Список литературы

1. Внутриутробные инфекции: диагностика, лечение, профилактика А.Л.Заплатников, Н.А.Коровина, М.Ю.Корнева, А.В.Чебуркин // Лечащий врач. – 2005. – №8. – С. 54-62.

2. Лобзин Ю.В. Лечение инфекционных больных - СПб.: ФОЛИАНТ, 2005. – 358 с.

3. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. Под ред.Л.С.Страчунского, Ю.Б.Белоусова, С.Н.Козлова / Смоленск: МАКМАХ. – 2007. – 464 с.

4. Ключарева А.А., Астапов А.А., Петрович И.В., Голобородько Н.В. Клинический протокол лечения детей с ВИЧ/СПИДом (инструкция по применению).- Минск: Белсэнс, 2005.- 77 с.

5. Клинические протоколы по лечению и помощи при ВИЧ/СПИДе для Европейского региона ВОЗ. Европейское региональное бюро ВОЗ, 2006. Доступно на:

http://www.euro.who.int/aids/treatment/20060801_1?language=Russian

3.2.15.: Лабораторная диагностика вирусных инфекций (Н.В. Голобородько)

Учебные вопросы:

1. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

2. Факторы, влияющие на результаты лабораторных анализов.

3. Достоинства и недостатки различных методов.

1. Методы лабораторной диагностики инфекций делят на прямые (определение антигенов или нуклеиновых кислот возбудителя) и непрямые (определение антител к возбудителю).

Основные методы, используемые для лабораторной диагностики вирусных инфекций, – это иммуноферментный анализ (ИФА), реакция иммунофлюоресценции (РИФ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Материалом для исследования являются биологические жидкости организма – чаще кровь, реже ликвор, слюна или буккальный соскоб, моча, слизь из зева или носа.

При ИФА определяют находящиеся в биологической жидкости суммарные антитела и/или антигены вируса путем связывания их со специфическими антигеном/антителом вируса, сорбированными на твердой фазе и меченными ферментом, с последующим расщеплением хромогена и регистрацией результата. Выявляются как суммарные антитела, так и антитела различных классов (IgM, IgG, IgA). Возможно установление титра антител к возбудителю.

Разновидность ИФА с определением антител к отдельным белкам вируса – иммуноблотинг (ИБ), служит подтверждающим (конфирматорным) тестом для скринингового обследования в ИФА.

При проведении РИФ определяют антигены возбудителя путем связывания их со специфическим антителом, меченным флюоресцентным агентом с последующей детекцией свечения под микроскопом.

Быстрые тесты (экспресс тесты) позволяют выявлять антитела и/или антигены вируса быстро (за 10-30 минут) и без использования специальной лабораторной техники. Они могут быть основаны на разных методах, например, латекс-агглютинации.

ПЦР подразумевает определение нуклеиновых кислот (РНК или ДНК) вируса в биологических жидкостях. Возможна полуколичественная оценка содержания возбудителя в материале и определение его генетических характеристик (генотипа, резистентности к химиопрепаратам).

2. На результат лабораторного анализа влияют многие факторы, связанные как непосредственно с качеством лабораторной диагностики (диагностическая чувствительность и специфичность метода и используемых тест-систем), так и с правильным выбором метода лабораторной диагностики (исходя из представлений о биологии возбудителя и течения инфекции) и с правильными забором, хранением и транспортировкой материала в лабораторию.

Ошибки лабораторной диагностики

Ошибки	Суть ошибки	Причины ошибки
«Врачебные»	Неверно выбранная диагностическая стратегия обследования больного или неправильная интерпретация результатов диагностики	Неверные представления о биологии исследуемого инфекционного агента или о возможности метода диагностики
«Лабораторные»	Получение ложноположительного или ложноотрицательного результата	Нарушение правил забора, хранения и транспортировки проб, или ошибки при исследовании непосредственно в лаборатории

Чувствительность – вероятность получения положительного результата теста у больных пациентов (истинно положительного результата). Рассчитывается как отношение количества людей с истинно положительной реакцией на этот тест при наличии у них какого-либо заболевания к общему числу больных этим заболеванием людей (имеющих и истинно положительные, и ложноотрицательные ответы).

Специфичность – вероятность получения отрицательного результата теста у здоровых пациентов (истинно отрицательного результата). Рассчитывается как отношение количества здоровых людей, у которых имеет место отрицательная реакция на тест к общему числу здоровых людей (имеющих и истинно отрицательные, и ложно положительные ответы).

Положительная предсказующая ценность – вероятность заболевания в процентах при положительном результате теста.

Отрицательная предсказующая ценность – вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста.

Интегральная оценка эффективности диагностики (диагностической чувствительности и специфичности) проводится по ROC-кривой (с вычислением AU ROC и 95% доверительных интервалов к ней).

Особое значение имеет осуществление правильного забора, хранения и транспортировки материала. Наиболее требовательным является культуральный метод – необходима быстрая доставка материала в лабораторию и обязательное сохранение жизнеспособности возбудителя. Для постановки ИФА, ПЦР возможно хранение замороженной плазмы крови. В фиксированном препарате можно проводить микроскопию, в т.ч. флюоресцентную (РИФ).

Ошибки на этапе забора, хранения и транспортировки материала

наименование ошибки	причина ошибки	следствие ошибки	способы предотвращения
загрязнение пробы на стадии забора материала	использование при заборе пробы инструментария, пробирок, перчаток и других материалов, загрязненных посторонней НК	ложноположительный результат	использование одноразового инструментария и материалов; повышение образовательного уровня медперсонала
загрязнение пробы примесями, ингибирующими ПЦР	проба содержит примеси ингибиторов ПЦР (гемоглобин, гепарин и другие)	ложноотрицательный результат	использование одноразового инструментария и материалов; соблюдение правил забора материала
забор материала выполнен неадекватно	несоблюдение правил забора материала (например, вместо соскоба клеток собрана поверхностная слизь)	ложноотрицательный результат	соблюдение правил забора материала (например, использование специальных щеточек-зондов)
разрушение НК при транспортировке и хранении пробы	несоблюдение правил транспортировки и хранения проб	ложноотрицательный результат	соблюдение правил транспортировки и хранения проб

3. Достоинства и недостатки различных методов. Каждый из используемых методов лабораторной диагностики обладает определенными достоинствами и недостатками, и занимает свою нишу в диагностическом процессе. Зачастую для диагностики требуется комбинированное использование нескольких лабораторных методов.

	ИФА	РИФ	ПЦР
Что определяет метод	антитела или антигены (непрямой)	антигены (прямой)	нуклеиновую кислоту (прямой)
Сложность проведения метода	сложный	сложный	сложный
Быстрота получения результата	относительно быстро	относительно быстро	относительно быстро
Чувствительность	высокая	удовлетворительная	очень высокая
Специфичность	удовлетворительная	низкая	очень высокая
Субъективность интерпретации	объективная	очень субъективная	объективная

Список литературы

1. Камышников ВС. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. – М.: МЕДпересс-информ, 2004. – 920 с.

2. Антитела. Методы. В 2-х томах. Т.1 / Под ред. Д.Кетти.– М.: Мир, 1990.– С. 82.

3. Макреди Б.Дж., Чимера Д.А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. Молекулярная клиническая диагностика. Методы.– М.: Мир, 1999.– С.496-506.

4. The ELISA guidebook (Methods in molecular biology; Vol. 149)/ Edited by J.R.Crowther.– Totowa: Humana Press, 2001.– 421 p.

5. PCR protocols (Methods in molecular biology; Vol. 788).– 2nd edition / Edited by J.M.Bartlett, D.Stirling.– Humana Press, 2002.– 556 p.

511