Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / @xirurgi_2025 / @xirurgi_2025 - 1171 - файл
.pdf
81
В последние десятилетия появляется все больше сообщений об успешном
применении искусственно выращенных клеток кожи как для лечения
обширных, так и глубоких повреждений покровных тканей.
Разработку методов культивирования тканей начали более 100 лет назад.
Но лишь в 40-х гг. XX столетия появились методы, позволяющие
дезагрегировать ткани на отдельные клетки. Это позволило добиваться их
более активной пролиферации, чем в культивируемых тканевых фрагментах.
Культивируемые клетки стали находить практическое применение и
использоваться в научных исследованиях.
На сегодняшний день большинство из 200 типов клеток, образующих
организм человека, не могут эффективно размножаться в искусственных
условиях. Только несколько типов клеток нормальных тканей успешно
размножаются in vitro. К их числу относятся эпидермальные кератиноциты
кожи человека, миобластные предшественники мышечных клеток, клетки
эндотелия, выстилающие камеры сердца, лимфатические и кровеносные
сосуды, мезотелиальные клетки, выстилающие брюшную и плевральную
полости, а также фибробласты.
Первый опыт трансплантации культивированных клеток эпидермиса
принадлежит М.А. Karasek, который в 1968 г. на лабораторных животных
разработал метод трансплантации первичных культур эпидермальных
кератиноцитов. Исследования в этом направлении развивались медленно в
связи с трудностями, возникающими при выращивании клеток в больших
масштабах. Впервые H. Green и J.G. Rheinwald достигли значительного
прогресса в получении больших по площади пластов культивированных
кератиноцитов кожи. Это открыло возможность конструирования различных
вариантов покрытий для закрытия ран.
Впервые клиническое применение культивированных кератиноцитов было
осуществлено в конце 80-х гг. группой сотрудников Массачусетского
технологического центра. После этого появились многочисленные
сообщения о применении культивированных кератиноцитов в практической
медицине. Использование культивированных кератиноцитов для лечения
обширных ожогов позволило частично решить проблему дефицита
донорских ресурсов аутокожи. Однако дальнейшее развитие этой области
требовало решения ряда проблем.
Первая проблема — длительный срок получения трансплантата. Из
биоптата, взятого у больного в первые сутки после травмы, можно получить
достаточный по площади пласт культивированного эпителия с учетом его
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
констрикции только на 21 день, до этого срока раны необходимо как-то
закрывать. С целью сокращения сроков изготовления трансплантатов
проводятся работы по использованию культур аллогенных клеток эпителия,
полученных от доноров. Четкого представления о влиянии аллогенных
кератиноцитов на процессы заживления ран до настоящего времени пока
нет. Ряд авторов утверждает, что аллогенные эпидермальные клетки могут
встраиваться в эпидермис реципиента к 28 дню после трансплантации.
Аллогенные клетки могут приживаться на раневой поверхности больного за
счет потери аллогенными кератиноцитами антигенов гистосовместимости
при их многократном субкультивировании. Считается, что отсутствие в
трансплантате клеток Лангерганса снижает вероятность отторжения
аллогенных клеток. Возможно, что снижение реакции отторжения
аллогенного материала связано с общим снижением иммунологической
реактивности у тяжелобольных. Другое мнение состоит в том, что механизм
действия аллогенных клеток основан на выработке ими многочисленных
цитокинов и факторов роста, стимулирующих эпителизацию с краев раны и
из глубоких придатков кожи.
Второй проблемой при использовании культивированных кератиноцитов
(аутологичных и аллогенных) является высокая степень осложнений
инфекционной природы и лизиса трансплантатов — около 84%. С целью их
устранения были попытки использовать антибактериальные препараты.
Проводились работы, изучающие лекарственные средства как с выраженной
токсичностью, так и максимально безвредные для культивируемых клеток.
Однако ощутимого положительного действия это в борьбе с микрофлорой
ран не дало. Поэтому наиболее эффективным мероприятием по
уменьшению инфекционных осложнений, влекущих за собой гибель
пересаженных трансплантатов, считается ранняя хирургическая обработка
гнойных ран. Приживление культивированных клеток после этого
достигается на 20–80% от всей закрываемой ими площади.
Третья проблема вытекает из особенностей приживления трансплантата из
культивированных кератиноцитов. Приживление клеток на раневой
поверхности происходит через 2 нед после трансплантации. К этому сроку
восстанавливаются все слои эпидермиса. Однако созревание структур,
обеспечивающих механическую прочность кожного покрова (базальной
мембраны, коллагеновых, ретикулярных и эластических волокон)
происходит значительной позже — в течение 3–12 мес. Окончательное
созревание рубца наблюдается через 1–1,5 года. В результате этого у
больных возникают такие патологические изменения нового кожного
покрова, как дискератоз, фокальный паракератоз, гиперпигментация,
82
83
образование эпидермальных волдырей. Некоторые авторы связывают
дефекты реорганизации зоны базальной мембраны в период заживления
ран с изменениями со стороны клеток соединительной ткани —
фибробластов. По данным C.C. Compton, полное восстановление кожи как
органа происходит через 3–5 лет. Такое длительное восстановление
полноценной кожи позволило сделать заключение, что самостоятельное
покрытие ран культивированными кератиноцитами является временным,
лишь на ранних сроках заживления ран, и не обеспечивает формирования
адекватного кожного покрова.
Было замечено, что лучшие результаты приживления кератиноцитов на
раневой поверхности и более стойкий кожный покров получали при
предварительном использовании аллогенной кожи. По данным литературы,
в этом случае приживление составляет 87%. Если прижившуюся аллогенную
кожу перед трансплантацией кератиноцитов удаляли, то приживление
происходило хуже — 76%. При переносе пластов на раневое ложе,
подготовленное с помощью других покрытий, приживление составляло
только 47%. В случае выращивания аутологичных кератиноцитов на
поверхности аллогенной дермы и переносе такого рода комплексов на раны
уровень приживления составил 93,4% (Hikerson W. et al., 1994).
Четвертой проблемой является высокая чувствительность кератиноцитов к
антисептикам, применяемым для местного лечения ран. Воздействие
многих антисептических растворов приводит к гибели пересаженных клеток
(Парамонов Б.А. и др., 2000). Наиболее токсичными для культивируемых
клеточных пластов являются:
• йод и хлорсодержащие антисептики [повидон-йод + [калия йодид]
(Йодопирон♠) сульйодопирон℘, йод + [калия йодид + поливиниловый
спирт] (Йодинол♠), йодинат℘, хлоргексидин];
• галогеносодержащие окислители [растворы водорода пероксида
(Водорода перекиси медицинской♠), электрохимическиактивированные растворы, калия перманганат];
• рецептуры, содержащие этиловый алкоголь [смесь растворов этанола
(Cпирта этилового♠) и нитрофурала (Фурацилина♠)], красители
[метилтиониния хлорид (Метиленовый синий♠), бриллиантовый
зеленый, этакридина лактат];
• антисептические препараты на основе серебра [растворы серебра
нитрата, серебра протеината (Колларгола
♠
)];
• вещества, используемые для обработки хирургического
инструментария и для обработки кожи вокруг ран [первомур натрия
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
гипохлорит, эфир диэтиловый, этанол (Cпирт этиловый
♠
),
медицинский бензин].
Пятая проблема — экономическая. Внедрению в широкую практику
применения культивированных кератиноцитов препятствует не только
сложность и трудоемкость методики их получения, но и высокая цена —
около 400 долл. США за 25 см
2
.
При внедрении метода, в начале 80-х гг. ХХ в., эффективность лечения была
относительно невысокой, но по мере накопления опыта существенно
повысилась. Основное достоинство аутокератинопластики заключается в
том, что после пересадки клеток и их приживления рана более не нуждается
в закрытии.
Дополнением к использованию культивированных кератиноцитов при
лечении поверхностных ожогов и длительно незаживающих ран явилось
применение выращенных in vitro клеток соединительнотканной основы
кожи — фибробластов. Исследования, посвященные изучению раневого
процесса и культивированию эпителиальных клеток кожи, подтвердили
важную роль фибробластов в ходе физиологической регенерации и
заживлении ран. Клетки для выращивания получают из кожи самого
реципиента, донора или трупного материала путем ее механической
фрагментации и ферментативной обработки. В последующем их проводят
(пассируют) через 4–7 последовательно сменяемых питательных сред, пока
не получат хорошо выраженный монослой с элиминированными
поверхностными антигенами гистосовместимости, но сохраненной
потенцией к пролиферации. Для максимального терапевтического эффекта
не достигшие окончательной зрелости клетки в растворе фибриногена или
на фибриновой пленке (для лучшей адгезии к поверхности раны) переносят
на раневую поверхность. При этом используют смешанные культуры,
включающие клетки ауто- и аллогенного происхождения. В отличие от
кератиноцитов фибробласты менее прихотливы, содержат меньше
антигенов гистосовместимости и не требуют сверхсложного оборудования.
Фибробласты могут продуцировать коллагены I и III типа и компоненты
внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тенасцин, хондроитин-4сульфат протеогликан, фибронектин, некоторые факторы роста, а также
факторы, стимулирующие адгезию к коллагену и миграцию кератиноцитов и
другие вещества. Фибробласты во многом определяют направленность и
исход процессов восстановления структуры ткани. Это связано с их
способностью синтезировать, кроме специфического белка тропоколлагена,
84
85
и другие компоненты межклеточного вещества — гликозамингликаны и
фибронектин, участвующие во внеклеточной сборке коллагеновых фибрилл
и ремодулировании соединительной ткани. Большое значение имеют
фибробласты в реализации коллаген-фибронектина и клеточных
взаимоотношений. Одной из основных функций фибробластов является
регуляция своего «микроокружения» и эпителиально-мезенхимального
взаимодействия. Вместе с волокнистыми образованиями фибробласты
создают пространственную структуру (архитектонику) соединительной
ткани. Клеточная поверхность фибробластов, по современным
представлениям, является важной рецепторной зоной, опосредующей
воздействие различных регуляторных факторов.
В нашей стране в этом направлении наиболее известны работы под
руководством академика Российской академии медицинских наук Д.С.
Саркисова и профессора А.А. Алексеева в Институте хирургии им. А.В.
Вишневского (Москва). Новаторство ученых состоит в том, что фибробласты,
использовавшиеся во всех методиках в качестве фидерного слоя, были
использованы как самостоятельная повязка. Основным аргументом
использования фибробластов является их стимулирующее влияние на
эпидермоциты как в культуре клеток, так и в ране. Другой особенностью
метода явилось использование аллогенного материала.
В настоящее время накопилось много данных о значительной роли
факторов роста в механизме раневого процесса, что позволяет во многом
объяснить стимулирующее действие клеток на заживление ран. Так было
выявлено, что фактор роста кератиноцитов (KGF) секретируется
стромальными фибробластами в культуре и экспрессируется in vivo в
области дермы, но не в эпидермисе, что подтверждает его участие в
паракринной регуляции пролиферации кератиноцитов.
Роль культивированных аллотрансплантатов в заживлении хронических
раневых дефектов, вероятнее всего, заключается в следующем. В глубине
раны могут оставаться группы кератиноцитов, относящихся к волосяным
фолликулам или потовым железам. Поскольку условия на поверхности раны
неблагоприятны для миграции и пролиферации кератиноцитов, то они не
покрывают рану, хотя и не погибают. При достаточной стимуляции
аутокринными факторами роста эти «застывшие» кератиноциты начинают
активно размножаться и мигрировать. К такому биологическому ответу
способны и более многочисленные кератиноциты, окаймляющие рану,
которые будут сокращать ее периметр.
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
Другим важным механизмом раневого заживления, в котором активную
роль принимают фибробласты, является контракция раны. Исследованиями
В.В. Терских и соавт. (1990) было показано, что контракция раны — это
сложный процесс, в котором огромную роль играют как клеточные
элементы (фибробласты, кератиноциты), так и химические структуры,
создаваемые и выделяемые этими клетками. Авторами было доказано, что
кератиноциты значительно усиливают способность фибробластов к
контракции раны за счет выделения биологически активных веществ.
Использование донорской кожи для получения культивированных
аллогенных фибробластов человека позволило создать запас клеточных
культур фибробластов. Это сократило период клинического применения
трансплантата до нескольких дней. Время созревания клеток и образования
из них монослоя составляло 24–72 ч. Оптимальный срок использования
культивированных аллофибробластов человека — 3 сут. Это обусловлено
тем, что именно к этому моменту происходило образование фибробластами
активного экстрацеллюлярного матрикса, после чего трансплантат был
пригоден к применению. Трансплантация производилась после химической
некрэктомии на зрелую грануляционную ткань. Метод был успешно
применен при лечении ран у взрослых больных с ожогами II — IIIа ст. В
результате клинического применения культивированных аллогенных
фибробластов человека было установлено стимулирующее влияние
фибробластов на течение раневого процесса, в том числе и в условиях
инфицированной раны.
Комбинированные методы: острый дефицит донорских ресурсов заставляет
использовать для закрытия раневого дефекта кожные лоскуты с большим
коэффициентом перфорации. Современные дерматомы и перфораторы
позволяют эффективно произвести забор кожи практически с любых
участков тела и увеличить площадь лоскутов в соотношении 1:6, 1:8 и более.
Это уменьшает площадь донорских участков и увеличивает площадь
одномоментно закрываемых ран. Однако применение трансплантатов с
перфорацией 1:4 и более имеет свои отрицательные стороны. Так,
удлиняется время эпителизации ран до 3–4 нед. Отмечается высыхание
раневой поверхности в ячейках перфорированного лоскута кожи с
образованием участков вторичного некроза. Большие сетчатые кожные
лоскуты с таким коэффициентом перфорации в 40% случаев лизируются. Это
не позволяет решить проблемы эффективного лечения и профилактики
опасных для жизни осложнений, таких как сепсис, истощение, пневмонии,
зачастую приводящих к неблагоприятному исходу.
86
87
Новый подход в решении проблемы лечения обширных глубоких ожогов
разработан в Институте хирургии им. А.В. Вишневского. Методика основана
на пластическом закрытии ожоговых ран трансплантатами из
культивированных аллофибробластов человека в комбинации с
перфорированными 1:6 или 1:8 сетчатыми кожными аутолоскутами.
Разработанный способ лечения ожоговых ран на основе сочетания
активного хирургического лечения и использования культивированных
аллофибробластов человека во многом предопределил успех в лечении
тяжело обожженных. Патогенетическая суть этой методики определяется
стимулирующим влиянием трансплантированных на рану фибробластов на
пролиферацию эпидермоцитов, сохранившихся в ране, и эпидермоцитов
сетчатых лоскутов аутокожи. Такое влияние обусловливает ускорение
процессов приживления аутодермотрансплантатов с большим
коэффициентом перфорации за счет стимуляции процесса эпителизации
ячеек. Операции с применением культивированных аллофибробластов и
сетчатых кожных лоскутов получили название комбинированной
аутодермопластики с трансплантацией культивированных
аллофибробластов.
Данный метод можно применять и при лечении пациентов с длительно
незаживающими ранами и обширными раневыми дефектами покровных
тканей.
Основной проблемой при проведении данного метода лечения является
сохранение технологической цепочки от отбора биоптатов до
трансплантации на раны. Вырастить, трансплантировать клетки на раневые
поверхности и достичь восстановления кожного покрова можно только при
строгом соблюдении технологического режима.
В последние годы большое внимание уделяется биодеградирующим
материалам, которые, выполняя функцию временного направляющего
матрикса для регенерации, замещались бы постепенно собственными
тканями организма. В настоящее время имеются многочисленные
сообщения об использовании коллагена и его производных для пластики
сосудов и клапанов сердца, трахеи, мочевого пузыря, закрытия кожных
дефектов ожоговой или травматической этиологии, дефектов кости, твердой
мозговой оболочки, роговицы, барабанной перепонки, печени, селезенки, в
качестве шовного рассасывающегося материала, а также в виде
гемостатических средств и тампонов для заполнения костных полостей,
мембран для диализа. Эти работы со временем привели к созданию
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
«дермальных эквивалентов» (ДЭ) — раневых покрытий, по структуре
подобных дерме, эпидермису или коже в целом. Их основой является
коллаген, покрытый в одних случаях силиконом, в других — культурами
эпителиальных клеток. Параллельно исследования развивались в
направлении создания «живого эквивалента дермы», представляющего
собой трехмерный коллагеновый гель, в который имплантируются
фибробласты. Образуется структура, являющаяся эквивалентом дермального
слоя нормальной кожи. Фибробласты, включенные в гель, вызывают его
контракцию и стимулируют разрастание эпителиальных клеток. Этот процесс
сложен и до конца не изучен. Известно, что степень контракции зависит от
концентрации коллагена и количества клеток, от прямого взаимодействия
клеток и фибрилл коллагена, от функционирования цитоскелета и от
содержания в среде сыворотки или факторов роста.
По мере контракции геля и образования фибрилл коллагена
пролиферативная активность фибробластов быстро снижается, и они
переходят в состояние покоя. Образовавшаяся трехмерная структура имеет
очень большое сходство с тканью и может рассматриваться как дермальный
эквивалент, а также как подложка для выращивания эпидермиса.
ДЭ и способ трансплантации должны удовлетворять следующим
требованиям.
• Подготовка ДЭ должна быть обеспечена в течение 2–3 нед с
момента взятия аллогенного биоптата.
• ДЭ не должен требовать сложных методов подготовки раны и
проведения трансплантации.
• Разрабатываемый метод должен обеспечить возможность
проводить перевязку раны и осуществлять контроль за состоянием
раны.
• ДЭ не должен провоцировать размножение гноеродной микрофлоры
в ране и должен позволять использование антибиотиков.
• ДЭ должен обладать эластичностью и достаточной механической
прочностью.
• ДЭ должен обладать хорошей адгезией к ране, не вызывать ее
травмирования и быть устойчивым к действию протеолитических
ферментов раны.
• ДЭ должен обеспечить жизнеспособность и пролиферацию
фибробластов как в культуре, так и после перенесения их на рану.
• Общая толщина ДЭ должна быть около 2 мм, а его площадь в
пределах 20–30 см2.
88
89
• ДЭ должен обладать биосовместимостью, не вызывать
воспалительной, аллергической и прочих неблагоприятных реакций
со стороны организма.
• ДЭ должен обладать достаточной проницаемостью для
питательных веществ, поступающих из раны, и способностью
переживать в течение 3–4 дней до восстановления крово-снабжения
и врастания в него капилляров.
• Строение ДЭ должно обеспечивать возможность модификации и
упрощения методов трансплантации фибробластов.
Первый успешный проект «искусственной кожи» был создан под
руководством V.Y. Jannas и T. Burke в 1980 г. и получил название «Стейдж1». Эта повязка представляла собой двухслойную проницаемую мембрану.
Верхняя часть имитировала эпидермис нормальной кожи, была изготовлена
из пористого силикона и предотвращала потерю организмом жидкости.
Нижняя часть состояла из ковалентно связанных коллагена и хондроитин-6сульфата и служила матрицей для синтеза неодермы. Функциональная
ценность повязки «Стейдж-1» обусловливалась структурной аналогией к
дермальному слою кожи за счет наличия в нижнем (коллагеновом) слое пор
строго определенного диаметра и направленности. За счет этого скорость
биодеградации коллаген-гликозамингликановой части мембраны была
равна скорости миграции мезодермальных клеток с раневой поверхности в
поры с последующим прорастанием этих фокусов мезодермы сосудами и
соединительной тканью. В течение 3–4 нед коллаген-гликозамингликановый
слой искусственной кожи рассасывался и заменялся новой хорошо
васкуляризированной неодермальной тканью. Одновременно с краев ран
наблюдалась миграция эпидермиса на границе между верхним
(силиконовым) и нижним (коллагеновым) слоями повязки. Ценными
свойствами повязки являлись отсутствие антигенных, гемокоагуляционных
свойств и воспалительной реакции на нее тканей организма. Отмечалось
значительное снижение контракции раны и предотвращение развития
грубых стягивающих рубцов. В таких случаях вновь сформированная
соединительная ткань из-за сложного строения пор повязки напоминала
дермальный слой кожи человека.
По мере созревания неодермы на месте коллаген-гликозамингликанового
слоя повязки силиконовую мембрану снимали и накладывали тонкий
сетчатый аутотрансплантат. Необходимость обязательного выполнения
аутодермотрансплантации являлась одним из недостатков повязки «Стейдж1». Однако ее применение позволяло добиться увеличения донорских
ресурсов кожи за счет того, что можно было использовать расщепленные
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
аутолоскуты очень малой толщины. При этом донорские раны
эпителизировались за короткие сроки, что предопределяло возможность с
тех же донорских участков повторно брать трансплантаты 2–3 раза с
недельным интервалом.
С целью сокращения времени образования неоэпителия был разработан
«Стейдж-2», в повязку между ее слоями были добавлены аутологичные
базальные клетки эпителия кератиноциты. Она представляла собой
суспензию выделенных аутологичных кератиноцитов больного, которые
внедряли спринцеванием или центрифугированием в нижний слой повязки.
Примерно через 4 ч «Стейдж-2» накладывали на подготовленные к
трансплантации раневые участки. Внедренные в повязку эпителиальные
клетки мигрировали на границу раздела двух слоев и со временем
сливались в сплошной слой кератинизированного эпителия. Таким образом,
введенные в повязку базальные клетки эпителия росли значительно
быстрее, чем эпителий с краев раны. При этом с помощью использования
генетической маркировки было доказано, что пролиферируют именно
клетки трансплантата.
Позднее было обнаружено, что фибробласты эквивалента дермы несут
только антигены I класса, и это обеспечивает успех применения
трансплантатов, содержащих аллогенные фибробласты. Инфильтрация
трансплантата мононуклеарами была кратковременной и исчезала на 7–9
сут, но отторжения не наблюдалось. Дальнейшие исследования
подтвердили факт отсутствия антигенов гистосовместимости в культурах
фибробластов, используемых для получения дермального эквивалента.
В целом результаты применения повязки «искусственная кожа» показали,
что она имеет некоторые преимущества в сравнении с аутодермопластикой
или гомопластикой ран.
Введение в повязку небольшого количества выделенных аутологичных
клеток эпителия сокращало сроки лечения за счет лучшего приживления на
неодерме тонкого (0,1 мм) лоскута, а реэпителизация донорского участка
была близка к нормальному заживлению.
Использование «искусственной кожи» уменьшило формирование
контрактур и рубцов на месте глубоких дефектов и донорских участках.
Однако эти положительные качества повязок типа «Стейдж» не могли
компенсировать отрицательные свойства:
90
Соседние файлы в папке @xirurgi_2025