Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

жають її найбільше розведення, при якому відбулась нейтралізація вірусу (остання пробірка з культурою клітин, де середовище жовтого кольору). Діагностичне значення має наростання титру антитіл у другій сироватці не менше, ніж у 4 рази в порівнянні з першою сироваткою.

Експрес-методилабораторноїдіагностикиентеровіруснихінфекційнезнай- шли широкого застосування із-за особливостей їх патогенезу. Можливе використання реакції непрямої гемаглютинації з еритроцитарним поліовірусним діагностикумом та непрямої реакції імунофлуоресценції. Для постановки останньої використовують імунну діагностичну антивидову сироватку, виснажену гомологічними клітинами крові, амніону, фібробластами. Така сироватка реагує лише з вірусним антигеном, що знаходиться всередині клітин досліджуваного матеріалу.

Останнім часом для експрес-діагностики використовують каріологічний аналіз, основанийнавиявленніхарактернихзмінвструктуріядерклітинклінічного матеріалу, взятого у перші дні захворювання. Мікроскопують мазки з осаду після центрифугування змивів з носоглотки і сечі та мазки-відбитки з органів, які взяті приавтопсії. Їхфіксуютьухолодномуацетоні, забарвлюютьгематоксиліном. Специфічним для ентеровірусних інфекцій є виявлення в препаратах зміщення хроматину до периферії ядра і утворення яскраво-фіолетових тілець, що нагадують півмісяць. Цедаєзмогудатипопереднювідповідьпрорепродукціюентеровірусів у досліджуваному матеріалі.

Диференціацію даних та атенуйованих поліовірусних штамів здійснюють за допомогоюПЛР, ІФА, РНзмоноклональнимиантитілами. ДляполіовірусівІтипу використовується бентонітовий тест (вірулентні поліовіруси мають характеристики Абент–, а авірулентні – Абент+).

У високорозвинених країнах понад 60 % гострих гастроентеритів викликають віруси з родини Reoviridae. Серед них домінують ротавіруси. Рід Rotavirus включає ротавіруси людини і віруси, що викликають діареї у тварин. Останні для людининепатогенні. Ротавіруси людинивикликають, восновному, гастроентерити у дітей до трьох років і людей похилого віку. Збудник передається фекальнооральним способом при побутових контактах. Висока стійкість вірусів у зовнішньому середовищі сприяє розвитку спалахів гастроентеритів особливо в зимовий період(до90 %). Забілковимиантигенамиротавірусиподіляютьна4 сероваріанти.

Матеріалом для лабораторної діагностики служать випорожнення і кров. Пробикалуберутьупершігодиниідніхворобиустерильніпеніциліновіфлакони і направляють до вірусологічної лабораторії в контейнерах із льодом. Готують 1020 % суспензію в розчині Хенкса, центрифугують 30 хв при 3000 об/хв. Центрифугат переносять у стерильний флакон, додають фреон 113 або 1000 ОД/мл пеніциліну і 500 ОД/мл стрептоміцину, вміщують у холодильник на 10-12 год. Кров для серологічних реакцій беруть у перші 2-3 дні хвороби і через 12-14 днів.

Лабораторна діагностика ротавірусних діарей ґрунтується на швидкому виявленні вірусів у випорожненнях за допомогою електронної та імунної електронної мікроскопії, реакції непрямої гемаглютинації з антитільним еритроцитарним ротавірусним діагностикумом. Використовують також імуноферментний аналіз у твердофазному варіанті, реакцію коаглютинації, метод клонованих РНКзондів і полімеразну ланцюгову реакцію.

У перші дні хвороби вміст ротавірусів у копроматеріалах досягає 106-108 в 1 г, тому їх виявлення при прямій електронній мікроскопії можливе без додатковоїконцентрації. Краплюдосліджуваногоматеріалунаносятьнаспеціальніплівки з нітроцелюлози і мікроскопують при збільшенні 50000.

Метод чутливийінадійний, даєзмогушвидковиявитивірус і дослідитийого морфологію. При виявленні 5-6 віріонів практично у кожному полі зору можна достовірно підтвердити діагноз ротавірусного гастроентериту.

Вірусологічнідослідженнязметоювиділенняротавірусівукультурахклітин абоналабораторнихтваринахурутиннихвірусологічнихлабораторіяхнепроводять.

Найбільш широко в діагностиці ротавірусних гастроентеритів використовують імуноферментний аналіз. Принцип його полягає в тому, що лунки полістиролових планшет спочатку сенсибілізують антитілами проти ротавірусів, а потім додають у них освітлену суспензію фекалій, інкубують 1 год в термостаті. Утворений в лунках комплекс антиген-антитіло після трикратного промивання фосфатним буфером виявляють внесенням антиглобулінової сироватки, кон’югованої з ферментом. Після інкубації в термостаті додають хромогенний субстрат до появи забарвленого продукту реакції. Облік результатів проводять за допомогою імуноферментного аналізатора.

Уневеликих лабораторіях досить часто проводять реакцію оберненої непрямої гемаглютинації з використанням антитільного ротавірусного еритроцитарного діагностикуму. Вона проста за методикою постановки, хоч і менш чутлива в порівнянні з реакцією ензиммічених антитіл.

Упрактику лабораторної діагностики ротавірусних інфекцій впроваджують також тест коаглютинації для індикації ротавірусного антигену у випорожненнях

хворих. На предметне скло наносять краплю зависі стафілококів (штам Cowan 1), сенсибілізованих ротавірусною сироваткою, і додають краплю освітленого центрифугуванням копроматеріалу. При наявності ротавірусів через 30-60 с виникає аглютинація навантажених антитілами стафілококів.

Дужечутливимспособомшвидкоїдіагностикиротавіруснихгастроентеритів є метод виявлення вірусоспецифічної РНК за допомогою молекулярної гібридизації. Вінзаснований нагібридизації мічених РНК-зондів, фіксованих нанітроцелюльозних фільтрах. Мічення здійснюють біотином або ферментом, що значно спрощує і здешевлює метод у порівнянні з радіоізотопними мітками.

Аналіз ротавірусної РНК, не зважаючи на його дорожнечу, все ширше впроваджується в практику, особливо після розробкиметоду полімеразної ланцюгової реакції. Остання є найчутливішим і специфічним методом діагностики, який, безумовно, єдіагностичнимтестомновогопокоління, такзваним “золотимстандартом”. Однак постановка цієї реакції все ще вимагає високої кваліфікації дослідника, дорогих реактивів і складної апаратури.

Серологічна діагностика спрямована на виявлення специфічних антитіл у парнихсироватках, взятихздвотижневимінтервалом. Дляцієїметивикористовують різноманітні нейтралізаційні або преципітаційні тести та непряму реакцію імунофлуоресценції. Але останнім часом найширше застосовують імуноферментний аналіз.

Раніше для серодіагностики широко ставили РЗК з використанням в якості антигену заздалегідь відібрані фекалії хворих на гастроентерит або ротавіруси телят. Алезасвоєю чутливістю іспецифічністю вона значно поступається методу імуноферментного аналізу. Для виявлення специфічних антитіл до ротавірусів ставлять також реакцію гальмування непрямої гемаглютинації з парними сироватками.

Гастроентерити у дітей можуть також викликати каліцівіруси, астровіруси і віруси Норволк. Всі вони виділяються з випорожненнями в перші 2-3 дні захворювання, не розмножуються в культурах клітин або слабко репродукуються без цитопатичної дії. Для лабораторної діагностики гастроенетеритів, викликаних данимивірусами, використовують, восновному, методімунноїелектронноїмікроскопії. Іншихметодівдіагностики, доступнихдлявірусологічнихлабораторій, поки що немає.

Герпесвірусні інфекції

ВірусиродиниHerpesviridae поділяютьсянатрипідродини: Alphaherpesvirinae (викликаютьпростийоперізуючийгерпеставітрянувіспу), Betaherpesvirinae (спричиняє цитомегалію), Gammaherpesvirinae (асоціюється з лімфомою Беркітта, назофарінгеальною карциномою). Всього в родині нараховують біля 50 вірусів.

Простий герпес

Захворювання має декілька клінічних форм, але найчастіше вірус персистує в організмі, і хвороба має безсимптомний перебіг. Звичайні клінічні прояви – везикулярна висипка на шкірі і слизових оболонках, рідко виникає менінгоенцефаліт, кератит і генералізована форма у новонароджених. Вірус герпесу 1-го типу проникає в організм ще в ранньому дитинстві й постійно персистує у 70-90 % дорослих людей. Передається контактним шляхом через слину, посуд, побутові речі. Вірус2-готипупередаєтьсястатевимшляхомівикликаєгенітальнийгерпес.

Лабораторна діагностика включає проведення вірусоскопічних, прискорених, вірусологічних і серологічних методів. Залежно від клінічних проявів матеріалом для дослідження служать слина, вміст пухирців, кірочки, ліквор, мазки з виразок на слизовій оболонці рота, статевих органів, рогівки; при автопсії – шматочки головного і спинного мозку та паренхіматозних органів. Взятий матеріал найкраще зберігати в 10 % сироватці при температурі – 70 °С.

Мікроскопія. Зскрібки, мазки, пухирцевий вміст після негайної фіксації в сумішіНикифоровазабарвлюютьзаметодом Романовського-Гімзиідосліджують під імерсійним об’єктивом на наявність гігантських багатоядерних клітин з характерними внутрішньоядерними включеннями (тільця Каудрі).

Дляекспрес-діагностикивикористовуютьелектроннумікроскопію, реакцію імунофлуоресценції, імуноферментний аналіз, генетичну діагностику. Під електронним мікроскопом досліджують вміст пухирців, рідку фракцію кірок після їх гомогенізації в дистильованій воді, змиви з елементів висипу. Виявлення 2-3 віріонів з типовою морфологією цілком достатньо для встановлення діагнозу (рис. 90). Швидкевиявленнягерпетичногоантигенуможливевреакціїімунофлуоресценції. Мазкизпухирцевоїрідини, виразокнарогівціабоосадузлікворуфіксують і обробляють протигерпетичною флуоресцентною сироваткою. Антиген знаходять у цитоплазмі та ядрах уражених клітин за характерним золотаво-зеленим

світінням. Вірусспецифічнийантигенудосліджуваному матеріалі легко виявляють за допомогою імуноферментного аналізу, чутливість і специфічність якого може сягати 95-96 %.

Виділення герпесвірусів. Ізоляцію вірусів про-

водять шляхом інокуляції досліджуваного матеріалу в культури клітин ниркового епітелію кроля, курячого ембріона, амніона людини, HeLa та ін., або зараженням мишей-сисунців, хом’ячків, кроликів, курячих ембріонів.

Репродукція вірусів у культурах клітин настає через 4-7 днів. Вона супроводжується розвитком Рис. 90. Вірус герпесу. цитопатичних змін, утворенням гігантських багатоядерних клітин та синцитію.

У мишей виникають паралічі і смерть, у кроликів через 2-5 днів спостерігаютькератит, ухом’ячківзахворюваннязакінчуєтьсялетально. Нахоріоналантоїсній оболонцікурячихембріонівчерез48 годинз’являютьсяопуклінепрозорібляшки.

Виділені штами вірусів ідентифікують за допомогою стандартних протигерпетичнихсироватокутестахнейтралізаціїнакультурахклітин, лабораторнихтваринах або курячих ембріонах.

Серологічну діагностику проводять шляхом постановки реакції непрямої гемаглютинації, імунофлуоресценції та імуноферментного аналізу обов’язково методом парних сироваток. Діагностичне значення має наростання титру антитіл у4 разиібільше. Серологічнадіагностикапростогогерпесузначноюміроюутруднена із-за широкої циркуляції вірусів серед населення і наявністю спільних антигенів у 1-го і 2-го сероваріантів герпетичних вірусів. При первинному захворюванні на простий герпес певне діагностичне значення має постановка РЗК для виявленнякомплементзв’язуючихантитіл. Особливоважливезначенняприцьому набуває визначення Іg M.

Вітряна віспа – оперізуючий герпес

ЗбудниквітряноївіспийоперізуючогогерпесуналежитьдородуVaricellovirus і є двома варіантами одного і того самого вірусу. За морфологічними, біологічними властивостями вони ідентичні до вірусів простого герпесу, але не репродукуються в організмі лабораторних тварин. Той самий вірус у дітей до 10 років викликаєвітрянувіспу– сильнозаразне, алелегкезахворювання. Удорослих(ідуже рідкоудітей) вінвикликаєоперізуючийгерпес(герпесзостер). Розпізнаванняцих захворювань, як правило, проводять на основі характерних клінічних симптомів та епідеміологічних даних. Значно рідше використовують вірусологічні або серологічні дослідження.

Лабораторна діагностика. Найбільш цінним матеріалом для виділення вірусів є вміст пухирців (везикул). Забирають також зскрібки з папул, кірочки,

виділення з носоглотки, кров для постановки серологічних реакцій. Лабораторні дослідження проводять так само, як і при простому герпесі, але необхідно враховувати, щовіруси вітряноївіспиіоперізуючого герпесу невражаютьклітинкурячого ембріону, нервових клітин мишей, рогівки кролів. У культурах клітин вони розвиваютьсязначноповільніше(3-5 днів) упорівняннізвірусомпростого герпе-

су (18-24 год).

Експрес-методибазуютьсянавиявленівірусспецифічнихантигенівумазках і відбитках за допомогою реакції непрямої імунофлуоресценції. Використовують антивидову сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ФІТЦ. Специфічне світіння проявляється в цитоплазмі і ядрах уражених клітин. Герпесвірусні антигени можна виявити і за допомогою імунодифузії в гелі з відповідними преципітуючими сироватками. При наявності діагностичних тест-систем і відповідної апаратури можна використати полімеразну ланцюгову реакцію.

Виділення вірусів проводять на первинних і перещеплюваних культурах клітин щитоподібної залози людини, фібробластів, ниркового епітелію, амніона людини тощо. Цитопатична дія носить острівковий характер, розвивається повільноісупроводжуєтьсяутвореннямбагатоядернихклітинзхарактернимивключеннями.

Ідентифікацію виділених вірусів проводять в реакціях нейтралізації, зв’язування комплементу і непрямої імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика проводиться на основі постановки реакції зв’язування комплементу, нейтралізації, непрямої імунофлуоресценції з парними сироваткамихворих. Необхідноюумовоюдляпостановкидіагнозує4-кратнезбільшен- ня титру антитіл. Останнім часом для серологічної діагностики частіше використовують імуноферментний аналіз.

Цитомегалія

Цитомегаловірус подібний до інших видів герпесвірусів, але відрізняється більш тривалою репродукцією всередині клітини. Він викликає захворювання, щохарактеризуєтьсяураженнямслиннихзалозтаіншихорганівзутвореннямвїх тканинах гігантських клітин з крупними внутрішньоядерними включеннями.

Діагноз цитомегалії встановлюють на основі проведення цитологічних, вірусологічних і серологічних досліджень. Матеріалом для дослідження служать слина, осад сечі, ліквор, пунктати лімфатичних вузлів, печінки, а також лейкоцити крові. Найхарактерніша ознака цитомегалії – поява гігантських клітин з ядерними включеннями розміром від 8 до 20 мкм.

Виділення вірусів проводять шляхом інокуляції досліджуваного матеріалу в первинну культуру фібробластів шкіри та легеневих клітин ембріона людини. Цитопатична дія виявляється через 2-3 тижні особливо у вторинних і третинних субкультурах у вигляді появи гігантських клітин, що мають внутрішньоядерні включення. При генералізованій формі хвороби цитомегаловірус проникає в лейкоцитикрові, томудляйоговиділеннякращебратилейкоцитарнікультуриклітин.

Ідентифікацію виділених вірусів, а також їхантигенні варіанти визначають у реакції нейтралізації з відповідними антисироватками. Титр вірусу встановлюють за допомогою бляшкоутворення або підрахунків фокусів уражених клітин методом імунофлуоресценції.

Серологічна діагностика. Для визначення титру сироваткових антитіл на початку захворюванняівперіодреконвалесценціївикористовуютьреакціїзв’язування комплементу і нейтралізації цитопатичної дії вірусу або феномену бляшкоутворення. Методфлуоресцуючихантитілзастосовуютьякдлявизначення4-крат- ного наростання титру антитіл, так і для виявлення концентрації lg M. Для серологічної діагностики цитомегаловірусної інфекції більшість лабораторій починає широко застосовувати імуноферментний аналіз.

Аденовірусніінфекції

Родина Adenoviridae поділяється на два роди: Mastadenovirus – аденовіруси ссавців, у тому числі понад 40 сероваріантів, що викликають захворювання у людей, і Aviadenovirus – 14 сероваріантів, що спричиняють захворювання у птахів. Окремі серотипи (12, 18, 31) мають онкогенні властивості для деяких видів гризунів (сирійські хом’ячки). По відношенню до людини онкогенні властивості аденовірусів не проявляються.

Аденовірусні інфекції виникають переважно у дітей від 6 місяців до 5 років, особливо у холодні пори року. Для них характерний розвиток респіраторного, кон’юнктивальногоікишечногосиндромів. Найчастішевиникаютьтонзиліти, фарингіти, бронхіти, атипові пневмонії, риніти, катаральні і плівчасті кон’юнктивіти. Основнімеханізмизараження– повітряно-краплинний, контактно-побутовий, рідше – фекально-оральний.

Лабораторна діагностика. Більшість клінічних симптомів при аденовірусних інфекціях подібні до інших респіраторних захворювань як вірусної, так і бактеріальної етіології. У зв’язку з цим методи лабораторної діагностики мають винятково велике значення.

Залежно від клінічних проявів захворювання матеріалом для дослідження служать мазки і змиви з носоглотки, харкотиння, зіскрібки з кон’юнктиви, кров, ліквор, випорожнення. Матеріал потрібно взяти у перший тиждень хвороби, пересилати і зберігати у замороженому стані. Досліджують і секційний матеріал – шматочки трахеї, бронхів, легень, кишечника, лімфовузлів.

Експрес-діагностикуздійснюютьзадопомогоюреакційімунофлуоресценції таензимміченихантитілзметоюіндикаціїгруповихантигеніваденовірусівуепітеліальних клітинах носоглотки та кон’юнктиви. При цьому виявляють характерні дрібнозернисті включення зелено-жовтого кольору в центральній частині ядер.

Кишковіаденовіруси, щовикликаютьгастроентерити, виявляютьувипорожненнях хворих за допомогою прямої та імунної електронної мікроскопії (рис. 91), імуноферментного аналізу, ДНК-зондів і полімеразної ланцюгової реакції.

Коронавіруси є дуже частими збудниками респіраторних захворювань у дорослих: профузного риніту, ринофарингіту, часто навіть без підвищення температури. У дітей основними симптомами є профузний нежить, кашель, гарячка, головний біль. Часто хвороба ускладнюється пневмонією. Клінічно коронавірусну інфекцію важко відрізнити від інших захворювань респіраторного тракту, тому лабораторні дослідження мають вирішальне значення.

Лабораторнадіагностика. Матеріаломдлядослідженняслужитьслизізноса і глотки, зібраний сухими ватними тампонами, які занурюють в ізотонічний розчин хлориду натрію з антибіотиками. Секційний матеріал (шматочки трахеї, бронхів, легень) збирають у фосфатний буфер з гліцерином. У разі виникнення гастроентериту досліджують випорожнення. Для серологічних реакцій використовують парні сироватки крові.

Експрес-методи діагностики проводять за допомогою реакції імунофлуоресценції. Уцитоплазміепітеліальнихклітинізосаду змивівзносоглотки, обробленихлюмінесцентнимиантисироватками, виявляютьспецифічнівключення. При можливості використовують пряму та імунну електронну мікроскопію, за допомогою яких виявляють поодинокі віріони або їх скупчення з типовою для коронавірусів морфологією (віруси зовні покриті виступами грушоподібної форми, що нагадують корону сонця під час його затемнення). У препаратах з випорожнень коронавіруси знаходять за допомогою електронної мікроскопії та полімеразної ланцюгової реакції (рис. 92).

Виділення вірусів з діагностичною метою проводять дуже рідко, оскільки коронавіруси людини практично не репродукуються в курячих ембріонах і перещеплюваних культурах клітин. Найбільш чутливою системою для їх виділення є органна культура клітин трахеї ембріона людини. У пробірки з культурою вносять 0,1-0,2 мл досліджуваногоматеріалу, обробленогоантибіотиками. Рідко ставлять біологічну пробу на мишах-сисун- цях. При інтрацеребральному зараженні у тварин виникає енцефаліт, від якого вони гинуть. У до-

рослихмишейкоронавірусиспричиняютьбезсимп- Рис. 92. Коронавіруси. томну інфекцію.

Ідентифікують віруси шляхом визначення в інфікованих клітинах коронавірусногоантигенуметодомімунофлуоресценції, імуноферментногоаналізуабоРЗК. Можна виявити типові за морфологією віріони і при електронній мікроскопії.

Серологічна діагностика коронавірусних інфекцій до сьогодні залишається основним методом їх розпізнавання. Для цього використовують визначення приросту антитіл у парних сироватках за допомогою реакцій гальмування гемаглютинації, зв’язування комплементу та імуноферментного аналізу.

Сказ

ВіруссказуналежитьдородуLyssavirus родиниRhabdoviridae, маєхарактерну кулеподібну форму з одним плоским і другим заокругленим кінцем (рис. 92). Існують два варіанти вірусу – вуличний (дикий), що циркулює в природі серед тварин, і атенуйований – Virus fixe, отриманий Л. Пастером шляхом багатократних пасажів через мозок кроликів.

На сказ найчастіше хворіють собаки, вовки, лисиці, шакали, коти, рідше корови, скунси, койоти, кажани. Зараженнялюдинивідбуваєтьсячерезукусихворих тварин і навіть при ослиненні ними подряпин шкіри чи слизових оболонок. Захворювання у людини завжди закінчуєтьсялетально, основніметодидіагно-

стики сказу є посмертними, хоч розроб- Рис. 92. Вірус сказу. лені й деякі прижиттєві тести.

Лабораторнадіагностикабазуєтьсянавикористаннівірусоскопічного, біологічного і серологічного методів. Матеріалом для дослідження служить мозок тварин і загиблих людей, слина, тканина слинних залоз, які направляють до лабораторії в стерильному посуді з гліцерином і обкладені льодом.

Метод флуоресцуючих антитіл – найбільш швидкий і точний метод лабораторноїдіагностикисказу. Длявиявленнявірусногоантигенувмазках-відбитках мозку, слинних залоз і рогівки ока (прижиттєвий тест) використовують пряму і непряму реакцію імунофлуоресценції. Мазки фіксують у холодному ацетоні протягом 8-10 год при температурі 4 °С і обробляють у вологій камері 30 хв антирабічним імуноглобуліном, міченим ФІТЦ, промивають фосфатним буфером, висушують і досліджують в люмінесцентному мікроскопі. Антигени вірусу спостерігають у вигляді зелених гранул різної форми і величини.

Виявлення тілець Бабеша-Негрі у мазках-відбитках, гістологічних зрізах мозку і тканини слинних залоз є також швидким методом діагностики сказу. З мозку загиблої людини чи тварини стерильними ножицями нарізають у поперечному напрямку шматочки товщиною 3-4 мм з довгастого мозку, амонового рогу і мозочка. Предметне скло притискають до поверхні зрізу щоб отримати відбиток тканини. В препаратах, забарвлених за Муромцевим або Селлером, тільця мають різну величину (4-10 мм) округлої або овальної форми пурпурно-червоні, а цитоплазма і ядра нервових клітин мають синій колір. Гістологічні зрізи забарвлюють заРомановським-Гімзою, МанномабоТуревичем. Воднійклітиніможебутиодне або декілька тілець. Вони оточені чітко окресленою оболонкою і мають внутрішнюструктуруувиглядібазофільноїзернистості, частішерозташовуютьсябіляядра

(рис. 93).

Метод виявлення включень Бабеша-Негрі є досить специфічним для сказу, хоч він і менш чутливий, ніж метод флуоресцуючих антитіл. У тканині мозку собак тільця знаходять у 90-95 % випадків, а в людей, померлих від сказу – в 70 %.