Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / Библиотека им академика М.И. Перельмана / Книга_5555_Библиотеки_им_академика_М_И_Перельмана
.pdf
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 131
Аутофосфорилирование протеинкиназы происходит в том случае, когда две
соседние субъединицы холофермента связывают кальмодулин. При высокой ча-
стоте поступления активирующего сигнала интервал между пиками активности
CaMK II оказывается слишком коротким для эффективного дефосфорилирова-
ния или диссоциации кальмодулина, что повышает вероятность аутофосфорили-
рования.
Главным сайтом аутофосфорилирования является аутоингибиторный сег-
мент, расположенный внутри кольца, состоящего
из каталитических и регуля-
торных доменов. Каждая из субъединиц может независимо связывать СаМ и ак-
тивироваться. Однако для аутофосфорилирования требуется участие соседней
с ней субъединицы. Кроме того, субъединица, которая подвергается аутофосфо-
рилированию, должна быть связана с СаМ для того, чтобы произошло смещение
аутоингибиторного домена, приводящее к открытию сайта фосфорилирования.
Отдельные низкочастотные сигналы могут быть слишком короткими и количе-
ство доступного СаМ в такой ситуации может быть ограниченным, что приводит
к активации только некоторых субъединиц в холоферменте. Таким образом, каж-
дый из таких сигналов может приводить только к частичной активации CaMK II.
Однако, когда две соседние субъединицы оказываются одновременно связанны-
ми с СаМ, происходит аутофосфорилирование, которое приводит к пролонгации
их активности, поскольку фосфорилированные субъединицы обладают большим
сродством к СаМ и пребывают в связанном с ним состоянии дольше, чем длится
сигнализация со стороны Са
2+
. Даже после того как СаМ диссоциирует из ком-
плекса, аутофосфорилированные субъединицы сохраняют частичную активность
в течение некоторого времени до тех пор, пока не произойдет их дефосфорили-
рование. При низкой частоте поступления сигналов длительности промежутков
между их поступлением оказывается достаточно для того, чтобы СаМ диссоци-
ировал и субъединицы фермента подверглись дефосфорилированию. В резуль-
тате каждый поступающий к клетке сигнал вызывает отдельный пик активации
CaMK II, которая не достигает максимально возможного значения. Однако при
высокой частоте поступления сигналов некоторые субъединицы остаются в ауто-
фосфорилированном состоянии и связанными с СаМ. Поэтому последовательно
поступающие сигналы будут приводить к большему количеству СаМ, связанному
с холоферментом, что, в свою очередь, будет повышать вероятность аутофосфо-
рилирования и задержки СаМ в связанном с CaMK II состоянии. Таким образом,
CaMK II способна реагировать на частоту поступающих к клетке сигналов.
Протеинкиназа CaMK II фосфорилирует большое количество различных
белков, отвечающих за регуляцию синаптической передачи. Например, фосфо-
рилирование белка синапсина I, который содержится в составе синаптических
везикул, при участии CaMK II приводит к снижению эффективности контакта си-
наптических везикул с молекулами актина, присутствующими в нервных оконча-
ниях. С другой стороны, фосфорилирование синапсина I приводит к активации
высвобождения нейромедиатора при высокой частоте поступления нервных
132 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
импульсов, по-видимому, благодаря активации передвижения везикул в область
секреции медиатора. Ингибирование CaMK II в нейронах гиппокампа или же ин-
дукция мутации, приводящей к замене остатка Thr в сайте аутофосфорилирова-
ния на Ala, блокирует возможность долговременной активации этой протеинки-
назы. Животные, имеющие такую мутацию, обладают пониженной способностью
к пространственному ориентированию, функция которого реализуется на уровне
гиппокампа.
6.8.3. Структура и функции протеинкиназы С (ПКС)
Семейство протеинкиназ С (ПКС) объединяет в себе достаточно большое
количество различных протеинкиназ, активность большинства из которых ре-
гулируется при участии фосфатидилинозитол-зависимой сигнальной системы.
ПКС представляет собой мультифункциональную протеинкиназу, участвующую
в регуляции большого разнообразия клеточных процессов, включая экзоцитоз
и эндоцитоз нейромедиаторных везикул, нейрональную пластичность, экспрес-
сию генов, регуляцию клеточного роста, клеточного цикла, а также активность
ионных каналов и рецепторов. Основной особенностью фосфатидилинозитол-за-
висимого сигнального механизма является то, что в нем ДАГ и Са
2+
одновремен-
но действуют как два вторичных посредника, действие которых направлено на
активацию ПКС.
Представители семейства ПКС обладают различными структурно-функцио-
нальными свойствами. В отличие от ПКА, ПКС представляет собой мономерный
белок с молекулярной массой 78–90кДа, содержащий каталитический, регуля-
торный и целевой домены в пределах одной полипептидной цепи. Каждая из изо-
форм ПКС содержит регуляторный домен и несколько субдоменов в N-концевой
части полипептидной цепи и каталитический домен, который локализован в
С-концевой части молекулы (рис.6.18). В настоящее время наиболее детально
исследована только одна из изоформ ПКС, которая содержит все типы доменов,
присущие протеинкиназам этого семейства и обозначается как типичная ПКС
(тПКС). Домены обозначаются как V1-домен, который содержит аутоингибитор-
ный или псевдосубстратный домен, присутствующий во всех изоформах ПКС,
С1-домен, богатый остатками Cys, отвечающий за связывание ДАГ и форболо-
вых эфиров, С2-домен, ответственный за чувствительность к Са
2+
, связывание
фосфатидилсерина, а также анкерных белков, V3-домен, представляющий собой
шарнирную область, чувствительную к действию протеаз, С3/4-каталитический
домен и домен V-5, который также, по-видимому, выполняет анкерные функции.
Помимо тПКС известны также другие более разнообразные группы изоформ
ПКС. Одна из групп таких изоформ получила название «новой» ПКС (нПКС).
Представители протеинкиназ данной группы не содержат истинного домена С2 и
в силу этого не проявляют чувствительности к Са
2+
. Еще один класс протеинкиназ
этого типа объединяет в себе так называемые атипичные ПКС (аПКС), в составе
которых отсутствует домен С2, а также первый из двух Cys-богатых доменов, от-
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 133
вечающих за связывание ДАГ. Представители данного класса протеинкиназ не
проявляют чувствительности ни Са
2+
, ни к ДАГ.
Механизм активации ПКС наиболее хорошо исследован на примере тПКС.
Генерация ДАГ, которая происходит в результате активации фосфатидилинози-
тол-зависимого сигнального каскада, приводит к повышению сродства тПКС
к Са
2+
и фосфатидилсерину (ФС). Несмотря на то, что липазы, гидролизующие
триацилглицеролы (ТАГ-липазы), также участвуют в образовании различных
форм ДАГ, sn-1,2-диацилглицерол, являющийся единственным изомером ДАГ,
способным эффективно активировать ПКС, образуется только при расщеплении
ФИФ
2
под действием фосфолипазы С. При поступлении активирующего сигнала
к клетке происходит транслокация тПКС из цитоплазмы к мембране клетки и к
элементам цитоскелета, где она вступает во взаимодействие с комплексом ФС-
Са
2+
-ДАГ. Это приводит к смещению аутоингибиторного домена, который до этого
блокировал каталитический центр фермента, и активации тПКС подобно тому,
как это происходит в случае с ПКА и CaMK II.
Транслокация ПКС происходит не только в область клеточной мембраны.
Некоторые из изоформ ПКС транслоцируются в различные участки цитоплаз-
мы, где они взаимодействуют с анкерными белками, которые также называют
рецепторами для активированной ПКС (RACK, от англ. receptors for activated C
kinase). Отдельные изоформы ПКС могут подвергаться транслокации в область
цитоскелета, мембраны, перинуклеарного пространства и ядра, где они связы-
ваются с различным анкерными белками, по-видимому, с помощью доменов С2
и/или V1 и V5. В неактивном состоянии участок полипептидной цепи ПКС может
закрывать RACK-связывающий домен, предотвращая таким образом транслока-
цию. Механизм активации ПКС может, следовательно, заключаться как в сме-
щении аутоингибиторного сегмента и открытии каталитического центра, так и
в открытии RACK-связывающего центра. В настоящее время окончательно не
ясно, синтезируется ли ДАГ только в плазматической мембране с последующим
образованием комплекса ПКС-ФС-ДАГ и его диффузией в области локализации
RACK-рецепторов, или же некоторые количества ДАГ могут образовываться не-
посредственно в цитоплазме.
ПКС также может принимать конформации, обладающие протеинкиназной
активностью вне зависимости от присутствия вторичных мессенджеров, и может
также в связи с этим рассматриваться как когнитивная протеинкиназа. Еще до
того, как стала известна роль Са
2+
и ДАГ в обратимой активации ПКС, данная проте-
инкиназа была идентифицирована в форме своего неактивного предшественника,
который активировался in vitro при помощи Са
2+
-протеолиза с образованием фраг-
мента, обладающего постоянной (конститутивной) ферментативной активностью,
который получил название протеинкиназы М (ПКМ). Активация ПКС в физиологи-
ческих условиях in vivo также может приводить к образованию ее ПКМ-подобных
форм. Имеются сведения о том, что длительная стимуляция клеток может приво-
дить к долговременной активации ПКС независимо от присутствия в цитоплазме
134 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
надпороговых концентраций Са
2+
или ДАГ. Данная активность, по-видимому, связа-
на с образованием ПКМ-подобных или иных модифицированных форм ПКС. Ксуб-
стратам ПКС относятся, в частности, рецепторы NMDA и AMPA.
6.8.4. Роль тирозинкиназ в регуляции роста
и дифференцировки клеток
Протеинкиназы, фосфорилирующие остатки Tyr в белках, участвуют в регуля-
ции разнообразных клеточных процессов, главными из которых являются рост,
пролиферация и дифференцировка клеток. Механизмы передачи сигнала, осу-
ществляющиеся при участии тирозинкиназ, часто включают каскады фосфори-
лирования одних протеинкиназ другими протеинкиназами, которые в конечном
счете фосфорилируют и активируют Ser/Thr-протеинкиназы, фосфорилирующие
ферменты и факторы транскрипции, ответственные за формирование физиоло-
гического ответа клетки. В настоящее время наиболее детально изучены два
класса тирозинкиназ. Первый класс представлен семейством рецепторов, об-
ладающих тирозинкиназной активностью, которая активируется при присоеди-
нении к этим рецепторам факторов роста и митогенов, таких как фактор роста
нервов (NGF, от англ. nerve growth factor), эпидермальный фактор роста (EGF, от
англ. epidermal growth factor), инсулин, фактор роста тромбоцитов (PDGF, от англ.
platelet-derived growth factor), мозговой фактор роста (BDNF, от англ. brain derived
growth factor) и др. Второе семейство тирозинкиназ, таких как, например, Src, Shc,
Grb, Erk, представляет собой растворимые протеинкиназы, которые также уча-
ствуют в регуляции клеточного роста и нейрональной пластичности, но активиру-
ются внеклеточными лигандами не напрямую, а опосредованно. Классическим
примером тирозинкиназ такого рода является семейство митоген-активируемых
протеинкиназ (МАПК, MAPK, от англ. mitogen-activated protein kinases) (рис.6.19).
Тот факт, что фосфорилирование белков может осуществляться по раз-
личным аминокислотным остаткам (Ser, Thr, Tyr) при участии различных про-
теинкиназ, указывает на необходимость строгого контроля этих процессов.
Действительно, в настоящее время известно, что некорректная активация тех
или иных сигнальных механизмов может приводить в действие многие проон-
когены, превращая их в онкогены. В клетках содержится гораздо больше Ser/
Thr-протеинкиназ, нежели тирозинкиназ, а также их потенциальных мишеней.
Поэтому случайное фосфорилирование белков-мишеней тирозинкиназ пред-
ставляется менее вероятным, что делает этот механизм более надежным в отно-
шении регуляции таких жизненно важных процессов, как рост, пролиферация и
дифференцировка клеток.
Еще одним примером сигнального механизма, осуществляемого при участии
тирозинкиназ, является путь, опосредованный так называемыми Янус-киназами
семейства JAK и получивший название JAK-STAT-сигнального механизма.
Данный сигнальный механизм характерен для многих гормонов, факторов роста,
интерферонов и цитокинов (рис.6.20).
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 135
Рис. 6.19 — МАПК-зависимый сигнальный каскад:
1 — Grb-2/mSOS — цитозольный белок, который нековалентно присоединяется
к фосфорилированному рецептору при участии субстратов рецептора, протеинкиназ
Src или Shc; 2 — образовавшийся комплекс взаимодействует с G-белком Ras; в этот
комплекс включаются также белки, которые обеспечивают отделение от Ras ГДФ и
присоединение ГТФ; 3 — активированный Ras соединяется с протеинкиназой Raf-1,
вследствие чего происходит ее активация; 4, 5 — активированная Raf-1-киназа запускает
каскад реакций фосфорилирования и активации других протеинкиназ: киназы киназы
митоген-активируемой протеинкиназы (МАПКК), киназы митоген-активируемой
протеинкиназы — МАПК. МАПК фосфорилирует многие
цитоплазматические белки и факторы транскрипции.
136 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Рис. 6.20 — Механизм передачи сигнала через мембранные рецепторы,
ассоциированные с Янус-киназами (JAK/STAT) (приводится по: Биохимия, 2020):
1 — гормон взаимодействует с мембранным рецептором и вызывает его
димеризацию. Янус-киназы (цитоплазматические тирозинкиназы, имеющие два
активных центра) связываются с димером мембранного рецептора, что приводит к их
активации и аутофосфорилированию; 2 — Янус-киназы (JAK) фосфорилируют димер
рецептора по остаткам Tyr; 3 — комплекс фосфорилированного димера рецептора
с JAK связывает особые цитоплазматические белки STAT, которые фосфорилируются
под действием JAK; 4 — фосфорилированные белки STAT активируются,
образуя димер; 5 — димер STAT перемещается в ядро клетки, где связывается
с промоторными участками ДНК, действуя как фактор транскрипции.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 137
Присоединение лиганда вызывает димеризацию рецептора, а присоедине-
ние Янус-киназ (JAK) — к их аутофосфорилированию и активации. JAK в свою
очередь фосфорилируют рецептор по остаткам Tyr, в результате чего рецептор
связывается с другими белками, называемыми белками— переносчиками сиг-
нала и активаторами транскрипции (STAT, от англ. signal transducer and activator
of transcription). Далее следует инициируемый тирозинкиназой каскад реакций
фосфорилирования. Белки STAT фосфорилируются,
образуют димеры и транс-
портируются в ядро клетки, где они связываются с промоторными областями
ДНК и модулируют экспрессию различных генов.
6.9. Протеинфосфатазы
Протеинфосфатазы, принимающие участие во внутриклеточной сигнализа-
ции в клетках нейронов и глии, принято подразделять на две группы: фосфосе-
рин-фосфотреонин фосфатазы (ФСФ) и фосфотирозин фосфатазы (ФТФ) (Hunter,
1995; Price, Mumby, 1999). Протеинфосфатазы катализируют реакцию гидролиза
сложноэфирной связи между фосфатной группой и боковыми радикалами остат-
ков Ser, Thr и Tyr с высвобождением неорганического фосфата (Ф
н
) и дефосфо-
рилированного белка. По своему биологическому действию протеинфосфатазы
являются антагонистами протеинкиназ и осуществляют регуляцию таких про-
цессов, как высвобождение нейромедиаторов, генерация потенциалов действия,
экспрессия генов, синтез белка, а также рост, пролиферация и деление клеток.
Протеинфосфатазы принято подразделять на несколько групп, обозначаемых
как PP-1, PP-4, PP-5, PP-2А, PP-2В и PP-2С, на основании природы
их субстратов,
ингибиторов и потребности в двухвалентных катионах металлов (таблица 6.3).
Таблица 6.3
Характеристики протеинфосфатаз
Протеинфосфатаза Характеристика Ингибиторы
PP-1
Восприимчива к
фосфоингибитору-1 и
фосфо-DARPP-32 (от
англ. 32-kD dopamine
and cAMP regulat-
ed phosphoprotein,
DARPP-32)
Слабо чувствительна
кокадаевой кислоте
PP-4 Локализована в ядре
Высоко чувствительна
кокадаевой кислоте
PP-5 Локализована в ядре
Средне чувствительна
кокадаевой кислоте
138 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
Протеинфосфатаза Характеристика Ингибиторы
PP-2A
Имеет регуляторные
субъединицы; не ну-
ждается в присутствии
двухвалентных ионов
металлов
Высоко чувствительна
кокадаевой кислоте
PP-2B (кальцинейрин)
Са
2+
-кальмодулин-
зависимая, содер-
жит регуляторную
CnB-субъединицу FK506, циклоспорин
PP-2C
Нуждается в присутствии
Mg
2+
ЭДТА
Рецепторные протеин-
фосфатазы
Локализованы в плазма-
тической мембране
Ванадиевая кислота,
эрбстатин
Нерецепторные протеин-
фосфатазы
Присутствуют в раз-
личных клеточных
компартментах Ванадиевая кислота
Протеинфосфатазы
сдвойной специфич-
ностью Локализованы в ядре Ванадиевая кислота
Ранее было показано, что РР-1 преимущественно осуществляет дефосфори-
лирование β-субъединицы киназы гликогенфосфорилазы, в то время как РР-2А
преимущественно дефосфорилирует α-субъединицу этого фермента.
Среди ФСФ
только активность протеинфосфатазы РР-2В (кальцинейрин) регулируется вто-
ричным посредником (Са
2+
-кальмодулин). По пространственной структуре проте-
инфосфатазы РР-1, РР-4, РР-5, РР-2А и кальцинейрин проявляют высокую степень
гомологии, но отличаются от РР-2С. Семейство ФТФ является более обширным
по сравнению с ФСФ и включает протеинфосфатазы с двойной специфичностью,
которые способны осуществлять дефосфорилирование как остатков фосфоти-
розина, так и остатков фосфосерина и фосфотреонина. Протеинфосфатазы се-
мейства ФТФ могут являться как цитозольными, так и мембраносвязанными
ферментами, имеющими в своем составе внеклеточные домены, что позволяет
регулировать их активность путем связывания либо растворимых, либо мембра-
носвязанных внеклеточных сигнальных молекул.
6.9.1. Строение и принципы регуляции РР-1
и кальцинейрина
Структура и принципы регуляции РР-1 и кальцинейрина в настоящее время
исследованы наиболее детально. Доменная структура каталитических субъеди-
ниц данных протеинфосфатаз показана на рис.6.21.
6. Молекулярные механизмы внутриклеточной сигнализации в нервной ткани 139
Рис. 6.21 — Доменная структура некоторых Ser/Thr-протеинфосфатаз (Price, Mumby,
1999).
Три главные протеинфосфатазы (РР-1, РР-2А и кальцинейрин) имеют гомо-
логичные каталитические домены, но различаются строением регуляторных
доменов.
РР-1 представляет собой белок с молекулярной массой 35–38кДа, большая
часть полипептидной цепи которого участвует в формировании каталитическо-
го домена. В С-концевом участке имеется сайт фосфорилирования, с помощью
которого осуществляется регуляция активности РР-1. Каталитические домены
РР-1, РР-2А и кальцинейрина характеризуются высокой степенью гомологии
(Price, Mumby, 1999).
В клетках молекулы РР-1 и РР-2А обычно бывают связаны с различными ан-
керными и направляющими молекулами. Например, в гепатоцитах РР-1 обычно
связана с гранулами гликогена, в скелетных мышцах этот фермент обычно ас-
социирован с миофибриллами, в нейронах головного мозга РР-1 также связана
с шапероновыми белками, структура которых в настоящее время точно не уста-
новлена. В печени фосфорилирование направляющей субъединицы РР-1 приво-
дит к высвобождению каталитической субъединицы из комплекса с гранулами
гликогена и снижению уровня дефосфорилирования ее белков-мишеней вблизи
местонахождения направляющей субъединицы, так как снижает локальную кон-
центрацию РР-1. Направленная активность РР-1 также регулируется ее внутри-
клеточными природными ингибиторами. Например, высвобождение каталитиче-
ской субъединицы РР-1 из комплекса с направляющей субъединицей делает ее
более восприимчивой к действию ингибитора-2.
Ингибирование РР-1 двумя другими ингибиторами, а именно ингибитором-1 и
DARPP-32 (от англ. dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein, Mr=32000Да),
регулируется путем фосфорилирования/десофорилирования этих белков. В го-
ловном мозге более распространен ингибитор-1, чем DARPP-32. Последний ши-
роко представлен в нейронах спинного мозга, в полосатом теле, бледном шаре и
черной субстанции. Как ингибитор-1, так и DARPP-32 способны оказывать инги-
140 О. Л. Кундупьян, А. С. Фомина, М. Ю. Бибов. Основы нейробиологии
бирующее действие на РР-1 только после того, как сами они подвергнутся фосфо-
рилированию со стороны ПКА или ПКG. ПКА также усиливает восприимчивость
РР-1 к ингибированию посредством ее высвобождения из комплекса с направ-
ляющей субъединицей. Многие белки являются одновременно субстратами как
для ПКА, так и для РР-1, в связи с чем скорость
и уровень их фосфорилирования
при увеличении активности ПКА возрастают при одновременном снижении уров-
ня их дефосфорилирования путем ингибирования активности РР-1. Ингибитор-1,
ингибитор-2 и DARPP-32 представляют собой белки, оказывающие селективное
ингибирующее действие на РР-1. Кроме того, существуют фармакологические
ингибиторы протеинфосфатазной активности. Например, окадаевая кислота,
которую получают из некоторых морских динофитовых водорослей, оказывает
онкогенное действие, связанное с ингибированием РР-1 и РР-2А, в отличие от
форболовых кислот, чьи неопластические эффекты связывают с их влиянием на
активность ПКС. При воздействии на клетки окадаевой кислоты и ее произво-
дных уровень фосфорилированных белков в них существенно увеличивается.
6.9.2. Протеинфосфатаза-1 (РР-1)
Согласно данным рентгеноструктурного анализа каталитической субъеди-
ницы РР-1, связанной с микрокристином, представляющим собой циклический
пептидный токсин, обладающий ингибиторным действием, молекула РР-1 пред-
ставляет собой компактный элипсоид, в котором центр связывания субстрата
образован радикалами гидрофобных и кислых аминокислот. РР-1 также являет-
ся металлопротеином, в активном центре которого содержатся два иона метал-
ла, участвующие, по-видимому, в электростатическом взаимодействии с фосфат-
ной группой субстрата. При связывании фосфорилированного белка фосфатная
группа локализуется на границе двух борозд на поверхности молекулы фермен-
та. Связывание субстрата блокируется в присутствии фосфоингибитора-1 или
микрокристина. Аналогичная структура характерна также для кальцинейрина.
6.9.3. Кальцинейрин (РР-2В)
Кальцинейрин представляет собой Са
2+
-кальмодулин-зависимую протеинфос-
фатазу, которая активно экспрессируется в нейронах головного мозга. Молекула
кальцинейрина представляет собой гетеродимер, состоящий из субъединицы А
(CnA) с молекулярной массой 60кДа, которая содержит N-концевой каталитиче-
ский домен и С-концевой регуляторный домен, включающий в себя аутоингиби-
торный сегмент, сайт связывания кальмодулина, а также сайт связывания регу-
ляторной субъединицы В (CnB) с молекулярной массой 19кДа. Субъединица CnB
представляет собой кальмодулино-подобный Са
2+
-связывающий белок, который
присоединяется к шарнирному участку в субъединице CnA. Именно этот участок
отвечает за регуляцию активности кальцинейрина, так как он определяет до-
ступность каталитического центра для молекулы фосфопротеина. Кальцинейрин
до некоторой степени активируется при присоединении Са
2+
к субъединице CnB,
Соседние файлы в папке Библиотека им академика М.И. Перельмана