Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

глюкозно-гліцеринового бульйону. Матеріал щільної консистенції емульгують в ізотонічному розчині хлориду натрію і сіють на гліцериновий чи кров’яний агар з телуритом калію або поліміксином (1-5 мкг/мл). Якщо досліджуваний матеріал дуже забруднений сторонньою мікрофлорою, краще спочатку ввести його білим мишам або гвінейським свинкам і після їх загибелі з печінки і селезінки зробити мазки-відбиткитапосіви. Засіянісередовищаінкубуютьпри37 °Спротягом7 діб, щоденно контролюючи наявність росту шляхом бактеріоскопії.

У рідких середовищах через добу настає помутніння і утворюється складчаста плівка. На триптозному або гліцериновому агарі при дослідженні в косому освітленні колонії24-годинного віку маютьголубувато-зелений колір. У мазках із бульйоннихіагаровихкультурлістеріївиглядаютьяккороткі, товстуватікокобактерії, які не мають ні спор, ні капсул, розташовуються поодинці або невеликими групками. Серовари виділених штамів визначають за допомогою реакції аглютинації з антилістеріозними сироватками, в першу чергу 1-го та 4-го сероварів.

Позитивнимвважаютьрезультат, якщоаглютинаціявідбуласяврозведеннінеменше 1/4 титру.

Ідентифікацію виділених культур здійснюють за морфологічними, тінкторіальними, культуральними, біохімічними і антигенними властивостями. Лістерії слаборухливі, каталазопозитивні, ферментують до кислоти глюкозу, мальтозу, саліцин, не розкладають маніт і гліцерин. Свіжі культури дають позитивну кон’юнктивальнупробуугвінейськихсвинок. Через2 годинипіслявнесеннякраплібульйонної культури лістерій у кон’юнктивальний мішок розвивається гнійне запалення кон’юнктиви.

Серологічне дослідження. Починаючи з другого тижня захворювання використовуютьреакцію аглютинації (титр 1:320-1:5000). При низькому титрі антитіл цюреакціюслідповторити. Більшдостовірноюіспецифічноюєреакціянепрямої гемаглютинації (титр 1:80 і вище). Вона дає позитивні результати у 85-90 % хво- рихналістеріозпісля10-13-го дня захворювання. Їїзастосовуютьідлявиявлення хронічноголістеріозу. Реакція зв’язування комплементустає позитивноюубільш віддалені строки, їїдіагностичний титр1:10 івище. Здіагностичною метоювикористовують реакцію імунофлуоресценції і рідко – реакцію преципітації.

Біологічна проба. Досліджуваний матеріал, особливо при забрудненні його супутньою мікрофлорою, вводять підшкірно білим мишам. Через три тижні при позитивному результаті у тварин виникають паралічі задніх кінцівок іпорушення координації рухів. Із печінки та селезінки тварин, що загинули, роблять мазкивідбитки та посіви на живильні середовища.

Алергічну пробу із стандартним корпускулярним антигеном, або антигеном, отриманимшляхомкислотногогідролізукультурилістерій, ставлятьна6-9-йдень захворювання. Його вводять внутрішньошкірно в об’ємі 0,1 мл. Результат врахо- вуютьчерез24-48 год. Пробувважаютьпозитивною, якщовиникаєгіпереміяшкіри та інфільтрат діаметром 1-2 см.

Туберкульоз

Туберкульоз – первинно-хронічна інфекційна хвороба людей і тварин, яку викликають патогенні мікобактерії. Залежно від локалізації уражень виділяють туберкульозлегень, шкіри, лімфатичнихвузлів, мозковихоболонок, кістокісуглобів, органів сечостатевої системи і черевної порожнини. Для сучасного періоду характерне збільшення захворюваності, тяжкий перебіг, підвищення смертності і поява значної кількості штамів, резистентних до багатьох протитуберкульозних препаратів.

В Україні туберкульоз у людини найчастіше викликають Mycobaсterium tuberculosis іM. bovis. Дужерідкоцезахворювання спричиняєM. avium. Вкраїнах Африки, Америки та інших континентів подібні до туберкульозу захворювання викликають M. africanum, M. asiaticum, M. kаnsasii, M. fortuitum, M. ulcerans та ін.

Ці хвороби називають мікобактеріозами. Ще один представник із роду мікобактерій – M. lepraе – є збудником прокази. Всього нараховують понад 40 видів мікобактерій, 24 з них є патогенними і потенційно патогенними.

Лабораторна діагностика туберкульозу і мікобактеріозів включає проведення мікроскопічних, бактеріологічних, біологічних, серологічних досліджень і постановки алергічних проб. Основним методом є виділення чистої культури збудника, йогоідентифікаціїтавизначеннячутливостідопротимікробнихпрепаратів.

Взяття матеріалу для дослідження. Патологічним матеріалом служать харкотиння, слиз із задньої стінки глотки, плевральний ексудат, гній, спинномозковарідина, промивніводибронхівішлунка, сеча, випорожнення, пунктати, рідше кров та ін. Хворий збирає харкотиння в баночку або кишенькову плювальницю. Кращірезультатиотримуютьпридослідженніхаркотиння, зібраногопротягом1224 год. Інші матеріали збирають у стерильні банки або пробірки. На них наклеюютьетикеткузпрізвищемтаініціаламихворого, групудиспансерногообліку, мету дослідження і направляють до лабораторії. Зібраний клінічний матеріал вважають потенційно патогенним.

Бактеріоскопічнийметод. Безпосередньозхаркотинняабоосаду, якийотримують після центрифугування гомогенізованого матеріалу, виготовляють мазки. Харкотиння переносять учашкуПетрі, розташованунатемномуфоні. Задопомо- гоюпінцетавибираютьслизово-гнійніжмуточки, переносятьїхнасерединупредметного скла, накривають другим предметним склом і розтирають матеріал між скельцями. Так само готують мазки з гною та пунктатів. Спинномозкову рідину відстоюютьпротягом 18-20 год у холодильнику і утворену ніжну сіточку фібрину обережно розправляють на предметному склі. Сечу центрифугують і мазки виготовляють з осаду. Саме ці мазки знебарвлюють не лише кислотою, а й спиртом для диференціації туберкульозних бактерій від M. smegmatis, яка може знаходитися у сечі здорових людей.

Висушенімазкифіксуютьсухимжаром, забарвлюютьзаметодомЦіля-Нільсе- на або аурамін-родаміном чи іншим флуорохромом. У препаратах, зафарбованих за Цілем-Нільсеном, збудник туберкульозу має вигляд тонких суцільних паличок

рубіново-червоного кольору, що розташовані поодинці або групками переважно поза клітинами (див. вкл., рис. 2).

Аурамін-родаміном мазки фарбують протягом 15 хв із підігріванням, потім промивають водою, на 30 с занурюють у солянокислий спирт і знову ретельно промивають водою. Якщо при мікроскопії фон мазка має сильну флуоресценцію, потрібнодещопогаситиїї0,25 % воднимрозчиномметиленовогосинього, промити водою, висушитиідосліджуватипідлюмінесцентниммікроскопом. Туберкульоз- ніпаличкисвітятьсязолотавимсвітломнатемно-зеленомуфоні. Якфлуорохроми використовують також аурамін, акридиновий оранжевий та ін. Для виявлення L-форм мікобактерій застосовують переважно фазово-контрастну мікроскопію.

Позитивну відповідь дають при виявленні туберкульозних паличок у мазку післяпереглядунеменше100 полівзору, обов’язково вказуючикількістьбактерій у кожному полі зору. Негативний результат мікроскопії не дає права виключити діагноз туберкульозу.

Суттєвим недоліком бактеріоскопічного методу є невисока чутливість: мікобактерії можна виявити в мазку лише при наявності 50-100 тис. мікробних тіл в 1 мл патологічного матеріалу. Окрім того, за цим методом неможливо відрізнити збудника туберкульозу від інших мікобактерій та визначити його чутливість до хіміопрепаратів. Для підвищення частоти знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі (особливо в харкотинні) застосовують методи збагачення – гомогенізації та флотації.

Метод гомогенізації. Добовупорціюхаркотиннявносятьуфлакон, добавляютьрівнийоб’єм1 % розчинуNaOH, щільнозакриваютьгумовоюпробкоюіструшують у шюттель-апараті 10-15 хв до повного розрідження. Гомогенізовану рідину центрифугують, декантат зливають у розчин хлораміну, осад нейтралізують 2-3 краплями 10 % розчину соляної або 30 % оцтової кислоти. З осаду готують мазки, забарвлюють за Цілем-Нільсеном і мікроскопують.

Методфлотації. Порціюхаркотиння(10-15 мл) гомогенізують, яквищеописано. Колбочку або флакон із розрідженим матеріалом ставлять на водяну баню при55 °Сна30 хв, потімдобавляють0,5-1 млксилолу(бензолу, бензину, толуолу), струшують10 хвівідстоюютьпівгодини. Ксилолразомзадсорбованимимікобактеріями спливає на поверхню і утворює вершкоподібний шар. Доливають дистильовануводу, щобцейшарпіднявсяугорлечкоколбочкичифлакона. Стерильною пастерівськоюпіпеткоючастинуксилоловогошарупереносятьнапредметнескло, яке нагрівають на скляній пластинці, що лежить на водяній бані при температурі 60 °С. Висушений мазок покривають новою порцією з вершкоподібного матеріалу, знову висушують і так повторюють до тих пір, поки весь флотаційний шар перенесуть на мазок. Препарат промивають ефіром, висушують, фіксують сухим жаром, фарбують за Цілем-Нільсеном і мікроскопують. Методи гомогенізації та флотації на 10 % підвищують знаходження мікобактерій туберкульозу в досліджуваному матеріалі. При цьому їх вдається виявити, якщо в 1 мл харкотиння знаходиться більше тисячі мікробних тіл.

Промивні води бронхів і шлунка також можна досліджувати за допомогою гомогенізації або флотації.

Бактеріологічний метод діагностики значно ефективніший, ніж бактеріо-

скопічний. Віндаєзмогувиявитив1 млдосліджуваногоматеріалу20-100 ібільше мікобактерій. Йоговикористовуютьнелишедляпостановкидіагнозухвороби, ай дляконтролюефективностіхіміотерапії, визначеннявірулентностіістійкостімікобактерій до антибіотиків та інших протитуберкульозних препаратів, виявлення змінених варіантів, особливо L-форм.

Майже всі досліджувані матеріали від хворих на туберкульоз (окрім крові, спинномозкової рідини) містять супутню мікрофлору. Тому виділити чисту культурумікобактерійбезпопередньоїїхобробкинеможливо. Длязнищеннясторонніх мікроорганізмів харкотиння, гній, промивні води та інші матеріали обробляють 20 хв при кімнатній температурі подвійним об’ємом 6 % розчину сірчаної кислоти або 10 % розчином тринатрійфосфату при 37 °С протягом 18-20 год. Потім оброблений матеріал центрифугують, рідку частину зливають, а осад нейтралізують, добавляючи 1-2 краплі 3 % розчину NaOH, або трикратно відмивають від кислоти ізотонічним розчином хлориду натрію.

Після нейтралізації матеріал засівають у 3-6 пробірок із щільним середови- щемЛевенштейна-Йенсена(картоплянийкрохмальзгліцерином, солями, яєчною суспензією і малахітовим зеленим) та Фінна-2, яке має такий же склад, як і попереднє, але в ньому аспарагін замінено на глютамінат натрію. Ці середовища рекомендовані ВООЗ як стандартні в усіх країнах світу для первинного вирощування мікобактерійтуберкульозутавизначенняїхстійкостідохіміопрепаратів. Дляінших потреб можна також використовувати гліцериновий бульйон, середовище Петраньяні, Павловського, Сотона.

Спинномозковурідину, ексудат, кров, пунктатвносятьпіпеткоюнаживильне середовище без попередньої їх обробки. Всі ватні пробки зрізають на рівні вінця пробірки, проштовхують всередину на 1-1,5 см і заливають розтопленим парафіном для попередження висихання середовища.

Засіяні пробірки інкубують у термостаті при 37 °С протягом 3-4 тижнів. Ті пробірки з середовищами, на які матеріали сіяли петлею і втирали в поверхню агару, розміщують вертикально. Якщо посіви робили пастерівською піпеткою, пробірки вміщують у термостаті в похилому положенні на 2-3 доби, потім вертикально. Посіви проглядають кожні 5-7 днів. Всі пробірки з раннім ростом сторонньої мікрофлори вилучають. У випадках раннього росту характерних колоній (до 5-го дня) роблять висновок про наявність швидкоростущих мікобактерій, тобто негативну відповідь щодо туберкульозу.

Ріст туберкульозних бактерій частіше всього появляється через 3 тижні, але бувають випадки й через 2-3 місяці. На щільних середовищах виростають грубі, шорсткі, сухі, безпігментні колонії, що мають зморщену поверхню, потовщений центр і тонкі, нерівні краї. За зовнішнім виглядом вони нагадують дольки цвітної капусти або бородавки.

Це типові R-форми колоній, властиві патогенним штамам. S-форма колоній жовтого або оранжевого кольору, як правило, характерна для інших видів мікобактерій. Але під впливом антибактеріальних препаратів M. tuberculosis також

можеутворюватим’які, вологі, пігментованіS-формиколоній. Необхідновідмічати швидкість і рясність росту.

Значно рідше досліджуваний матеріал сіють на гліцериновий бульйон, рідкі середовища з плазмою крові, бичачою сироваткою або синтетичне середовище Сотона. На них мікобактерії туберкульозу ростуть дещо швидше, мають вигляд ніжноїплівки, яказчасомпотовщується, грубішає, стаєкрихкоюівипадаєвосад. Із рідких середовищ роблять висів у пробірки із щільним середовищем, що збільшує число позитивних результатів, але дослідження триває довше.

Щоб підвищити частоту висівання збудника туберкульозу, досліджуваний матеріал обробляють детергентами, які мають бактерицидну дію на іншу мікрофлору (лауросепт, лаурисульфат натрію, родолан, теапол, цетавлон тощо). При цьому покращується гомогенізація матеріалу, виключається центрифугування, швидше виростають колонії.

Прискореніметодикультивування. Щобзначношвидшеотриматирістмікобактерійтуберкульозу, запропонованіметодимікрокультурПрайсаіШкольнікової. Метод Прайса полягає в тому, що харкотиння, гній, осад сечі, промивні води та іншийматеріал наносять товстим шаром на декілька вузьких предметних скелець (звичайніскельцярозрізаютьнавпілподовжині). Висушенімазкиберутьстерильним пінцетом і занурюють на 15-20 хв у пробірки з 2 % розчином сірчаної кислоти, а потім тричі промивають стерильним розчином хлориду натрію для видаленнякислоти. Післяцьогопрепаратвміщуютьупробіркиабофлаконизрідкимсередовищем Сотона або цитратною кров’ю. Мазок повинен повністю покриватись живильним середовищем. Для пригнічення сторонньої мікрофлори, яка може інколи залишатись після обробки мазків кислотою, в середовище добавляють 10 ОД/млпеніциліну. Посівивирощуютьутермостатіпри37-38 °С. Через3-4 доби скельця з мазками виймають, фіксують сухим жаром, забарвлюють за ЦілемНільсеном або родаміном і мікроскопують. Вірулентні мікрокультури в препаратах утворюють джгути або “коси”, що формуються під впливом корд-фактора. Максимальний ріст мікрокультур відмічається на 7-10 день (див. вкл., рис. 21).

ГлибиннекультивуваннямікобактерійугемолізованійкровізаметодомШкольнікової отримують шляхом посіву матеріалу, обробленого, як звичайно, сірчаною кислотою і промитого 0,85 % розчином хлориду натрію. Через 6-8 днів вирощуваннякультуруцентрифугують, зосадувиготовляютьмазки, забарвлюютьзаметодом Ціля-Нільсена або флуорохромом і мікроскопують. У препаратах виявляють типові мікрокультури з характерним розташуванням у вигляді кіс і джгутів.

ЩобвиявитиL-формимікобактерійтуберкульозу, посівматеріалупіслявідповідної обробки кислотою проводять у спеціальне напіврідке середовище, розлите впробіркиувиглядістовпчика. Вирощуютьпри37 °Спротягом1-2 міс. РістL-форм нагадує хмаринку з дуже дрібними включеннями, що подібні до манної крупи. Виготовлені мазки досліджують під фазово-контрастним мікроскопом, за допомогою якого найкраще виявляють різноманітні за морфологією L-форми. Їх можна виявити і шляхом послідовних пасажів на гвінейських свинках або за допомогоюімунофлуоресцентногометодузвикористанням сироваток, щомістятьмічені антитіла проти антигенів L-форм.

Для ідентифікації виділених культур збудників туберкульозу і диференціації їх від інших видів мікобактерій використовують багато ознак. Основними з них є вірулентність, швидкістьросту, формаколоній, утворенняпігменту, каталази, уреази, нікотинамідази, нітратредуктази (табл. 58).

Таблиця 58

Властивості мікобактерій, що використовуються для їх ідентифікації

Найважливіша ознака M. tuberсulosis – ніациновий тест– здатність синтезуватизначнукількістьнікотиновоїкислоти(ніацину). Каталазнаактивністьвідносно слабкаівтрачаєтьсяпри68 °С. Дляшвидкоїдиференціаціїзбудниківтуберкульозу людини рекомендують посів на середовище Левенштейна-Йенсена з 500 мкг/мл і 1000 мкг/мл саліцилового натрію. Мікобактерії туберкульозу за таких умов на цьому середовищі не ростуть.

Питання про вірулентність мікобактерій вирішується на основі біологічних пробівиявленнікорд-фактора. ОстаннійвизначаютьметодоммікрокультурПрайса, атакож на основі міцного зв’язування таких барвників, як нейтральний червоний абонільськийголубий. ПринанесенінамазокрозчинуNaOH туберкульозніпалички зберігають колір барвника, в той час як невірулентні мікобактерії змінюють відповідне забарвлення.

Для надійної ідентифікації видів мікобактерій у сучасних умовах розроблені прогресивні, швидкі й дуже точні методи визначення у таких досліджуваних матеріалах, як харкотиння, плевральна рідина, ліквор, гній, сироватка крові, вміст шлунка, тканини тощо. Ці об’єкти, знезаражені нагріванням, зберігаються необ- меженийчасівбудь-якиймоментможутьбути досліджені. Середнихнайбільшої увагизаслуговуємолекулярно-генетичнийметодполімеразноїланцюговоїреакції. Він грунтується на виявленні в біологічному матеріалі ДНК мікобактерій. Навіть якщо в матеріалі знаходиться всього 5-10 мікробних клітин, за допомогою оліго- нуклеотидів-праймерів запускають синтез специфічних фрагментів ДНК у циклотермостаті, якіпотімможнаідентифікуватиметодомгельелектрофорезу. Результати досліджень отримують через 3-4 години.

Специфічні антигени в тих же матеріалах можна також швидко виявити і за допомогою імуноферментного аналізу, якщо мати відповідні антитіла, адсорбовані на твердій фазі у полістиролових планшетах.

Визначення стійкості мікобактерій до хіміопрепаратів. Лікарську стійкість збудників туберкульозу визначають способом серійних розведень перед

початком лікування, через 3 місяці і надалі при продовженні виділення туберкульозних паличок черезкожні 6 місяців. Це роблять шляхом вирощування культур на середовищах із різною концентрацією туберкулостатиків.

Є два способи визначення резистентності мікобактерій: прямий і непрямий. При прямому способі безпосередньо сіють відповідно оброблений матеріал на середовищазрізнимиконцентраціямиантибіотиківчиіншиххіміопрепаратів. Він ефективніший, але ним можна користуватися лише тоді, коли в матеріалі виявляють не менше 5 мікобактерій в кожному полі зору. При непрямому способі на середовищезпротитуберкульознимипрепаратамисіютьпопередньовиділенікультури мікобактерій. В обох випадках обов’язковий контроль – посів на таке саме середовище без туберкулостатиків.

У сучасних умовах найбільш поширені такі методи визначення лікарської стійкості мікобактерій:

1) культивування на щільному середовищі Левенштейна-Йенсена;

2) мікрокультивування на скельцях за Прайсом;

3) глибинні посіви в напівсинтетичні середовища.

У пробірки, які містять різну концентрацію препаратів, і в одну контрольну (без туберкулостатика) засівають завись виділеної культури (500 млн мікробних тіл в 1 мл). Культуру вважають чутливою, якщо в пробірці з препаратом виросло менше20 колонійприрясному ростівконтролі. Якщовирослобільше20 колоній, культурувважаютьстійкою. Резистентністьданогоштамувиражаютьтієюмаксимальною концентрацією антибактерійного препарату, при якій ще відбувається ріст, наближений до росту в контролі (табл. 59)

Таблиця 59

Шкала оцінки резистентності мікобактерій до лікарських засобів

Біологічний метод діагностики туберкульозу – зараження гвінейських свинок – є найчутливішим. Інфікуюча доза збудника для цих тварин складає всього декілька бактерійних клітин. Досліджуваний матеріал обробляють 2 % розчином сірчаної кислоти протягом 20 хв, включаючи центрифугування. Потім осад тричі відмивають 0,85 % розчином хлориду натрію і емульгують його в 1-2 мл ізотонічного розчину. Емульгований осад вводять підшкірно в пахвинній ділянці двом гвінейським свинкам масою 250-300 г з негативною пробою Манту. При малій кількості матеріалу його вводять у черевну порожнину або паранхіму яєчка. Такий спосіб зараження підвищує чутливість біопроби, особливо в тих випадках,

коли в матеріалі містяться маловірулентні палички туберкульозу, стійкі до ізоніазиду та інших хіміопрепаратів.

Через 2-3 тижні заражених тварин зважують, визначають розміри збільшених лімфатичних вузлів і ставлять пробу Манту, яку повторюють через 6 тижнів. Місцеві патологічні зміни, зменшення маси тіла дають підставу для розтину гвінейських свинок і дослідження їх внутрішніх органів. При негативних резуль- татахтваринумертвляютьчерез3-4 міс, гістологічнодосліджуютьпаренхіматозні органи і роблять посіви на елективні середовища.

Гвінейських свинок використовують і для виявлення L-форм мікобактерій туберкульозу. Втакихвипадкахпотрібнозробитидекількапослідовнихзаражень, оскільки L-форми мають меншу вірулентність і викликають у тварин доброякісний перебіг туберкульозу, якийприреверсіїL-форм можеперейтивгенералізований процес.

Останнім часом все ширше використовують біопробу на білих мишах, заражаючи їх інтрацеребрально. Постановка біологічних проб на лабораторних тваринах – це своєрідний “золотий стандарт” при діагностиці туберкульозу.

Серологічнадіагностика. Для виявленняпротитуберкульознихантитілспочатку були запропоновані реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комплементу. Тепер їх використовують рідко. Натомість стали широко практикувати реакцію непрямої гемаглютинації. Як антиген у ній використовують сенсибілізовані еритроцити барана або людини О-групи. Їх навантажують екстрактом із туберкульозних бактерій або очищеним туберкуліном. До 1 мл осаду еритроцитів додають 20 мл екстракту мікобактерій, витримують при 37 °С протягом 2-ох год і відмивають центрифугуванням для видалення надлишку антигену. Перед постановкою РНГА сироватку хворого виснажують еритроцитарною масою для усунення неспецифічного реагування. Потім сироватку розводять від 1:2 до 1:272. Діагностичним титром вважають розведення 1:8. При туберкульозі РНГА буває позитивною у 70-90 % випадків.

Хорошірезультатидаєтакожімуноферментнийаналіз, імуноблотингіреакція агрегат-гемаглютинаціїдлявизначенняциркулюючихімуннихкомплексів. Щеточнішимєрадіоімуннийметод, алечерезвисокувартістьдіагностикумівівідсутність радіометричної апаратури він рідко використовується в лікувальних закладах.

Для вдосконалення серологічної діагностики туберкульозу важливо налагодитивипускмоноклональнихантитілдорізнихантигенівмікобактерій. Зїхдопомогою можна було б виявляти специфічні епітопи бактерій, а також відповідні їм антитіла. Виявлення таких антитіл буде мати важливе діагностичне значення.

Алергічний метод. Туберкулінова внутрішньошкірна проба Манту є специфічнимдіагностичнимтестом. Йоговикористовуютьдлявизначенняінфікованості населення туберкульозом, масового обстеження на туберкульоз дітей і підлітків, відбору осіб, яким потрібнопроводити ревакцинацію, перевіряти її ефективність, атакожізметоюдіагностикитуберкульозутавизначенняактивностіпроцесу. Для постановки проби використовують туберкулін. У 1890 р. Роберт Кох запропонував перший препарат, так званий старий туберкулін Коха (Alttuberkulin Koch або

АТК). Його виготовляють із суміші культур мікобактерій людського й бичачого типів, вирощенихугліцериновому бульйоніпротягом5-6 тижнів. Культурустерилізують текучою парою 30 хв, випарюють при 70 °С до 1/10 первинного об’єму, фільтрують через бактерійний фільтр і розливають в ампули. Туберкулін Коха містить ряд баластних речовин і важко піддається стандартизації. Починаючи з 1934 р., для постановки алергічних проб Зейберт запропонував високоочищений препарат туберкуліну, який назвали РРD-S (Purified protein derivative – Seibert).

Через5 роківМ.А. ЛінніковавиготовилаочищенийтуберкулінпідназвоюППД-Л. Його дозують у туберкулінових одиницях (ТО). 1 ТО вміщує 0,00006 мг сухого препарату. Випускають ППД-Л у двох формах: сухий очищений туберкулін по 50000 ТОвампулііППД-Лустандартномурозведеннівампулахпо3 мл. У0,1 мл розчину міститься одна доза (2 ТО).

Препарат вводять внутрішньошкірно однограмовим туберкуліновим шприцом в об’ємі 0,1 мл у середній третині передпліччя. Перед ін’єкцією шкіру протирають 70 % етиловим спиртом. Тонку голку зрізом вверх вводять у поверхневий шар шкіри під кутом 15° до її поверхні.

Результати алергічної проби оцінюють через 72 год за такою схемою: негативна проба – повна відсутність папули; сумнівна – папула розміром 2-4 мм або лише гіперемія будь-якого розміру; позитивна – папула діаметром 5 мм і більше; гіперергічна – у дітей і підлітків папула діаметром 17 мм і більше, у дорослих – 21 мм і більше.

Лепра(проказа)

Лепра – первинно-хронічна генералізована інфекційна хвороба людини, яка характеризується специфічними ураженнями шкіри, слизових оболонок, периферичнихнервівівнутрішніхорганів. Збудникзахворювання– Mycobacterium leprae. Окрім того, у щурів лепру викликає M. lepraemurium, морфологічно і тинкторіально дуже подібна до палички прокази людини.

Розрізняють дві основні клінічні форми хвороби: туберкулоїдну і лепроматозну. Останнямаєбільштяжкийпрогресуючийперебіг. Прокаженийвиділяєзбудника при кашлі, чханні і розмові, оскільки він у великій кількості знаходиться у слизовій оболонці носоглотки. Зараження людей відбувається частіше повітрянокраплинним шляхом при тісному контакті з хворими на проказу.

При лабораторній діагностиці лепри використовують переважно бактеріоскопічний метод дослідження, значно рідше біопробу на мишах і броненосцяхармадилах та алергічну пробу з лепроміном.

Матеріалом для дослідження служать зскрібки слизової оболонки носа, скарифікати з уражених ділянок шкіри, особливо з надбрівних дуг, мочок вушних раковин, підборіддя, а також біоптати лепром і ліфматичних вузлів.

Зіскобслизовоїоболонкизобохбоківносовоїперегородкипроводятьметалевоюложечкоюдопоявикраплікрові. Длявзяттяскарифікатушкірувмісціураженнязатискаютьдвомапальцямивскладку,здовжякоїскальпелемроблятьневеликий

розріз глибиною 1-2 мм. Зскріб зі стінок надрізу переносять на предметне скло. ВиготовленімазкизабарвлюютьзаЦілем-НільсеномабозаметодомСеменовича- Марциновського. Припроведеннігістологічнихдослідженьбіоптатівчастинузрізів також фарбують одним із вказаних методів для виявлення мікобактерій.

Умазкахлепрознібактеріїмаютьвиглядрубіново-червонихпрямихаболедь зігнутих паличок з округленими кінцями. При мікроскопії гістологічних зрізів видно їх скупчення всередині клітин, де палички розташовуються паралельно, нагадуючи пачки сигар. Це дає змогу диференціювати їх від мікобактерій туберкульозу, які за своїми морфологічними і тинкторіальними властивостями подібні до збудника лепри (див. вкл., рис. 22).

Припосівахлепрознихматеріалів наелективнідлямікобактерій середовища ріст відсутній. Гвінейські свинки не чутливі до M. lepraе.

Біологічну пробу ставлять на мишах (особливо чутлива японська танцююча миша). Гомогенат досліджуваного матеріалу вводять у подушечку задньої лапки тварин, імунологічнуреактивністьякихпонижуютьвведеннямТ-імунодепресантів. Упозитивнихвипадкахнамісціінокуляціїматеріалучерездекількамісяціввиникає інфільтрат, що містить гранулеми із розташованими всередині клітин мікобактеріями. При зараженні броненосців (армадил) у них розвиваються типові множинні вузли (лепроми) в тканинах і органах, де мікроскопічно виявляють багато лепрозних бактерій.

Алергічну пробу з лепроміном використовують, в основному, для диференціації лепроматозної від туберкулоїдної форм прокази. Алерген готують із простерилізованих в автоклаві гомогенатів уражених тканин, що містять величезну кількість мікобактерій. Лепромін вводять внутрішньошкірно в середній третині передпліччя в об’ємі 0,1 мл.

Через48 годупозитивнихвипадкахрозвиваєтьсяплямагіпереміїабопапула (реакція Фернандеса). Значно пізніше (1-2 міс.) може утворитися горбик, часто з некрозом(реакціяМіцуди). Ухворихналепроматознуформуалергічнапробабуде негативна, а у хворих на туберкулоїдну форму та у здорових людей – позитивна. Отжелепроміновапробадіагностичногозначеннянемає, їївикористовуютьлише для визначення клінічної форми хвороби і прогнозу.

Мікобактеріози

У навколишньому середовищі існує багато атипових потенційно патогенних мікобактерій. Частина з них виділяється від людей і тварин при різноманітних захворюваннях легень, шкіри, лімфатичних вузлів, інших тканин і органів. Вони отримали загальну назву мікобактеріози. Роль умовно-патогенних мікобактерій в інфекційній патології людини зростає з кожним роком. У цю групу захворювань не входять туберкульоз і проказа, хоч деякі з них маютьподібний перебіг. Існуючі методилікуваннятуберкульозуімікобактеріозіврізні, узв’язкузчиммікробіологічна ідентифікація збудників набуває особливого значення.