоночных животных.
Реакции отдельных нейронов на тот или иной сигнал определяются, в свою оче-
редь, концентрацией и внутриклеточной сигнализацией молекул, участвующих в
сигнальных каскадах, а также характером предшествовавшей этому клеточной
активности. Несколько разновидностей существующих сигнальных механизмов
обеспечивают высочайшую гибкость межклеточных взаимодействий. Первый
класс сигнальных механизмов опосредован ионотропными рецепторами; он
обеспечивает проведение быстрых сигналов и может быть активирован или
деактивирован в течение нескольких миллисекунд. Именно эти сигнальные ме-
ханизмы формируют своего рода «фиксированную разводку» нервной системы,
обеспечивающую быструю мультисинаптическую передачу импульсов. Второй
класс сигнальных механизмов опосредован рецепторами, обладающими тиро-
зинкиназной активностью, которые обычно осуществляют трансдукцию сигна-
лов, поступающих от факторов роста и трофических факторов и модулирующих
процессы роста, пролиферации, дифференцировки и времени жизни нейронов.
Третий класс сигнальных механизмов опосредован рецепторами GPCR, наиболее
92 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
многочисленным семейством рецепторов, осуществляющих трансдукцию сигна-
лов при участии G-белков. Проведение сигнала с помощью данной сигнальной
системы осуществляется в несколько стадий, что означает задержку по време-
ни. Следовательно, с помощью третьей сигнальной системы осуществляется
трансдукция медленных сигналов— от 100–300мс до нескольких минут. Такая
относительно низкая скорость проведения сигнала компенсируется, однако, вы
-
сокой способностью таких сигнальных систем к амплификации мощности сигна-
ла на каждом этапе трансдукции. Первым этапом в таких сигнальных каскадах
обычно бывает генерация в цитоплазме клетки небольших молекул вторичных
мессенджеров (вторичных посредников), которые затем активируют большое ко-
личество различных белков, в особенности протеинкиназ, играющих централь-
ную роль в регуляции метаболизма и жизнедеятельности клетки. Сигнальные
каскады способны также приводить в действие механизмы регуляции экспрес-
сии генов, что также отражается на функциональном состоянии клеток и тканей.
6.1. GPCR-зависимые механизмы внутриклеточной сигнализации,
опосредованные G-белками
В передаче сигналов через рецепторы, ассоциированные с G-белками (GPCR),
принимают участие 3мембраносвязанных компонента:
1) рецептор, расположенный на клеточной поверхности, который определяет
природу сигнала, на который должна реагировать клетка;
2) G-белок, ассоциированный с внутренней поверхностью клеточной мембраны,
активность которого индуцируется активированным рецептором, связавшим лиганд;
3) эффекторный фермент, который отвечает за синтез вторичного мессен-
джера, либо эффекторный ионный канал, который регулирует ионные токи в
клетке в ответ на активацию G-белка.
В геноме человека имеются гены, отвечающие за синтез более 600типов
рецепторов катехоламинов, одорантов, нейропептидов или же реагирующих на
световые сигналы, каждый из которых сопряжен с одним или несколькими из
27известных G-белков. G-белки, в свою очередь, модулируют активность одного
или нескольких из более чем десятка различных ионных каналов и ферментов.
Основной особенностью такого механизма передачи информации является спо-
собность G-белков реагировать на присутствие активированных рецепторов и
усиливать передаваемый сигнал путем изменения активности соответствующих
эффекторных ферментов и/или ионных каналов.
G-белки обладают способностью связывать ГТФ и таким образом осущест-
влять сопряжение процессов активации рецепторов при связывании ими ней-
ромедиатора на клеточной поверхности с изменением активности эффекторных
ферментов и ионных каналов. Одним из наиболее хорошо изученных эффекторных
ферментов является аденилатциклаза, которая осуществляет синтез циклического
АМФ (цАМФ) из АТФ, выполняющего роль вторичного мессенджера (рис.6.1).
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 93
Рис. 6.1 — Механизм биосинтеза цАМФ.
Другим примером эффекторного фермента является фосфолипаза С, которая
расщепляет фосфатидилинозитол-4,5-дисфосфат (ФИФ
2
) с образованием диацил-
глицерола (ДАГ) и инозитол-1,4,5-трифосфата (ИФ
3
), также выполняющих функ-
ции вторичных мессенджеров (рис.6.2).
Рис. 6.2 — Механизм образования ДАГ и ИФ
3
из ФИФ
2
.
ИФ
3
активирует Ca
2+
-каналы в мембранах эндоплазматического ретикулума
(ЭР), в цистернах которого находится «депо» внутриклеточного Ca
2+
. Открытие
ионных каналов приводит к высвобождению Ca
2+
из цистерн ЭР в цитоплазму
по электрохимическому градиенту. ДАГ является аллостерическим активатором
протеинкиназы С, которая фосфорилирует эффекторные белки и тем самым мо-
дулирует их активность. Информация от активированного рецептора передается
таким образом на вторичный мессенджер, который в свою очередь активирует,
как правило, ту или иную протеинкиназу, модулирующую активность других фер-
ментов и транскрипционных факторов, меняя тем самым физиологическое со-
стояние клетки. Вторичные мессенджеры, такие как цАМФ, ДАГ и Ca
2+
, способны
активировать протеинкиназы с широкой субстратной специфичностью, которые
фосфорилируют ключевые внутриклеточные белки, ионные каналы, ферменты и
факторы транскрипции, которые принимают участие в различных биологических
процессах. В нормальных физиологических условиях в клетках поддерживается
94 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
определенный баланс активностей протеинкиназ и протеинфосфатаз, что также
во многом определяется процессами их фосфорилирования/дефосфорилиро-
вания. Помимо регуляции активности протеинкиназ, вторичные мессенджеры,
такие как цАМФ, цГМФ, Ca
2+
, а также арахидоновая кислота, могут напрямую вы-
зывать открытие тех или иных ионных каналов, а также модулировать их работу.
G-белки также могут напрямую связываться с ионными каналами без участия
вторичных мессенджеров или протеинкиназ. Таким образом, с помощью этих
разнообразных механизмов нейромедиаторы, находящиеся в межклеточном
пространстве, могут модулировать все метаболические процессы в клетке и «за-
писывать историю» стимуляции клетки в виде изменения ее активности и синте-
за различных клеточных метаболитов (рис.6.3).
Рис. 6.3 — Общая схема передачи сигнала при участии G-белков, вторичных
мессенджеров и протеинкиназ на примере норадреналина (НА) и ацетилхолина (АХ):
ФЛС — фосфолипаза С; ФИФ
2
— фосфатидилинозитол-4,5-дифосфат; ИФ
3
— инозитол-
1,4,5-трифосфат; ПКА — протеинкиназа А; ПКС — протеинкиназа С.
6.1.1. Общие принципы G-белок-зависимой сигнализации
Различные типы G-белков и эффекторных ферментов имеют немало об-
щих свойств (Hille, 1992). Во-первых, каждый рецептор может быть сопряжен с
G-белком только одного типа (в некоторых случаях с небольшим количеством
разных G-белков), что обеспечивает специфичность передаваемого сигнала.
Во-вторых, вторичные мессенджеры, как правило, синтезируются в одну или
две стадии из своих предшественников (АТФ, ГТФ, ФИФ
2
), которые присутству-
ют в клетке в достаточном количестве, но сами по себе не проявляют сигналь-
ной активности. Кроме того, G-белки могут также стимулировать активность
ферментов, отвечающих за расщепление вторичных мессенджеров. В-третьих,
изначально поступающий к клетке сигнал может в значительной степени ампли-
фицироваться, поскольку каждый рецептор способен активировать множество
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 95
молекул G-белков, каждый эффекторный фермент может синтезировать множе-
ство молекул вторичных мессенджеров, а каждая протеинкиназа может фосфо-
рилировать множество молекул белков-субстратов. В-четвертых, хотя процесс
изначально является медленным, он продолжается дольше, чем сигнализация,
опосредованная ионными каналами. В-пятых, механизмы сигнализации, опо-
средованные G-белками, могут координировать различные клеточные процессы
с помощью
одного и того же вторичного мессенджера. Например, цАМФ-зави-
симая протеинкиназа (протеинкиназа А, ПКА, PKA) может активироваться в
сенсорных нейронах под действием серотонина. При этом ПКА фосфорилирует
K
+
-каналы, что приводит к их закрытию и возникновению потенциала действия
на постсинаптической мембране. Среди более медленных эффектов, опосредо-
ванных ПКА и цАМФ, можно выделить активацию катаболизма углеводов, ре-
зультатом которого является активация окислительного фосфорилирования и
синтеза АТФ, необходимого для биосинтеза белков, участвующих в образовании
синаптических контактов после длительного периода пребывания нейрона в ак-
тивном или же, наоборот, в неактивном состоянии. Если бы в нервной системе
человека и животных действовали только быстрые механизмы передачи инфор-
мации, она была бы способна только к небольшому набору стандартных рефлек-
торных реакций. Модуляция таких систем передачи информации, а также про-
чих клеточных функций, с помощью механизмов, опосредованных G-белками, а
также рецепторами, обладающими собственной тирозинкиназной активностью,
позволяет получать координированные ответы со стороны различных клеток и
клеточных ансамблей, а высокое разнообразие сигнальных молекул, а также их
мишеней обеспечивает практически неограниченную гибкость клеточных реак-
ций в широком временном интервале с высокой степенью амплификации. Такие
сигнальные механизмы обеспечивают свойство нейрональной пластичности и
регулируют каждый шаг на пути от связывания нейромедиатора с рецептором,
изменения активности ионных каналов, внутриклеточной передачи сигнала, из-
менения экспрессии генов и синтеза новых молекул нейромедиаторов, что, в ко-
нечном счете, лежит в основе формирования таких фундаментальных процессов,
как обучение и память.
G-белки могут обратимо пребывать в двух молекулярных состояниях, обеспе-
чивающих включение или выключение соответствующего сигнального каскада.
В составе молекул G-белков, участвующих во внутриклеточной сигнализации,
имеется регуляторный участок, который характерен для различных ГТФаз, уча-
ствующих в таких процессах, как, например, синтез белка или транспорт везикул
в цитоплазме. G-белки переводятся во «включенное» состояние посредством ак-
тивации связанного с ними рецептора и могут самостоятельно «выключать» себя
по прошествии некоторого времени. Пребывание G-белка во «включенном» или
«выключенном» состоянии зависит от типа гуанидинового нуклеотида, который
находится в активном центре G-белка. Когда в активном центре G-белка находит-
ся молекула ГДФ, G-белок находится в неактивном состоянии. Замещение моле-
96 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
кулы ГДФ на ГТФ приводит к активации G-белка. По существу, основной функ-
цией рецепторов семейства GPCR в активации G-белков является инициация
замены молекулы ГДФ в активном центре G-белка на ГТФ. Это замещение носит
временный характер, поскольку сами G-белки представляют собой ферменты
ГТФазы, способные гидролизовать ГТФ с образованием ГДФ и таким образом
возвращать
себя в исходное неактивное состояние. Благодаря этой способно-
сти G-белки осуществляют трансдукцию сигнала только тогда, когда на нейрон
воздействуют нейромедиаторы и рецептор пребывает в активном состоянии.
Различают G-белки с быстрой и медленной ГТФазной активностью. Сигнальные
пути, опосредованные «быстрыми» G-белками, тонко реагируют на присутствие
нейромедиатора в синаптической щели и активны только тогда, когда рецептор
находится в связанном с лигандом состоянии. Напротив, механизмы, реализуе-
мые с участием «медленных» G-белков, могут продолжать трансдукцию сигнала
даже тогда, когда непосредственное воздействие медиатора на рецептор уже
прекратилось, и обеспечивают за счет этого высокий уровень амплификации
проводимого сигнала. С одной стороны, клетка не может реагировать на от-
дельные часто поступающие сигналы в том случае, если участвующий в переда-
че сигнала G-белок является «медленным». С другой стороны, преимуществом
«медленных» G-белков является амплификация поступающих сигналов за счет
способности рецептора активировать сразу несколько молекул G-белков. В свою
очередь, каждый G-белок может активировать несколько молекул эффекторных
ферментов за один цикл. Таким образом, ГТФазная активность G-белков служит
одновременно таймером и амплификатором проводимого сигнала (рис.6.4).
Рис. 6.4 — ГТФазная активность G-белка, инициируемая связыванием медиатора
с рецептором. Замещение ГДФ на ГТФ в активном центре G-белка приводит его в
активное состояние; Фн — неорганический фосфат.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 97
6.1.2. Цикл G-белков
G-белки представляют собой гетеротримерные комплексы, состоящие из
α-субъединицы (39–52кДа), обладающей ГТФазной активностью, и димера, об-
разованного β- и γ-субъединицами (35кДа и 8кДа соответственно). В исходном
«неактивном» состоянии, когда в активном центре α-субъединицы находится моле-
кула ГДФ, она образует стабильный комплекс с βγ-димером (Neer, 1995; Berg etal.,
2012). Димер βγ не только блокирует возможность взаимодействия α-субъедини-
цы с эффекторным белком, но также и повышает ее сродство к активированному
рецептору. Связывание нейромедиатора с рецептором приводит к конформацион-
ным перестройкам в последнем, в результате которых аминокислотные остатки,
отвечающие за взаимодействие с G-белком и погруженные до этого внутрь гло-
булы, оказываются экспонированными на поверхности цитоплазматичекой части
рецептора, что приводит к увеличению сродства рецептора к G-белку. Рецептор
того или иного типа способен взаимодействовать только с одним или, в некото-
рых случаях, с небольшим количеством типов G-белков, что определяется именно
типом соответствующей α-субъединицы. Связывание G-белка с активированным
рецептором приводит к снижению сродства α-субъединицы к ГДФ, в результате
чего комплекс α-ГДФ диссоциирует и активный центр α-субъединицы освобожда-
ется. Образовавшееся «вакантное место» может быть в действительности занято
как ГТФ, так и ГДФ. Однако, поскольку концентрация ГТФ в клетке значительно
превосходит концентрацию ГДФ, освободившийся активный центр α-субъединицы
обычно занимается молекулой ГТФ. Связывание ГТФ с α-субъединицей приводит к
диссоциации G-белка на α-ГТФ и βγ-димер, а также к понижению сродства α-субъ-
единицы к рецептору, в результате чего последняя диссоциирует из комплекса с
ним и приобретает мобильность (рис.6.5).
Рис. 6.5 — Цикл активации/инактивации G-белка
(приводится по: Berg et al., 2012).
98 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Замещение молекулы ГДФ на ГТФ в активном центре α-субъединицы приво-
дит к диссоциации неактивного G-белка на α-ГТФ и βγ-димер, каждый из кото-
рых обладает собственной активностью и способен активировать эффекторные
молекулы. После гидролиза ГТФ трехмерный комплекс вновь ассоциирует и
G-белок возвращается в исходное состояние.
Обмен ГТФ/ГДФ
происходит медленно из-за высокой энергии активации, тре-
буемой для открытия сайта связывания нуклеотидов в α-субъединице. Низкая
скорость данного процесса приводит к тому, что в отсутствие сигнала, поступаю-
щего от рецептора, в активном состоянии может находиться лишь чрезвычайно
малое количество молекул G-белков. Активация рецептора не обеспечивает цикл
G-белков энергией. Однако конформационные перестройки, происходящие в мо-
лекуле рецептора при связывании медиатора, приводят к понижению свобод-
ной энергии Гиббса процесса диссоциации ГДФ из комплекса с α-субъединицей
(∆G<0), что делает данный процесс экзергоническим и освобождает активный
центр α-субъединицы для связывания ГТФ. Когда стимуляция рецептора ней-
ромедиатором приводит к ускорению обмена ГД Ф/ГТФ, реакция гидролиза ГТФ
становится скорость-лимитирующей стадией всего цикла G-белка, что приводит
к накоплению комплексов α-ГТФ. В такой ситуации уровень активных G-белков
может увеличиваться от 1% (в состоянии покоя) до 50% от всех G-белков, при-
сутствующих в цитоплазме клетки. Направление цикла определяется ГТФазной
реакцией, которая является резко экзергонической и, следовательно, термодина-
мически необратимой и обеспечивает низкий уровень α-ГТФ в цитоплазме клет-
ки в состоянии покоя (Stryer, 1995) (рис.6.6).
G-белок пребывает в неактивном состоянии, когда в активном центре α-субъ-
единицы присутствует ГДФ. При связывании медиатора активированный рецеп-
тор взаимодействует с G-белком (справа), что приводит к диссоциации ГДФ и
замещению его на ГТФ. Связывание ГТФ с α-субъединицей приводит к ее актива-
ции и диссоциации из комплекса с βγ-димером (рис.6.6, А). Как α-ГТФ, так и ди-
мер βγ способны взаимодействовать с эффекторными молекулами. α
s
-ГТФ акти-
вирует аценилатциклазу, которая осуществляет синтез цАМФ из АТФ (рис.6.6,Б).
Трансдукция сигнала прекращается, когда происходит гидролиз ГТФ до ГДФ
(рис.6.6, В). В некоторых сигнальных механизмах гидролиз ГТФ стимулируется
белками-активаторами ГТФазы (GAP, от англ. GTPase-activating proteins), которые
связываются с α-субъединицей и стабилизируют переходное состояние, необхо-
димое для гидролиза ГТФ). Гидролиз ГТФ позволяет α
s
-ГДФ диссоциировать из
комплекса с аденилатциклазой и вновь ассоциировать в комплекс с βγ-диме-
ром, в результате чего G-белок возвращается в исходное состояние.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 99
Рис. 6.6 — Схема взаимодействия субъединиц G-белка с рецептором и эффекторным
ферментом (аденилатциклазой) (приводится по: Squire et al., 2003).
6.1.3. Роль субъединиц G-белков в трансдукции сигнала
Один из наиболее проблемных вопросов в изучении механизмов внутрикле-
точной сигнализации состоит в том, является ли α-субъединица единственным
участником данного процесса, определяющим то, какой именно из эффекторов
должен быть активирован на следующем этапе сигнального каскада, или же
βγ-димер также участвует в этом процессе? В течение долгого периода време-
ни господствующим постулатом в этом вопросе было утверждение «α, а неβ».
Согласно данному постулату, именно α-субъединица играет главную роль в
определении того, какой именно из эффекторных белков будет активировать-
100 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
ся G-белком, в то время как димеру βγ отводилась неспецифическая функция,
сводящаяся к связыванию α-субъединицы, переводя ее при этом в неактивное
состояние, обладающее повышенным сродством к G-белок-связывающему до-
мену рецептора. Данное положение было, однако, впоследствии пересмотрено
в связи с появлением данных о том, что димер βγ способен непосредствен-
но
активировать мембранные K
+
-каналы. Тем не менее, теория о преимуще-
ственной связи функций G-белков с α-субъединицей и в настоящее время на-
ходит свое отражение в номенклатуре G-белков, согласно которой, например,
G
s
-белки, несущие α
s
-субъединицу, активируют аденилатциклазу. Данная но-
менклатура сохранилась до настоящего времени, несмотря на наличие данных
о том, что как α-субъединица, так и βγ-димер могут модулировать активность
эффекторных ферментов и ионных каналов. Кроме того, показано, что одна и та
же α-субъединица может образовывать комплекс с различными βγ-димерами.
Показано, что α-субъединицы могут осуществлять свои сигнальные функции
как независимо, так и совместно с βγ-димерами (Clapham, Neer, 1993). Более
того, β- и γ-субъединицы могут образовывать βγ-димеры в различных комбина-
циях. Согласно принятой номенклатуре G-белков, названия G
i
, G
p
(или G
q
) и G
0
обозначают G-белки, которые, соответственно, ингибируют аденилатциклазу,
активируют фосфолипазу С или же модулируют активность ионных каналов.
Исследования генома человека показали, что в нем присутствуют гены, коди-
рующие 27различных типов α-субъединиц, 5β
s
-субъединиц и 13γ
s
-субъединиц.
Функции известных на сегодняшний день субъединиц G-белков представлены
в таблицах 6.1 и 6.2.
Таблица 6.1
Функции некоторых α-субъединиц G-белков
Класс Вариант
Модулирующий
токсин Функция
α
s
α
s
, α
olf
Vibrio cholerae
Активирует аденилатциклазу,
модулирует Ca
2+
-каналы
α
i
α
i–1
, α
i–2
, α
i–3
, α
0
, α
z
Bordetella pertussis
Ингибирует аденилатциклазу,
модулирует K
+
- и Са
2+
-каналы
α
t
α
gust
, α
t–1
, α
t
Vibrio cholerae
и Bordetella
pertussis
Активирует цГМФ-фосфодиэ-
стеразу
α
q
α
q
, α
11
, α
14
, α
15
, α
16
– Активирует фосфолипазу С
α
12
α
12
, α
13
– Регулирует обмен Na
+
/K
+
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана