Добавил:
Sekretar
kiopkiopkiop18@yandex.ru
t.me/Prokururor I Вовсе не секретарь, но почту проверяю
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз:
Предмет:
Файл:Ординатура / Хирургия / @xirurgi_2025 / @xirurgi_2025 - 1171 - файл
.pdf
141
фосфолипазы, перекисное окисление липидов, нарушает работу
мембраносвязанных ферментов энергетического обмена в клетках, создавая
условия для развития в них энергетического дисбаланса и тканевой
гипоксии. Таким образом, глубокая гипотермия из фактора
противоишемической защиты постепенно превращается в фактор
ишемического повреждения. Применение криопротекторов позволяет
снизить повреждающее действие гипотермии при консервировании.
Защитное действие криопротекторов основано на их способности снижать
температуру кристаллизации воды, увеличивать количество жидкой фазы
при отрицательных температурах и уменьшать количество образующегося
льда. Также исследуется способность криопротекторов предотвращать
температурозависимую деструкцию липидов и макромолекул и сохранять
барьерную функцию мембран. Однако криопротекторы оказывают
токсическое действие на биологические структуры, степень которого зависит
от типа криопротектора, его концентрации, степени очистки и времени
контакта с клетками. Поэтому эффективность применения криопротекторов
определяется, с одной стороны, степенью его защитного действия, а с
другой — его токсичностью. Для сохранения жизнеспособной кожи
наиболее часто используют глицерол (Глицерин♠) в концентрациях 10 и
15%.
Обеспечить сохранение жизнеспособного материала позволяет также выбор
оптимальных режимов замораживания, хранения и размораживания
трансплантатов. В настоящее время в криоконсервировании кожи можно
выделить два направления:
• это замораживание кожи в программных замораживателях с
использованием контролируемых темпов замораживания;
• неконтролируемое замораживание кожи в рефрижераторах с низкими
температурами (в жидком азоте или в емкостях с сухим льдом).
В соответствии с рекомендациями Американской ассоциации тканевых
банков, при хранении жизнеспособной кожи оптимальным является ее
медленное замораживание со скоростью 1–5 °С/мин в программных
замораживателях. Однако такая скорость замораживания может быть
достигнута и без использования программного замораживателя. S.R. May и
соавт. (1981) разработали метод хранения кожи в коробках из полистирола,
в противоположные стенки которых были вмонтированы алюминиевые
пластины. Такой подход позволял замораживать кожу при постоянной
температуре –70 °С со скоростью 1 °С/мин. Авторами также была
проведена оценка жизнеспособности кожи по поглощению глюкозы. Было
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
выяснено, что через 24 ч после хранения кожа сохраняла до 80%
метаболизма глюкозы, что соответствовало замораживанию со скоростью 1
°С/мин до –70 °С в программном замораживателе.
Одним из путей улучшения результатов хранения биологических объектов
при отрицательных температурах является разработка консервирующих
растворов с введением в их состав различных биологически активных
веществ: инсулина, антигистаминных препаратов, глюкокортикоидов.
Улучшить результаты хранения позволяет также использование сыворотки
крови. S.R. May и F.A. De Clement (1980) для хранения жизнеспособной
кожи использовали модифицированную «среду Игла» с 15% раствором
глицерола (Глицерина♠) и 10% раствором человеческой сыворотки.
Кроме методов хранения кожи замораживанием, можно хранить
жизнеспособную кожу при температуре +4 °С. В настоящее время показано,
что наиболее эффективным для кратковременного хранения
жизнеспособной кожи при температуре +4 °С является использование
консервирующих растворов, включающих плазму крови, среды для
культивирования и различные биологические добавки. Режимами хранения
жизнеспособной кожи в настоящее время являются температуры –70, –80 и
–196 °С. Так, например, в банках кожи Великобритании хранение
жизнеспособных трансплантатов осуществляется в фосфатном буферном
растворе с 15% раствором глицерола (Глицерина♠), антибиотиками и
антимикотиками при –80 °С.
Хранение жизнеспособной аллогенной кожи дает возможность для
проведения тестирования донора на наличие особо опасных инфекций и
трансплантатов на бактериальное загрязнение, а также предоставляет
возможность использовать кожу повторно от одного и того же донора,
создание запасов кожных трансплантатов. Жизнеспособная кожа после
хранения может рассматриваться как источник для получения культур
кератиноцитов и фибробластов.
Для обеспечения системного и безопасного применения донорской кожи
созданы тестированные запасы, объединенные в банки кожи. J. Wentscher
использовал банк кожи овец для экспериментальных исследований уже в
1903 г. Банк кожи человека начал функционировать в 1930 г. Первый банк
кожи был основан в 1937 г. в госпитале Cook Country. J.P. Webster (1944)
впервые сообщил о клиническом применении кожных лоскутов,
хранившихся в холодильнике длительное время, до 21 дня. C.C. Bondoc и
J.F. Burke (1971) создали банк хранения кожи для лечения обожженных в
142
143
ожоговом центре в госпитале Массачусетса, а W.C. Trier и K.W. Sell — для
нужд военно-морских сил США в госпитале в Бетезде. Преимуществом
централизованной системы банков кожи является возможность поставки в
хирургические клиники и ожоговые центры аллодермотрансплантатов,
тестированных в соответствии с единым стандартом, а также обеспечение
наличия постоянного запаса кожи на случай чрезвычайных ситуаций, аварий
и катастроф. Такие запасы позволяют временно замещать пораженные
кожные покровы на этапах эвакуации пострадавших и позволяют закрывать
рану в период лечения. Важно, что запасы кожных трансплантатов создают
возможность широко использовать аллогенную кадаверную кожу. Банки
кожи действуют в США, Великобритании и других странах Европы. Они
активно используются для лечения раненых и больных, в том числе и в
вооруженных силах. Например, в настоящее время в США имеется 42
ассоциированных тканевых банка. Ежегодно производится более 100 000
трансплантации аллогенной кожи, 500 000 — аллогенной кости, 50 000 —
аллогенной роговицы.
В СССР первый центр по консервированию тканей был создан в 1947 г. при
Ленинградском институте переливания крови под руководством профессора
А.Н. Филатова. Однако в настоящее время в нашей стране фактически
отсутствуют структуры, предназначенные для хранения тестированных
запасов аллогенных тканей, отсутствуют доступные технологии заготовки,
хранения и использования аллогенной кожи.
Рост числа травм, ожогов, больных с длительно незаживающими ранами, а
также старение населения обусловливают необходимость поиска новых
малотравматичных и относительно недорогих методов для местного
лечения ран, в том числе с использованием жизнеспособных
аллодермотрансплантатов.
5.2. Подбор доноров
Необходимым условием для сохранения физиологических свойств и
хорошего приживления аллодермотрансплантата является его
жизнеспособность, которая во многом определяется технологией забора,
зависит от выбранного консерванта и метода хранения
аллодермотрансплантата.
В лаборатории проблем клеточной пролиферации Института биологии
развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук был проведен ряд
исследований, направленных на определение сроков забора кадаверной
жизнеспособной кожи после смерти донора (Васильев А.В., 2002). О
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
жизнеспособности кожи судили по жизнеспособности основного типа
клеток эпидермиса — кератиноцитов. Для определения их
жизнеспособности был использован комплекс методов: культивирование
выделенных кератиноцитов in vitro, тест на исключение кератиноцитами
красителя — трипанового синего и оценка синтеза белка по включению
меченого лейцина. Кроме этого, для оценки структуры кожи было
применено гистологическое исследование.
Исследования по выращиванию эпидермальных кератиноцитов,
выделенных из кожи после различных способов хранения от живых доноров
и кадаверов, взятой в различные сроки после смерти, позволили выделить
четыре основных варианта их культивирования (Федоров Д.Н., 2002).
Первый вариант — при нормальном росте и развитии культуры
наблюдается следующая последовательность формирования многослойного
пласта кератиноцитов. На первые сутки после посадки начинается
прикрепление клеток к субстрату. Прикрепление посеянных кератиноцитов
полностью заканчивается примерно через 48 ч. К этому же сроку
формируются мелкие колонии кератиноцитов. На 4–6-е сутки происходит
некоторое уменьшение площади уже образовавшихся колоний и
открепление части клеток. На 6–7-е сутки роста культура переживает кризис,
в течение которого некоторые колонии могут исчезнуть. На этой стадии
роста культуры обычно еще не наблюдаются заметные зоны роста клеток.
Однако к 8–10-м суткам начинается активное увеличение колоний в
размерах. К этому времени формируются обширные колонии с активным
ростом клеток по периферии. Колонии сливаются и к 16–20-м суткам
образуют многослойный пласт кератиноцитов.
Данный вариант формирования культуры характерен для клеток,
полученных из кожи живых доноров, и является обычным в практике
выращивания эпителиальных пластов с целью их последующей
трансплантации. Он может быть принят как показатель жизнеспособности
кожи.
Второй вариант — формирование культуры происходит не до конца и
останавливается на стадии образования колоний. Количество
прикрепившихся клеток ко вторым суткам культивирования при таком типе
развития культуры меньше, чем в первом случае. Также меньше и
количество мигрирующих из кусочков клеток. К тому же часть
прикрепившихся кусочков в последующем откреплялась. В дальнейшем из
оставшихся кусочков формировались немногочисленные колонии на
144
145
площади менее 50% поверхности культурального флакона. При
последующем культивировании в центре таких колоний образовывались
зоны некроза и постепенно наступала гибель культуры в течение 7–10 сут.
Такой тип формирования культуры обусловлен низким процентом клеток,
способных дать начало образованию колоний. Поэтому в дальнейшем в
связи с преобладанием гибели клеток над ростом культуры формирование
эпителиального пласта не происходит. Однако при внесении клеток в
большей концентрации в результате культивирования может быть получен
многослойный эпителиальный пласт.
Третий вариант культивирования характеризуется постепенной гибелью
культуры после прикрепления кусочков и миграции из них клеток. После
посадки к подложке прикреплялись единичные кусочки. Ко вторым суткам
культивирования из части прикрепившихся кусочков мигрировали клетки.
Формирования зон роста не происходило. К 3–5-м суткам культивирования
выползшие из кусочков кератиноциты откреплялись. В последующем
откреплялись и кусочки. Уровень жизнеспособности такой кожи крайне
низкий.
В четвертом варианте культура кератиноцитов была представлена в
основном единичными клетками и конгломератами роговых чешуек, не
прикреплявшихся к подложке. Такая кожа является нежизнеспособной.
Для того чтобы дать не только качественную, но и количественную
характеристику выживаемости кожи после хранения и объяснить описанный
выше феномен, необходимо было использовать дополнительную оценку
жизнеспособности кожи. Для этого применялись два метода:
• тест на исключение клетками красителей (трипановый синий);
• определение уровня синтеза белка эпидермальными кератиноцитами.
Для начала определили результаты этих методов для заведомо
жизнеспособной кожи, взятой от здорового живого донора. При
культивировании получен многослойный пласт кератиноцитов. Количество
клеток, не включающих краситель, составило в среднем 87%.
Радиоактивность включившегося лейцина на 100 тыс. клеток (имп./мин)
2086±212.
Сравнение результатов культивирования эпидермальных кератиноцитов с
результатами, полученными при окрашивании клеток трипановым синим,
Количество клеток, не
включающих краситель (%)
Результаты культивирования
83
Многослойный пласт кератиноцитов
65
Колонии на площади менее 50%
поверхности культурального флакона
53
Постепенная гибель культуры после
прикрепления клеток к подложке
23
Единичные клетки, не прикрепляющиеся к
подложке
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
показало наличие корреляции между процентом живых клеток в коже и
эффективностью их культивирования (табл. 5.1).
Данное исследование также позволило выделить четыре основных
результата культивирования кератиноцитов. Многослойный эпителиальный
пласт удается получить, если количество живых (не включающих краситель)
кератиноцитов в коже составляет в среднем 83%. В случае если количество
живых клеток составляет 65%, при культивировании удается получить
колонии кератиноцитов на площади менее 50% поверхности флакона. На
основании положительных результатов культивирования был сделан вывод
— полученные значения количества живых клеток могут быть приняты как
показатель того, что кожа жизнеспособна. Количество живых клеток 53% и
ниже, ввиду неспособности кератиноцитов к пролиферации, было принято
как показатель того, что кожа нежизнеспособна.
Таблица 5.1. Зависимость между количеством живых кератиноцитов и
результатами культивирования
Другим методом оценки жизнеспособности кожи было определение уровня
синтеза белка эпидермальными кератиноцитами. Результаты, полученные
при использовании данного метода, были также сравнены с результатами
культивирования кератиноцитов. Проведенное исследование показало, что
низкий уровень синтеза белка кератиноцитами не свидетельствует
однозначно о гибели клеток. Прогноз выживаемости клеток по уровню
синтеза белка менее определенный, чем при оценке жизнеспособности по
исключению клетками трипанового синего. Поэтому данный метод не
может использоваться в качестве основного при оценке жизнеспособности
кожи, однако возможно его привлечение как вспомогательного.
146
147
Были выбраны два основных критерия для оценки жизнеспособности кожи
(Федоров Д.Н., 2002):
• по количеству живых кератиноцитов в коже;
• по результату их культивирования.
Основным источником для создания запасов жизнеспособных
трансплантатов и получения аллогенных трансплантатов кератиноцитов
является кадаверная кожа. С целью определения возможных сроков ее
забора была оценена жизнеспособность кожи в различные сроки после
смерти донора.
Было проведено исследование жизнеспособности кожи от 20 доноров,
взятой в сроки от 3 до 21 ч после смерти. Было установлено, что
многослойный эпителиальный пласт может быть получен из кожи, взятой в
течение 17 ч после смерти. Такая кожа характеризовалась высоким уровнем
синтеза белка и большим процентом живых клеток. Анализ роста культур не
выявил каких-либо отличий в сравнении с нашим опытом выращивания
кератиноцитов из кожи живых доноров.
Таким образом, кожа, взятая в течение 17 ч после смерти, может
использоваться для создания запасов жизнеспособных кожных
трансплантатов.
Однако поскольку одним из факторов, определяющих конечный результат
хранения, является исходная жизнеспособность кожи, предпочтительным
является использование кожи, полученной в как можно более ранние сроки
после смерти. При этом необходимо учитывать возраст доноров,
сопутствующую патологию, сроки и причину смерти, а также условия
хранения трупа после смерти. В жаркое время года или при нахождении
трупа в помещении с температурой выше 20 °С явления атолиза
развиваются быстрее. В этих случаях предельно допустимые сроки должны
быть сокращены до 3–4 ч после смерти. Однако, если труп в указанные
сроки поместить в холодильную камеру с температурой 4 °С, допустимый
срок забора может быть увеличен до 17 ч после смерти.
С целью выбора оптимальных условий хранения было изучено влияние
различных сред и температурных режимов на жизнеспособность кожи.
Учитывая данные литературы и собственный опыт, в качестве основы для
консерванта были использованы культуральные среды. Было проведено
исследование жизнеспособности кожи после хранения при +4 °С в трех
Тип раствора
Количество клеток, не включающих краситель (в
процентах от числа живых клеток в коже в день
взятия биоптата)
«Среда 199»
92
«Среда Игла»
82
Физиологический
раствор
53
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
растворах: «среде Игла», «среде 199» и физиологическом растворе (табл.
5.2).
Таблица 5.2. Количество не включающих краситель кератиноцитов в коже
после хранения в различных средах при +4 °С в течение 7 дней
Наибольшее количество живых клеток сохранялось в коже, хранившейся в
«среде 199». Уровень синтеза белка кератиноцитами такой кожи также был
выше, чем в коже после хранения в других растворах. Таким образом, в
качестве основы для консерванта была выбрана «среда 199», а в качестве
криопротектора — глицерол (Глицерин
♠
).
Для сохранения жизнеспособности кожи при отрицательных температурах
хранения эффективным оказалось введение в консервант факторов роста. С
этой целью использовали эпидермальный фактор роста, основывались на
его способности предотвращать апоптоз в клетках, выполнять трофические
функции и увеличивать продолжительность жизни кератиноцитов в
культуре. Было установлено, что эпидермальный фактор роста улучшает
результаты хранения. Снижение количества живых клеток при внесении
данного фактора уменьшилось в среднем на 29%, тогда как в коже,
хранившейся без эпидермального фактора роста, количество живых клеток
снижалось в среднем на 47%.
В результате исследований был создан оригинальный консервант
«Криодерм» для хранения жизнеспособной кожи при отрицательных
температурах.
В качестве температурного режима хранения выбраны два температурных
режима: –18 и –70 °С. Выбор этих температур определяется наличием
соответствующего оборудования в оте-чественных клиниках и
рассматривается как перспективный для последующего внедрения в
клиническую практику. Кроме того, температурный режим –18 °С легко
достижим в морозильных камерах обычных бытовых холодильников.
148
149
С целью определения максимальных сроков хранения кожи в
разработанном консерванте при –70 °С и при –18 °С изучили динамику
сохранения ее жизнеспособности (Васильев А.В., Федоров Д.Н., 2002).
Предельный срок хранения при –18 °С составил 45 сут. Оценка
жизнеспособности кератиноцитов проводилась каждые 5 сут. В разные
сроки хранения количество живых клеток в коже было неодинаковым.
Снижение жизнеспособности кожи происходило равномерно. Каждые 5
дней количество живых клеток уменьшалось в среднем на 12%. К 10-м
суткам количество живых кератиноцитов в коже уменьшилось в среднем на
26%. При высокой исходной жизнеспособности кожи это позволяло
получать полноценные колонии кератиноцитов. К 15-м суткам хранения
количество живых кератиноцитов снижалось в среднем на 40% от исходного
уровня. При этом результаты культивирования были отрицательными даже
при высокой исходной жизнеспособности кожи (рис. 5.1).
Рис. 5.1. Падение количества жизнеспособных клеток в процессе хранения
в консерванте «Криодерм» при –18 °С
Использование более низкого температурного режима (–70 °С) позволило
увеличить срок наблюдения до 90 сут. К этому времени количество живых
клеток в эпидермисе снижалось в среднем на 52%. Падение
жизнеспособности кожи происходило неравномерно. Наибольшее
снижение количества живых клеток наблюдалось в интервале от 0 до 15 сут.
Снижение количества живых клеток к 45 сут составляло в среднем 29%. При
высокой исходной жизнеспособности кожи это позволяло получать при
культивировании колонии кератиноцитов. Исходя из полученных данных,
был сделан вывод, что предельным сроком хранения кожи с высокой
Данная книга рекомендована к покупке и прочтению на форуме сайта https://meduniver.com/
исходной жизнеспособностью при –18 °С является 10 сут. При –70 °С этот
интервал может быть увеличен до 30–45 сут. В случае замораживания кожи
при –70 °С флаконы с консервантом и кожей предварительно помещали в
пенопластовые коробки с толщиной стенки 1 см. Через сутки коробку
удаляли.
В случае хранения при –196 °С биоптаты и консервант запаивали в
фольгированные пакеты, выдерживающие глубокое замораживание.
Замораживание осуществляли прямым погружением пакетов с кожей и
консервантом в жидкий азот. Этот режим перспективен в случае создания
Банков кожи, так как кожа остается жизнеспособной не менее одного года.
Окончательно же определить возможные сроки хранения каждого
конкретного образца кожи можно, лишь только зная его исходную
жизнеспособность.
Эффективность хранения кожи по разработанному методу была
подтверждена в эксперименте. С этой целью использовали метод
аутотрансплантации криопрезервированной кожи на гранулирующие раны у
крыс линии Вистар.
Проведенные исследования показали, что кожа после хранения в
разработанном консерванте приживается и функционирует так же, как и
кожа, не подвергавшаяся хранению. После хранения в консерванте,
содержащем эпидермальный фактор роста, происходит иммобилизация
части эпидермального фактора роста на аллодермотрансплантат, что
оказывает влияние на репаративные процессы, протекающие в ране.
Исследования, выполненные И.А. Чекмаревой и соавт. (2000),
свидетельствуют, что при лечении ран биологически активным покрытием с
иммобилизированным эпидермальным фактором роста происходит
достоверная активация функциональных и пролиферативных процессов в
сосудистых клетках (эндотелиоцитах и перицитах) и фибробластах,
увеличивается количество межклеточных контактов. В результате
выраженной активации пролиферативных процессов происходит ранняя
дифференциация клеток фибринобластического ряда и, как следствие,
ускоряется эпителизация раневого дефекта.
Применяемый консервант является достаточно простым в использовании и
не требует больших материальных затрат.
При работе по забору кожных трансплантатов руководствовались
следующими официальными документами.
150
Соседние файлы в папке @xirurgi_2025