Ферментные препараты, получаемые из генетически модифицированных микроорганизмов

Комитет экспертов по пищевым добавкам на своих совещаниях неоднократно рассматри­вал вопросы, связанные с оценкой безопас­ности и формулированием спецификаций для ферментных препаратов, используемых в про­цессе обработки и производства пищевых про­дуктов. В связи с развитием генной инжене­рии появилась необходимость оценки препара­тов, полученных из генетически модифициро­ванных микроорганизмов. Заявка на оценку специфических ферментных препаратов, ис­точником которых являются генетически мо­дифицированные микрооргнанизмы, была представлена в Комитет экспертов впервые лишь в начале текущего десятилетия — в 1990 году.

Рассмотрение метода получения с опреде­лением идентичности и чистоты вещества яв­ляется важной составной частью оценки без­опасности любой пищевой добавки. Использо­вание метода генетической модификации обес­печивает получение новых факторов, являю­щихся дополнительными по отношению к тем, которые связаны с получением ферментных препаратов традиционными методами.

Возникающие в этих случаях сомнения, ка­сающиеся безопасности препаратов, в извест­ной мере уменьшаются за счет того, что ак­тивные компоненты ферментных препаратов, полученных из трансгенных источников, сходны с аналогичными компонентами фер­ментных препаратов, полученных традицион­ными способами и оказавшихся безопасными в ходе ранее проведенной оценки. Важно также добиться того, чтобы вредные загрязнения не были внесены в конечный продукт организ­мом, являющимся источником генетического материала. Такие загрязнения могут быть вне­сены в процессе клонирования переносимого генетического материала или генетического Конструирования производственных штаммов микроорганизмов; кроме того, загрязнения мо­гут явиться результатом использования мето­дов генетических манипуляций. При этом не­обходимо обращать внимание на возможное наличие жизнеспособных клеток трансгенных микробов-источников, экспрессию плазмид или носителей, а также на наличие фрагмен­тов ДНК и неферментных белков.

При рассмотрении ферментных препара­тов, получаемых из генетически модифициро­ванных микроорганизмов, отмечает Комитет экспертов, следует также учитывать латент­ную способность организма донора или хозя­ина к токсинообразованию. В этих случаях важнейшее значение имеет идентичность ор­ганизмов, играющих роль доноров и проме­жуточных и окончательных хозяев переноси­мого генетического материала. При определе­нии объема требующихся тестов, включая токсикологическую оценку конечного продук­та, большое значение имеют данные о пред­шествующей экспозиции человека к данным микробам или об их предшествующем изуче­нии.

Для оценки ферментных препаратов, полу­ченных из генетически модифицированных микроорганизмов, в Комитет должны быть представлены полностью документированные таксономические данные о соответствующих микроорганизмах с подробным описанием ме­тодов их идентификации. Вместе с тем, как отмечает Комитет экспертов по пищевым до­бавкам, необходимо поощрять использование фирмами-производителями национальных и международных коллекций культур, в ка­честве эталонных материалов, способствующих идентификации коммерчески используемых микроорганизмов.

Комитет отметил, что возможности, созда­ваемые методами биотехнологии и генетиче­скими манипуляциями, влияют не только на создание новых источников ферментов, но и на производство других классов пищевых до­бавок.

Остановимся кратко на некоторых препа­ратах, полученных из генетически модифици­рованных микроорганизмов.

а-АМИЛАЗА из BACILLUS STEARO­THERMOPHILUS, ЭКСПРЕССИРОВАН-НАЯ в BACILLUS SUBTILIS. а-амилаза -ферментная субстанция, вырабатываемая экс­трацеллюлярно путем регулируемой фермента­ции штамма Bacillus subtilis (АТСС 39 705), содержащего ген для а-амилазы из В. ste­arothermophilus (АТСС 39 709), введенный с плазмидой рСРС720. Были проведены острые кратковременные и репродукционные исследо­вания с лиофилизованными ферментными препаратами.

Комитет экспертов отметил при рассмотре­нии этого ферментного препарата, что проце­дуры генетической модификации проводились с четко документированным непатогенным и нетоксигенным микробным штаммом. Исполь­зованный носитель pUBllO был четко охарак­теризован и применялся в течение нескольких лет в качестве клонируюшего переносчика для Bacillus subtilis. Плазмидный комплекс рСРС720, содержащий ген для а-амилазы был введен в В. subtilis (АТСС 39 705) с помощью стандартной процедуры трансформации. Имеющиеся к настоящему времени данные свидетельствуют о том, что у микроорганиз­мов, продуцирующих а-амилазу, отсутствует устойчивость к антибиотикам, и они не выра­батывают токсин, подобный токсину, выраба­тываемому бактериями Шига, и энтеротоксины А, В, С и D.

Культивирование В. subtilis проводили в строго контролируемых условиях с использо­ванием сред, содержащих ингредиенты, обыч­но используемые для получения путем фер­ментации особо чистых веществ (пищевого ка­чества). Бульон, применяющийся в процессе ерментации, фильтровали, а фильтрат лио-илизировали перед смешиванием с пробным рационом.

При сравнении с а-амилазой из В. stearo-thermophilus (АТСС 39 709) было отмечено, что лиофилизированный препарат обладает такими же показателями энзимспецифической активности, относительной молекулярной мас­сы, пептидных карт и реактивности по отно­шению к антителам, вырабатываемым против а-амилазы из В. stearothermophilus (АТСС 39 709). Этот препарат не оказывал выраженных токсикологических эффектов в опытах на со­баках, получавших в течение 13 недель испы­туемое вещество в дозах до 0,20 г/кг массы тела. Точно так же не было отмечено заметных эффектов в процессе изучения репродуктивной функции, проведенного на одной генерации крыс, когда одна часть потомства получала препарат в дозах до 0,50 г/кг массы тела на протяжении 14 недель после прекращения грудного вскармливания.

Для данного ферментного препарата было определено «неуточненное» допустимое суточ­ное потребление.

а-АМИЛАЗА из BACILLUS MEGATERI-UM, ЭКСПРЕССИРОВАПНАЯ в BACILLUS SUBTILIS — а-амилаза, вырабатываемая экс-трацеллюлярно путем регулируемой фермента­ции штамма Bacillus subtilis В1-109 (АТСС 39 701), содержащего ген для а-амилазы из В. megaterium (NCIB 11 568), введенный с плаз-милой рСРС800.

Комитетом экспертов были рассмотрены данные, относящиеся к использованным про­цедурам генетической модификации, харак­терным свойствам микробов-продуцентов, процессу ферментации, а также к острым, кратковременным и репродуктивным исследо­ваниям, проводшзшимся с лиофилизирован-ными ферментными препаратами.

Было отмечено, что процедуры генети­ческой модификации проводились с четко до­кументированными непатогенными и нетокси-генными штаммами микроорганизмов. Плаз­мидный комплекс рСРСвОО, содержащий ген для а-амилазы из В. megaterium и стимули­рующий участок гена для а-амилазы из В. stearothermophilus, был введен в В. subtilis (АТСС 39 701) с помощью стандартных про­цедур трансформации. В Комитет были пред­ставлены данные, свидетельствующие о том, что микроорганизмы, продуцирующие а-ами­лазу, не обладают устойчивостью к антибиоти­кам, не вырабатывают «Шига-подобный» ток­син, и у них отсутствует потенциал инфектив-ности, связанный с а-амилазой.

Культивирование В. subtilis проводили в строго контролируемых условиях. В готовом продукте амилазы не было обнаружено ника­ких жизнеспособных клеток или плазмидной ДНК.

Лиофилизированный препарат не вызывал выраженных токсикологических эффектов в течение 13-недельных опытов на собаках, по­лучавших испытуемое вещество в дозах до 0,57 г/кг массы тела в день. Не было выяв­лено и нарушений репродуктивной функции в соответствующих исследованиях, проведенных на одной генерации крыс. В течение 13 недель после прекращения грудного вскармливания, часть потомства крыс получала препарат в до­зах до 1,35 г/кг массы тела в день.

Для этого ферментного препарата было установлено «неуточненное» допустимое су­точное потребление.

ХИМОЗИН А, получаемый из штамма ESCHERICHIA COLI К-12, СОДЕРЖАЩЕ­ГО ГЕН ТЕЛЯЧЬЕГО ПРОХИМОЗИНА А. Химозин А — ферментный препарат, получае­мый из генетически модифицированного штам­ма Escherichia соН К-12. В распоряжение Ко­митета экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым до­бавкам были представлены данные, относя­щиеся к молекулярной конструкции плазмид, экспрессирующих химозин, характеристике микробов-продуцентов, процессу фермента­ции, биохимической и энзиматической харак­теристике рекомбинантного энзима и кратко­срочным исследованиям по введению энзим­ного продукта с кормом.

В данном случае в качестве организма-хо­зяина для экспрессионной плазмиды pPFZ 87А был использован четко охарактеризован­ный штамм Е. СоН; плазмида была получена из широко клонирующего носителя — pBR322. Кодирующая последовательность прохимозина А, которая была введена в плаз-миду pBR322, вначале была синтезирована химическим путем, причем было показано, что она идентична естественному гену теленка.

Плазмидный комплекс был введен в организм хозяина с помощью стандартной процедуры трансформации; при этом ампициллинрези-стентный ген, который несла плазмида, был использован в качестве маркера для выбора трансформированных клеток. Генетическая стабильность трансформированных клеток была продемонстрирована в процессе повтор­ных субкультивирований.

Трансформированные клетки культивиро­вались в строго контролируемых условиях и с использованием питательных сред, содержа­щих ингредиенты, обычно употребляемые для получения путем ферментации веществ пище­вого качества. Прохимозин А выделяли из микроорганизмов-продуцентов после разрыва и разделения клеток. Остаточные клетки инак-тивировались путем подкисления, Необходимо отметить, что процесс подкисления также обеспечивал и активацию прохимозина А с пе­реходом его в химозин А.

Затем активный фермент очищали хрома-тографически и обрабатывали обычно исполь­зуемыми для приготовления коммерческих ферментных препаратов стабилизаторами и консервантами.

Для того чтобы убедиться, что рекомби-нантный фермент идентичен в химическом и функциональном отношениях бычьему химо­зину А, проводили его детальную характери­стику.

Результаты изучения микробиологической чистоты этого ферментного продукта свиде­тельствовали об отсутствии микробов-проду­центов, минимальном переносе эндотоксина из стенок бактериальных клеток и наличии лишь незначитель-ных количеств токсина, подобного токсину, вырабатываемому бактериями Шита. Остаточная ДНК, обнаруженная в небольшом количестве в ферментном продукте, состояла из коротких фрагментов без какой-либо замет­ной генетической активности.

В ходе продолжавшегося 1 месяц кратко­срочного изучения этого ферментного про­дукта в опытах на крысах не было обнару­жено никаких побочных эффектов при введе­нии химозина в максимальной дозе, состав­лявшей 5 мг/кг массы тела в день.

С учетом имеющейся информации о без­опасности препарата и чрезвычайно низком уровне его поступления в организм человека с продуктами, вырабатываемыми пищевой про* мышленностью, для рекомбинантного химо­зина А было установлено «неуточненное» ДСП.

ХИМОЗИН В, получаемый из гриба AS­PERGILLUS NIGER VAR. AWAMORI, СО­ДЕРЖАЩЕГО ГЕН ТЕЛЯЧЬЕГО ПРОХИ­МОЗИНА В. Микроб-хозяин — штамм GC delta АР4 Aspergilus niger var. awamori был получен из исходного штамма NRRL3112 после ряда генетических манипуляций. Дан­ный микроб-хозяин имел свойства ауксотрофа и нуждался для своего роста в уридине и ар­гинине; эти свойства штамма служили марке­рами для его выбора при последующих гене­тических манипуляциях. В данном случае от­сутствовал также ген, кодирующий аспергил-лопепсин А — зкстрацеллюлярную аспараги-новую протеиназу, которая вызывает расщеп­ление химозина и является причиной неприят­ного запаха сыра.

Экспрессионная плазмида pGAMpR была сконструирована на основе плазмиды pBR322 — широко применяющегося клонирующего носителя, а последовательность гена прохимо­зина В была получена из ткани желудка те­ленка.

Сконструированная экспрессионнеая плаз­мида была введена в геном микроорганизма-хозяина с помощью стандартной процедуры трансформации. Потенциальная патогенность полученного при этом микроорганизма, проду­цирующего химозин В, изучалась в опытах на мышах в течение 4 недель после перорального введения однократной дозы штамма. Признаки патогенности при этом не выявлялись.

Культивирование клеток проводили в стро­го контролируемых условиях с использова­нием сред и ингредиентов, необходимых в по­добных случаях. Клетки секретировали химо­зин В в его зрелой форме. Это вещество выде­ляли из фильтрационного бульона методом жидкостно-жидкостной экстракции с полиэти-ленгликолем после удаления клеток из среды. Полученный при этом неочищенный фермент в дальнейшем хроматографически очищали, а очищенный химозин доводили до степени коммерческой активности с помощью ингреди­ентов, обычно используемых в коммерческих ферментных препаратах.

Рекомбинантный фермент был детально охарактеризован. Было показано, что он знзи-матически и иммунологически идентичен те­лячьему химозину В. Данный фермент отли­чался от телячьего химозина В только по сте­пени гликолизации; в остальном эти субстраты были биохимически идентичны.

Препарат химозина В испытывали в отно­шении других видов возможной ферментной активности; во всех случаях данная актив­ность либо совсем не обнаруживалась, либо выявлялась в весьма низкой степени. Резуль­таты дополнительных исследований указывали на отсутствие микотоксинов, антимикробной активности, остаточных количеств полиэтилен-гликоля и микробов-продуцентов.

В ходе краткосрочных (в течение 90 дней) опытов по кормлению крыс не было отмечено никаких побочных эффектов при введении препарата химозина в дозах до 10 мг/кг массы тела в день. Отрицательные результаты были также получены в ряде стандартных тестов на мутагенность и кластогенность.

Учитывая имеющуюся информацию о без­опасности этого вещества и его исключительно низком поступлении в организм, связанном с приготовлением пищи для рекомбинантного препарата химозина В, было установлено «неуточненное» допустимое суточное потреб­ление.

ХИМОЗИН В, получаемый из дрожжей KLUYVEROMYCES LACTIS, СОДЕРЖА­ЩИХ ГЕН ТЕЛЯЧЬЕГО ПРОХИМОЗИ-НА В. При оценке этого ферментного препара­та, получаемого из генетически модифициро­ванных дрожжей Kluyveromyces 1 act is методом ферментации, Комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам отметил, что микроб-хо­зяин плазмиды, экспрессирующей химозин, был первоначально получен из молочных про­дуктов; он известен как источник коммерче­ского препарата лактазы. Данный микроб не оказывает на человека ни токсигенного, ни па­тогенного действия.

В качестве клонирующего носителя для ко­дирующей последовательности прохимозина В была использована плазмида pUC18. После­довательность была воспроизведена с по­мощью процедуры, включающей несколько этапов, начиная с изоляции и очистки мРНК препрохимозина из желудка теленка. Была приготовлена последовательность комплемен­тарной ДНК (кДНК) к мРПК препрохимо­зина, которая была затем клонирована в плаз-миду pBR322, введена в штамм Escherichia coli, играющей роль промежуточного хозяина, и идентифицирована методом ДНК-секвениро-вания. Изолированная последовательность прохимозина была введена в плазмиду pUC18, а экспрессионная плазмида — интегрирована в геном микроба-хозяина с помощью стандарт­ной процедуры трансформации. Трансформи­рованные клетки были идентифицированы по их устойчивости к аминогликозиду G418.

Культивирование трансформированных дрожжевых клеток проводили в среде, содер­жащей особо чистые вещества, обычно приме­няющиеся в процессе ферментации. В про­цессе культивирования прохимозин В выде­лялся в среду. Процесс ферментации остана­вливали путем воздействия кислотой; этим до­стигалась также активация прохимозина В с переходом его в химозин В. После удаления продуктов клеточного распада, проводимого путем фильтрации, фильтрат, содержащий хи­мозин В, дополнительно очищали с помощью нескольких циклов клеточной фильтрации и концентрировали путем ультрацентрифугиро­вания. Ферментный препарат обрабатывали материалами, обычно применяющимися в сы­роварении.

Рекомбинантный фермент был детально охарактеризован. При этом было показано, что он биохимически, знзиматически и имму-нологически идентичен бычьему химозину В. Степень чистоты рекомбинантного фермента, согласно полученным данным, была значи­тельно более высокой, чем у сычужного экс­тракта. Данные об антимикробной активности отсутствовали. Кроме того, в очищенном фер­менте не было выявлено других протеаз, об­наруживаемых остатков ДНК или жизнеспо­собных дрожжевых клеток.

Комитет экспертов рассмотрел результаты различных стандартных токсикологических тестов, проведенных с препаратом рекомби­нантного энзима. В ходе острых опытов по изучению токсичности, проведенных на кры­сах, получавших однократную пероральную дозу препарата энзима, равную 5 г/кг массы тела, не было обнаружено никаких признаков токсического действия. При кормлении крыс на протяжении 21 или 91 дня сыром, приго­товленным с рекомбинантным -химозином, в дозе 5 г в день, не было отмечено никаких эффектов, связанных с этим продуктом. В ходе других исследований также было отме­чено, что введение препарата рекомбинант­ного энзима в рацион крыс в дозе 1 г/кг массы тела на протяжении 90 дней не приво­дило ни к каким побочным эффектам. Иссле­дования по определению генотоксичности in vitro показали, что рекомбинантный химо­зин В не обладает мутагенными свойствами.

Для рекомбинантного препарата химози­на В допустимое суточное потребление уста­новлено как «неуточненное».

ФИКСАТОРЫ МИОГЛОБИНА

К фиксаторам миоглобина относятся веще­ства, обеспечивающие стойкий розовый цвет мясным изделиям.

В таблице 21 представлены основные веще­ства, применяемые в качестве фиксаторов ми­оглобина:

НАТРИЙ (НИТ-

АЗОТИСТОКИСЛЫЙ РИТ НАТРИЯ);

АЗОТНОКИСЛЫЙ НАТРИЙ (НИТРАТ НАТРИЯ);

АЗОТНОКИСЛЫЙ КАЛИЙ (НИТРАТ КАЛИЯ).

Таблица 21

Фиксаторы миоглобина

Наименование пищевой добавки	Назначение пищевой добавки		Наименование продукта, в который разрешена добавка		Допустимая концентрации (мг/кг)
Азотистокислый натрий (нитрит ватрия)	Для фиксации цвета мясвых изде­лий и предотвращения вспучива-впя сыров		Колбасный фарш (баночные консервы)		50
			' Сосиски, ветчина		200
Наименование шоцевой добавки		Назначение пищевой добавки		Наименование продукта, в который разрешена добавка		Допустимая концентрация (мг/кг)
				Консервы, соленое мясо		200
				Колбасы вареные		50-150
Азотнокислый калий (нитрат калия)		Для фиксации цвета мясный изде­лий, антимикробный консервант		Сосиски		1000
				Икра ястыковая		1000
Азотнокислый натрий (нитрат натрия)		Для фиксации цвета мясных изде­лий, антимикробный консервант; предотвращает раннее вспучива­ние сыров		Колбасы, ветчина		300
				Консервы		300
				Брынза		300
				Сыры		300

Рассмотрим эти вещества подробнее.

Наибольшее гигиеническое значение в группе фиксаторов миоглобина имеют НИТ­РИТЫ и НИТРАТЫ (азотистокислый натрий, азотнокислый натрий и азотнокислый калий), которые добавляют в колбасные изделия, со­сиски, свинокопчености, некоторые деликатес­ные мясные Консервы, а также в посолочные смеси при посоле мяса с целью сохранения «е-стественной» красно-розовой окраски этих продуктов. Кроме того, нитрит натрия и нит­рат калия применяют при производстве брынз и сыров для предотвращения' из раннего вспу­чивания. Нитраты обладают также некоторым консервирующим действием. Часто нитраты и нитриты используют в комбинации.

В колбасном производстве вводимая в кол­басный фарш селитра (нитраты) в' количестве 0,05-0,1% в результате жизнедеятельности де­нитрифицирующих бактерий восстанавливает­ся до нитритов. Нитриты, вступая в связь с пигментами мяса (миоглобином"), образуют ве­щество красного цвета — нитрозогемоглобин, переходящий при тепловой обработке в гемох-ромоген, который и сообщает колбасам стой­кий красный цвет. Таким образом, в обеспече­нии сохранения красного цвета колбасных из­делий играют роль не столько нитраты, сколь­ко нитриты. В то же время восстановление нитратов до нитритов возможно лишь при дос­таточно высокой жизнедеятельности денитри­фицирующих бактерий, что не всегда удается обеспечить. Это послужило обоснованием бо­лее широкого использования в качестве фикса­тора миоглобина непосредственно нитритов. Однако нитриты обладают большей токсичнос­тью по сравнению с нитратами, что требует строгой дозированности и равномерности рас­пределения в массе фарша, а также контроля за приготовлением раствора, его введейием в фарш и сроками хранения.

Переходя к вопросу о токсичности, следует остановиться на данных биохимических иссле­дований о том, что наиболее важной реакцией после всасывания нитритов в кровь является превращение гемоглобина в метгемоглобин. Так, установлено, что 1 г нитрита способен превратить в метгемоглобин примерно 1855 г гемоглобина.

Токсичность нитритов зависит, главным об­разом, от количества метгемоглобина, образу­ющегося в организме после его введения, а также от способности организма- вновь превра­щать метгемоглобин в гемоглобин.

Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пище­вым добавкам установлена безусловно допус­тимая суточная доза нитритов для человека на уровне 0-0,4 мг, а условно допустимая — 0,4-0,8 мг на 1 кг веса тела. Добавление нитрита натрия в продукты, предназначенные для грудных детей абсолютно недопустимо.

(В нашей стране пытались заменить фикса­тор миоглобина нитрит на ЭРИТРАЗИН. В ряде стран этот краситель используется, од­нако известно, что эритразин является ингиби­тором сукцинатдегидрогеназы и оказывает слабое мутагенное действие. Имеются также данные о том, что эритразин является допол­нительным источником поступления йода в ор­ганизм, что необходимо учитывать.)

Биологические действие нитратов также за­ключается в том, что в пищеварительном трак­те под влиянием кишечной микрофлоры нит­раты способны восстанавливаться до нитритов. Если восстановление нитратов происходит до его выделения из организма, то может насту­пить отравление. При наличии диспепсии та­кой эффект может наблюдаться у детей в воз­расте до 6 месяцев.

Накопление метгемоглобина в крови приво­дит к той или иной степени гипоксии. Кроме того, нитраты и нитриты оказывают угнетаю­щее действие на пищеварительные ферменты, в частности на панкреатическую липазу и ще­лочную фосфатазу.

Объединенный комитет экспертов ФАО/ ВОЗ Но пищевым добавкам установил, что уровень суточной дозы нитратов, не вызыва­ющий значительных токсических явлений у животных на протяжении примерно всей жизни, составляет 500 мг/кг веса тела, или примерно 1% от общего количества пищи. Бе­зусловно допустимой суточной дозой нитрата натрия для человека установлено 0-5 мг/кг (в расчете на нитрат-ион), а условно допус­тимой — 5—10 мг на 1 кг веса. Следует отме­тить, что добавление нитратов в продукты детского питания абсолютно недопустимо, так как высокая чувствительность грудных детей и особенная чувствительность грудных детей, страдающих диспепсией, не позволяет опре­делить допустимые дозы нитратов для них.

При определении нитратно-нитритной на­грузки на организм следует также учиты­вать поступление этих солей с водой.

В настоящее время по совокупности накоп­ленных клинических и экспериментальных на­блюдений применение нитратов и нитритов вызывает все большую озабоченность медицин­ских работников и требует дальнейшего изуче­ния, а также поиска заменителей нитратов и нитритов. В этой связи проблема нитратов и нитритов заслуживает особого внимания. Да­вайте рассмотрим ее.

НИТРАТЫ, НИТРИТЫ В ПИЩЕ

Нитраты, нитриты и другие азотсодержа­щие соединения в пищевых продуктах в насто­ящее время привлекают особое внимание гиги­енистов. В пище современного человека доля колбасных изделий, изготовленных с примене­нием нитратов и нитритов, в последние годы возрастает. Систематическое поступление в ор­ганизм повышенных количеств нитратов, нит­ритов и нитрозаминов чревато неблагоприят­ными сдвигами в жизнедеятельности и здоро­вье, возрастанием риска онкологических забо­леваний. В силу изложенного, содержание нитратов, нитритов, нитрозаминов и некото­рых других азотсодержащих соединений в пи­ще современного человека стало одной из ак­туальных проблем пищевой токсикологии, в которой еще много нерешенного. Не подлежит сомнению: необходимо стремиться к тому, что­бы содержание названных соединений в пише человека свести к минимуму. Нитраты и дру­гие азотсодержащие соединения широко рас­пространены не только в пище, но и в биосфе­ре вообще — они широко присутствуют в во­де, почве.

Токсикология нип.

Часть нитритов и нитратов, поступивших в пищеварительный канал, метаболизируется микрофлорой желудка и кишок, а остальное количество легко всасывается. В зависимости от микрофлоры кишок, рП среды и характера пищи могут образовываться различные азотсо­держащие соединения, способные всасываться. Всасывание происходит главным образом в желудке. В течение 8 часов выделяется с мо­чой 42-90% введенных нитратов. Наивысшее содержание метгемоглобина в крови обнару­живается через 2-3 часа после приема воды с нитратами. Концентрация нитратов в моче и слюне пропорциональна количеству, введенно­му в организм. Одним из путей образования нитритов в организме человека является вос­становление нитратов слюны под воздействием микрофлоры полости рта. В слюне человека обычно содержится нитритов 1-10 мг/л. Пос­ле потребления 100 мг нитратов концентрация нитритов в слюне нарастает примерно на 15-20 мг/л.

НИТРИТЫ, поступая из кишок в кровь, взаимодействуют с гемоглобином, окисляя двухвалентное железо, в результате чего обра­зуется нитрозогемоглобин, трансформирую­щийся в метгемоглобнн и частично в сульфге-моглобин. В патогенезе острой нитритной ин­токсикации основную роль играет трансформа­ция гемоглобина в метгемоглобнн, неспособ­ный осуществлять обратимое связывание кис­лорода. Вследствие уменьшения кислородной ёмкости крови развивается клиническая карти­на гипоксии. 1 мг нитрита натрия может пере­вести в метгемоглобин около 2000 мг гемогло­бина.

атов и нитритов

Пороговой дозой нитрит-иона, вызываю­щей достоверное повышение концентрации метгемоглобина в крови людей, является при­мерно 0,05 мг/кг массы тела. Среднее содер­жание метгемоглобина в крови нормальной по­пуляции людей — 2%, при 8-10% может отме­чаться бессимптомный цианоз, при 30% и бо­лее — симптомы острой интоксикации (одыш­ка, тахикардия, цианоз, слабость, головная боль), а при 50% и более возникает опасность для жизни. Токсичность нитритов зависит как от дозы, так и от способности организма с по­мощью метгемоглобинредуктазы восстанавли­вать метгемоглобин в гемоглобин. Чем меньше возраст грудных детей, тем тяжелее протекает нитритная интоксикация, так как у них час­тично или полностью отсутствует в эритроци­тах метгемоглобинредуктаза. Кроме того, эмб­риональный гемоглобин быстрее окисляется нитритами. Скорость окисления гемоглобина, вплоть до периода половой зрелости, посте­пенно уменьшается, а затем резко снижается.

Для крыс ЛДяо нитритов составляет 85 мг/кг массы тела, т. е. нитриты относятся к умеренно токсичным химическим веществам. Эпидемиологические наблюдения, сделанные при случайных отравлениях нитритами, когда нитрит натрия ошибочно применяли вместо поваренной соли, позволили сделать вывод, что острое отравление отмечается при однора­зовой дозе 200-300 мг, а летальная доза для человека составляет 300-2500 мг, причем бо­лее низкая для детей и лиц старческого воз­раста.

Однократное введение 100-150 мг нитритов вызывает у человека покраснение кожи лица, снижение артериального давления, учащение пульса, ощущение шума в голове. При введе­нии 300 мг отмечается обильное потение, си-нюшность кожи, одышка, головокружение, а иногда — преходящее расстройство зрения.

Наблюдались и тяжелые, иногда группо­вые, интоксикации различными колбасными изделиями, содержавшими, вследствие оши­бочного применения, большие концентрации нитритов — от 200 до 6570 мг/кг продукта. Описаны и случаи нитритной метгемоглобине-мии при употреблении рыбы, обработанной нитритом натрия. Один из описанных случаев закончился летально, действующая доза соста­вила 33 мг/кг масеы тела.

В последние годы широко изучается хрони­ческое действие нитритов, хотя они, как и нит­раты, относятся к слабо кумулятивным токси­кантам. В экспериментальных исследованиях, в которых в течение 2 лет поили крыс водой, содержащей 0, 100, 1000, 2000 и 3000 мг/л нитритов, или 0, 5, 50, 100 и 150 мг/кг массы тела соответственно, не наблюдалось суще­ственных различий от контроля в приросте массы тела-, развитии, смертности и содержа­нии гемоглобина. У крыс, получавших воду со 100 мг/л нитритов, уровень метгемоглобина увеличивался лишь в первые 2 месяца наблю­дения, а у животных, которым вводили другие дозы, содержание повысилось соответственно до 5, 12 и 22%, У этих же животных обнару­живались дистрофические изменения в ткани печени, селезенке и сердечной мышцы. Сооб­щается, что введение животным нитрита нат­рия по 100 мг/кг массы тела в день в течение всей жизни й в трех последующих поколениях обусловливало небольшую задержку роста (10-20%) и сокращение средней продолжи­тельности жизни (с 740 до 640 дней).

Обобщив все экспериментальные данные, Объединенный комитет экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам пришел к выводу, что подпороговая доза нитритов ниже 100 мг/кг массы тела в день. На этом основании с уче­том коэффициента запаса 100 была принята величина допустимого суточного,-потреблетяя, равная 0,4 мг/кг массы тела (за исключением детей грудного возраста), которая впоследст­вии была снижена до 0,2 мг/кг массы тела нитрита натрия, или 0,15 мг/кг в расчете на нитрит-ион. Предельно допустимая концентра­ция нитритов в питьевой воде составляет 1 мг/л, или 0,034-0,05 мг/кг массы тела.

Некоторые исследователи подчеркивают, что при хроническом воздействии нитритов у крыс снижается содержание в органах ретино­ла, аскорбиновой кислоты, токоферолов, тиа­мина и пиридоксина. О возможности отдален­ных эффектов при хронической нитритной ин­токсикации у исследователей нет единого мне­ния, так как исследовалось действие преиму­щественно больших доз. Так, у крыс, получав­ших воду с 1000 мг/л и более нитритов, на­блюдали эмбриотоксическое действие и нару­шение репродуктивной функции. Нитриты оказывали мутагкенное действие на бактерии (Е. coli, S. typhimurium), дрожжи, аспергил-лы. В экспериментах на млекопитающих этот эффект не изучался.

Также дискутируется и вопрос об онкоген-ном действии нитритов. Имеется точка зрения, что нитриты могут вызывать развитие опухо­лей; другие же авторы свидетельствуют, что в экспериментах на животных, получавших вы­сокие дозы нитрита, не было выявлено онко-генного действия этого соединения. Имеется и третья точка зрения: нитриты, уменьшая со­держание витаминов в органах, снижают ус­тойчивость организма к действию онкогенных факторов.

НИТРАТЫ не являются метгемоглобинооб-разователями и сами по себе не обладают вы­раженной токсичностью. Они быстро выделя­ются из организма с мочой, стимулируя диу­рез. По данным ФАО/ВОЗ, ЛД50 нитратов для крыс при пероральном введении составля­ет 3236 мг/кг массы тела, хотя по данным других исследователей она выше или ниже этой величины. Вариабельность данных объяс­няется как различиями в условиях экспери­ментов, так и составом микрофлоры кишечни­ка. Тем не менее, нитраты следует .относить к малотоксичным соединениям. Имеются также сообщения, что чувствительность крыс-самок в 1,5 раза выше, чем у самцов. Организм чело­века в 10-30 раз чувствительнее к нитратам, чем организм лабораторных животных. При случайном приеме внутрь 1-4 г нитратов отме­чались острые отравления, доза 8 г может ока­заться смертельной, а доза 13-14 г, или при­мерно 233 мг/кг массы тела, обычно смер­тельна. При гибели, животных от острой ин­токсикации нитратами наибольшие дистрофи­ческие изменения обнаруживаются в печени. При определенных условиях, зависящих боль-щей частью от микрофлоры, в пищевых про­дуктах или желудочно-кишечном тракте (осо­бенно при диспепсиях у детей) часть нитратов может восстанавливаться до более токсичных нитритов, что служит главной причиной ост­рой интоксикации — нитратно-нитритной мет-гемоглобинемии. Нитрозирующие свойства хо­рошо выражены у 50% штаммов кишечной па­лочки, выделяемых из желудочно-кишечного тракта человека. Низкая кислотность желудоч­ного сока у детей раннего грудного возраста или у взрослых, страдающих гипоацидным га­стритом, может способствовать накоплению нитратредуцирующей микрофлоры. У груд­ных детей с неспецифической диареей рИ же­лудочного сока равняется 5,6 при нормальных показателях 2,7.

При пероральном введении (по специфи­ческому показателю — метгемоглобинообразо-ванию) человек примерно в 2,5 раза более чувствителен к нитратам, чем лабораторные модельные животные. Данные различных ис­следователей о токсичности нитратов неодноз­начны. Кумулятивные свойства нитратов вы­ражены гораздо слабее, чем нитритов. В этой связи представляют интерес данные, получен­ные при выяснении возможности хронической интоксикации.

Так, например, при двухлетнем наблюде­нии за крысами, получавшими нитрат натрия в количестве 1% от общего объема корма, или 500 мг/кг массы тела в расчете на нитрат-ион, не было выявлено признаков интоксикации. У животных, получавших нитратов в количестве 2500 мг/кг массы тела, наблюдалось отстава­ние в росте. Считая дозу 500 мг/кг массы те­ла подпороговой и коэффициент запаса 100, эксперты ФАО/ВОЗ приняли допустимую су­точную дозу для нитратов 5 мг/кг массы тела в расчете на нитрат-ион.

Отечественными учеными также проведены углубленные исследования длительного по­ступления нитратов в организм эксперимен­тальных животных. Результаты этих исследо­ваний показали, что пороговая доза нитратов в хроническом эксперименте при поступлении с пищей близка к 10 мг/кг массы тела. При этой дозе наблюдалось небольшое повышение уровня метгемоглобина в крови и фазовые из­менения в активности некоторых ферментов. В аналогичных опытах, но при поступлении нит­ратов с питьевой водой их пороговая доза бы­ла ниже — от 2,8 до 5 мг/кг массы тела по данным разных авторов. В хронических экспе­риментах отмечались сдвиги условно-рефлек­торной деятельности, изменения электроэнце-фало- и электрокардиограмм, а также ультрас­труктуры гепатоцитов. Исследованиями была доказана возможность хронической нитратно-нитритной интоксикации, были выявлены ор­ганы-мишени, а также обнаружена большая биологическая активность нитратов воды в сравнении с нитратами пищи.

Была изучена также возможность отдален­ных эффектов при длительном воздействии нитратов на организм. Исследования эмбрио-токсического действия нитратов показали, что в дозе 140 мг/кг массы тела крысы наиболее чувствительны к аммиачной селитре с 6 по 15 день беременности, а к натриевой селитре в дозе 85 мг/кг массы тела — в течение всего срока беременности. Оба изученных препарата нитратов вызывают аномалии развития пло­дов: гематомы, нарушение развития костной системы. Было выявлено эмбриотоксическое действие нитратов и нитритов не только на крысах, но и на других модельных животных при затравке их в течение всего срока бере­менности. Был сделан вывод, что эмбрионы более чувствительны к этим токсикантам, чем вынашивающие их самки. С помощью радио­биохимических исследований установлено, что мишенью действия больших доз нитратов яв­ляются ядра гепатоцитов (печеночных клеток) и нуклеиновый обмен.

В литературе, начиная с 1945 года, начали появляться сообщения о детской нитратно-нит-ритной метгемоглобинемии, связанной с упот­реблением воды, содержащей большие количе­ства нитратов. Клиническая картина характе­ризовалась симптомами гипоксии разной сте­пени тяжести: одышкой, тахикардией, циано­зом, в тяжелых случаях — потерей сознания, судорогами, смертью. Метгемоглобинемия со­провождается парезом гладкой мускулатуры и снижением артериального давления. У боль­шинства заболевших детей отмечалась диспеп­сия, которая и спровоцировала восстановление нитратов в нитриты за счет измененной микро­флоры желудочно-кишечного тракта. Случаи чисто алиментарных острых интоксикаций нитратами описываются в литературе значи­тельно реже. Они были обусловлены, главным образом, употреблением растительных продук­тов, загрязненных нитратами в результате не­правильного применения минеральных азотсо­держащих удобрений, или употреблением кол­басных изделий, содержащих нитраты и нит­риты в качестве пищевых добавок в значитель­ных количествах. Описаны также случаи ост­рых отравлений нитратами, связанные с оши­бочным употреблением нитратов вместо пова­ренной соли.

Коэффициент биологической активности нитритов

В суточном рационе могут присутствовать как нитраты, так и нитриты. Их биологичес­кое действие может взаимно усиливаться. В связи с тем что нитраты и нитриты по своим токсикодинамическим свойствам сходны, то имеются все основания для определения коэф­фициента биологической активности (КБ А) нитритов сопоставлением изоэффективных ве­личин нитратов и нитритов пищи и питьевой воды. Так, для пищи КБА нитритов составляет:

а для воды:

КБА =

= 45

ДСП нитратов - 5 мг/кг массы тела ДСП нитритов - 0,15 мг/кг массы тела

ПДК нитратов - 45 мг/л

КБА =

ПДК нитритов - 1 мг/г

-=33

где ДСП — допустимое суточное потребле­ние, ПДК — предельно допустимая концент­рация.

Большинство исследователей принимают коэффициент биологической активности нит­ритов, равным 40.