Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Отже, відсутність тілець Бабеша-Негрі не виключає діагнозу сказу. У таких випадкахнеобхідновикористатийіншіметоди дослідження.

Біопроба на мишах. Біологічний методзастосовуютьдлявиділеннявірусу сказу із тканин мозку, слинних залоз трупів та слини хворих людей і тварин (прижиттєвий тест). Найбільш придат- нимидлязараженняємиші-сисунці. Для постановки біопроби використовують

15-20 тварин. Зараженняпроводятьпіднаркозомшляхомінтрацеребральноговведення 0,03 мл суспензії досліджуваного матеріалу. Можна поставити біологічну пробу і на сірійських хом’ячках, заражуючи їх матеріалом внутрішньом’язово.

Принаявностівдосліджуваномуматеріалівірусусказуумишейвиникаєтремор м’язів, паралічі. Убільшостівипадківтваринигинутьпротягомп’ятиднів. Наявність рабічних вірусів у заражених і загиблих мишей необхідно підтвердити за допомогою прямої реакції імунофлуоресценції або виявлення тілець Бабеша-Негрі.

Ідентифікацію виявленого вірусу сказу проводять також за допомогою реакції нейтралізації на білих мишах.

Серологічнідослідженняпроводятьдлявизначенняпоствакцинальногоімунітету. Антитілапротивірусусказувиявляютьвреакціяхнейтралізації, зв’язування комплементу, імунофлуоресценції. Найчутливішими є імуносорбентні реакції (радіоімунний та імуноферментний аналізи).

Гарячки Марбург і Ебола

ЗбудникицихзахворюваньвходятьдородуFilovirus родиниFiloviridae. Віруси маютьниткоподібнуабоциліндричнуформу, часомнагадуютьрабдовіруси. Внутрішньоклітинні включення при репродукції цих вірусів дещо подібні до включень при сказі, тому раніше їх відносили до рабдовірусів.

Обидвіхворобиендемічні длядеяких африканських країн(ЮАР, Кенія, Зимбабве), але останнім часом почали з’являтись і на території інших континентів. Початок захворювань гострий з гарячкою, висипом, ураженням печінки, нирковою недостатністю, профузним поносом. Летальність досягає 50-90 %.

Лабораторна діагностика гарячок Марбург і Ебола полягає в проведенні вірусологічнихдосліджень удобреоснащенихлабораторіях здодержанням суворого режиму. Віруси виявляють у крові, сечі, геморагічному ексудаті зараженням досліджуванимматеріаломгвінейськихсвинокабокультурклітинмавп. Крімтого, проводять і пряму електронну мікроскопію патологічного матеріалу для виявлення вірусів. Розроблені і впроваджуються в практику імуноферментний метод і реакція імунофлуоресценції. В більш пізніших стадіях захворювання і в період реконвалесценціїзастосовуютьРЗКдлявиявленнякомплементзв’язуючихантитіл.

Арбовірусніінфекції

Арбовіруси– особливагрупавірусів, щовключаєдекількародин: Togaviridae,

Flaviviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Rhabdoviridae i Reoviridae. Вони здатні розмножуватись в організмі членистоногих (комарів, кліщів, москітів тощо) і передаватись хребетним через укус.

Всіарбовірусимаютьскладнуструктурувіріона: містятьРНК, капсид, зовнішнюсуперкапсиднуліпідомісткуоболонку, атомучутливідодіїорганічнихрозчинників. Вірусинестійкі всередовищіішвидковтрачають своїпатогенні властивостіприпідвищенійтемпературі, діїультрафіолетовоговипромінювання. Вонимають виражені гемаглютинуючі властивості, особливо відносно гусячих еритроцитів.

Арбовіруси здатні зумовлювати в організмі патологічні процеси, що проявляються у вигляді гарячкових станів з болями в м’язах і суглобах або важких уражень мозкових оболонок і мозку – менінгоенцефалітів, чи у вигляді геморагічних гарячок з системним ураженням судин.

Природним резервуаром більшості арбовірусів є дрібні гризуни, дикі тварини і птахи, кліщі і комарі. Людина є випадковим господарем вірусу і лише на короткий проміжок часу потрапляє в ланцюг природної циркуляції вірусу.

Серед арбовірусних інфекцій в Україні найчастіше зустрічаються і найтяжче перебігають кліщовий енцефаліт і гарячка Західного Нілу. Досить часто зустрічаються геморагічна гарячка з нирковим синдромом і Кримська-Конго геморагічна гарячка.

Весняно-літнійкліщовийенцефаліт

Вірус російського весняно-літнього енцефаліту має типову будову, властиву родині Flaviviridae. Віріони сферичної форми, діаметром 40-50 нм, містять однониткову нефрагментовану РНК, яка заключена в капсиді ікосаедричного типу симетрії. Капсид оточений суперкапсидною ліпідною оболонкою, на поверхні якої розміщені гемаглютиніни. До цієї родини входять також віруси японського енцефаліту, омської геморагічної гарячки, гарячок Денге і Західного Нілу та жовтої гарячки.

Природним резервуаром і переносником вірусу російського весняно-літньо- гоенцефалітуєіксодовікліщі, вякихзбудникпередаєтьсятрансоваріально. Інфіковані кліщі, паразитуючи на гризунах, диких і свійських тваринах, заражують їх і включають у природний ланцюг циркуляції вірусу.

Людина заражується, потрапляючи у природне вогнище знаходження збудника. Зараженнявідбуваєтьсяпісляукусівінфікованихкліщівабовживаннясирого козячого чи коров’ячого молока.

Інкубаційний період триває від 2-х до 14 діб, іноді – до місяця. Вірус розповсюджується гематогенним і лімфогенним шляхами, проникаючи у центральну нервову систему, уражує рухливі нейрони передніх рогів шийного відділу спинного мозку, мозочок і мієлінову оболонку головного мозку.

Лабораторнадіагностика. Враховуючизначнунебезпекуприроботізвірусним матеріалом, вірусологічні дослідження проводять виключно у спеціалізованих вірусологічних лабораторіях.

Матеріаломдлявірусологічногодослідженнявпершідніхворобислужитькров, спинномозковарідина. Відтрупівберутьтканинумозкуівнутрішніхорганів. Вірус такожможнавиділитизкліщів, мозку, паренхіматознихорганівінфікованихтварин.

Длявиявленнявірусупроводятьвнутрішньомозковезараженнявіруснимматеріалом новонароджених мишенят, які гинуть через 6-7 днів, або заражають курячіембріони. Крімтого, длявиділеннявірусу використовуютьінфікуваннякультур клітин Vero, KB, HЕp-2, клітин нирок ембріона свині. Про наявність вірусу в клітинах свідчить цитопатичний ефект.

Вірус російського весняно-літнього енцефаліту ідентифікують у РН, латексаглютинації, РЗК, РГГА, дифузійної преципітації в гелі.

Останнімчасомнабуливирішальногозначенняметодигібридизаціїіполімеразна ланцюгова реакція, які дозволяють безпосередньо виявити вірус у кліщів і матеріалі від хворого.

Серологічна діагностика базується на дослідженні парних сироваток, взятих з інтервалом 2-3 тижні, за допомогою РН, РЗК, РНГА. Необхідно відзначити, що високою специфічністю відзначається РН на білих мишах або культурах клітин. Рівень антитіл у сироватці хворого корелює зі ступенем пригнічення цитопатичногоефектуабобляшкоутворення. Діагностичнимтитромвважається1:10 івище, що можна зареєструвати вже з 7-10 доби хвороби.

Значну діагностичну цінність має імуноферментний метод, який порівняно простий у виконанні, але дозволяє швидко одержати надійні результати.

Японськийенцефаліт

Резервуаром вірусу японського енцефаліту в природі є дикі птахи, велика рогата худоба, коні, свині, гризуни. Переносник– комарі роду Culex. Захворювання розповсюджене на сході азіатського континенту: в Японії, Китаї, Кореї, Індії, Приморському краї Росії тощо.

Людиназаражуєтьсячерезукусінфікованогокомара. Проникнувшиворганізм людини, вірусрозмножуєтьсявнейронахцентральноїнервовоїсистеми, атакожв клітинахпаренхіматознихорганів. Прицьомудоситьчастоуражуютьсяядрагіпоталамуса, стовбурової ділянки головного мозку і шийний відділ спинного мозку.

Лабораторнадіагностика. При вірусологічному дослідженні збудник можна виділяти з крові впродовж першого тижня хвороби, протягом двох тижнів із спинномозкової рідини, а також із мозку загиблих.

Інфікованим матеріалом заражують новонароджених мишенят, курячі ембріони і культури клітин: первинні – курячі, гусячі фібробласти, клітини ембріона свині; перещеплювані – ВНК-21, Vero. При зараженні клітин ВНК-21 спостерігаєтьсяхарактернийцитопатичнийефект– появана3-4 добубагатоядернихклітин, що нагадують симпласт.

Ідентифікацію вірусу проводять в РН або РГГА. Вірусоспецифічний антиген можна теж виявити за допомогою імуноферментного методу і РЗНГА. Вірусну нуклеїнову кислоту ідентифікують в реакції гібридизації і полімеразній ланцюговій реакції.

Серологічна діагностика здійснюється за допомогою РН, РЗК, РГГА, РНГА, імуноферментногометоду. Прицьомупотрібновраховуватизростаннятитрупротивірусних антитіл у парних сироватках.

Гарячка Західного Нілу

Вірус гарячки Західного Нілу за своїми розмірами дещо менший від попередніх флавівірусів, його діаметр – 20-30 нм. Структура вірусу типова для даної родини. Збудник чутливий до підвищеної температури і при 56 °С гине протягом 30 хв. Кип’ятіння інактивує його протягом 2-3 хв. Органічні розчинники і детергенти, руйнуючи ліпіди суперкапсидної оболонки, знешкоджують вірус.

Резервуаромвірусу Західного Нілу в природі є дрібні гризуни і птахи, в тому числі водоплаваючі. Інфікована людина теж може бути джерелом інфекції. Переносниками вірусу є комарі і кліщі.

Людина заражується через укус комара. Вірус розповсюджується в організмі гематогенним шляхом і зумовлює ураження лімфоїдної тканини, рідше оболонок мозку і самого мозку. Вірус має виражений тропізм до ендотелію судин і нейронів. Післянетривалогоінкубаційногоперіоду(2-8 днів) захворюваннярозпочинається лихоманкою, появою геморагічної висипки, жовтяницею, болем у суглобах. Можливий розвиток менінгіту і менінгоенцефаліту.

Лабораторнадіагностика. Основнимматеріаломдлявірусологічноїдіагностики служить кров і спинномозкова рідина, а від осіб, які загинули, лімфоїдна і мозковатканини. ВіруснимматеріаломзаражуютькультуриклітинМК-21 івнутрішньомозково лабораторних мишей. Ідентифікацію вірусу Західного Нілу проводять задопомогоюпрямоїімунофлуоресценції, атакожполімеразноїланцюговоїреакції.

Для серологічної діагностики використовують парні сироватки хворого з наступним дослідженням титру противірусних антитіл в РЗК, РГГА, РН та ІФА.

Жовтагарячка

Вірус жовтоїгарячки– типовийфлавівірус, нестійкийузовнішньомусередовищі, швидко втрачає свою активність при підвищеній температурі (60 °С), кислому середовищі, при дії ультрафіолетового проміння, детергентів і органічних розчинників, а також хлормістких дезінфектантів.

Для культивування вірусу використовують мишей, курячі ембріони і різноманітні культури клітин: Детройт-6, BHK-21, HeLa, KB, фібробласти курячих ембріонів.

Жовтагарячка– особливонебезпечна, карантиннахвороба, якаможерозповсюджуватися серед людей у вигляді епідемій. Ареалом вірусу є тропічні райони

Вірусневідзначаєтьсярезистентністювзовнішньомусередовищі, легкоруйнується під дією хімічних і фізичних факторів, чутливий до органічних розчинниківефіруідезоксихолатунатрію. Прикип’ятіннігинемиттєво. Утой жечасвін здатний тривалий час зберігати свою активність у замороженому стані.

Основним джерелом і переносником вірусу в природі є різноманітні пасовищні кліщі. Існування вірусу у вогнищі забезпечують їжаки і зайці, а також свійські тварини – корови і вівці.

Післяукусукліщаабоприконтактізінфікованоютвариноювірусчерезмікроушкодження шкіри і слизових оболонок, а також повітряно-краплинним шляхом проникає в кров і розмножується в ендотеліоцитах.

Інкубаційний період хвороби в середньому становить 3-7 діб. Основні симптоми, пов’язані з гарячковим станомігеморагічним синдромом. Під час лихоманкивірусзнаходитьсявкровівзначнійконцентрації, томуіснуєвеликаймовірність зараження осіб, які надають допомогу хворому при кровотечі.

Лабораторна діагностика. У зв’язку з високою небезпекою зараження всі вірусологічні дослідження повинні проводитись тільки в спеціальних, оснащених необхідним устаткуванням, лабораторіях.

Основним матеріалом, з якого можна виділити вірус, є кров, яку у хворого забирають на висоті гарячковогостану з дотриманням всіхправилсанітарної безпеки. Відосіб, якізагинули, берутьголовнийабоспинниймозок, внутрішніоргани.

Для швидкого нагромадження вірусу матеріал вводять у мозок мишенятамсисунцям і через 4-5 днів суспензією мозку цих тварин заражують інших мишенят, щурів або культуру клітин ембріона свиней.

Ідентифікують вірус за допомогою РЗК, РОНГА, ІФА, РІА. Використовуючи метод імунофлуоресценції, можна виявити вірус у мазках-відбитках печінки мишенят, які загинули, а також у культурах клітин.

Серологічна діагностика проводиться за допомогою РЗК, РНГА, РГГА, РН, ІФА. Комплементзв’язуючі антитіла можна виявити в сироватці крові вже на 6-10 добу, максимальний титр яких спостерігається через 60 днів і зберігається до 6 місяців.

Геморагічна гарячка з нирковим синдромом

Вірус відноситься до родини Bunyaviridae, роду Hantavirus. Його будова характернадляпредставниківцієїродини. Вірусчутливийдодезоксихолатунатрію, ефіру, хлороформу, ультрафіолетового проміння, інактивується при рН 5,0 і температурі, вищій 37 °С. При низьких температурах може зберігатись тривалий час.

Вірус добре культивується на клітинах Vero E6 без видимого цитопатичного ефекту, іноді використовують для культивування вірусу 6-7-денні курячі ембріони, заражуючи їх в алантоїсну порожнину або жовтковий мішок.

Геморагічна гарячка з нирковим синдромом – природновогнищева хвороба, осередки якої розповсюджені в лісистій місцевості. Резервуаром збудника в навколишньому середовищі є мишоподібні гризуни, в яких вірус виділяється з се-

чею і фекаліями. Людина заражується від хворих тварин респіраторним, контактним і аліментарним шляхами найчастіше через предмети, продукти, забруднені виділеннями гризунів.

Проникнувши в організм, вірус розмножується в ендотелії судин, клітинах селезінки, нирок, легень. Головними клінічними симптомами є гарячка, інтоксикація, геморагічний і нирковий синдроми. У патогенезі хвороби значне місце займають імунопатологічні процеси в результаті утворення імунних комплексів.

Лабораторна діагностика. Матеріалом для дослідження є кров і сеча, від осіб, що загинули – шматочки тканин нирок, легень. Вірус виділяють шляхом зараженнякультуриклітинVero E6. Вірусиуцихклітинахнагромаджуютьсяузначних титрах без видимого цитопатичного ефекту. Їх виявляють за допомогою непрямої імунофлуоресценції і методу інтерференції.

Суть методу інтерференції полягає в наступному. Після зараження вірусним матеріалом, культуриклітинчерез3-4 добиповторнозаражуютьвірусомНьюкасла. Через48 годинвизначаютьтитргемаглютинінівукультуральнійрідинііступінь розвитку цитопатичного ефекту, порівнюючи ці показники з контролем (культури клітин, заражені тільки вірусом хвороби Ньюкасла). Вірус геморагічної гарячки, взаємодіючи з вірусом хвороби Ньюкасла, в значній мірі пригнічує синтез гемаглютинінів у досліді і сповільнює розвиток цитопатичного ефекту.

Ідентифікаціювірусу можназдійснитизадопомогоюРОНГА, ІФА, РІА, РІФ. Якприскоренийметодіндикаціївіруснихантигенів, використовуютьімуннуелектронну мікроскопію і молекулярно-генетичний метод – ПЛР.

Для серологічної діагностики успішно застосовують метод непрямої імунофлуоресценції. Зрізилегеневоїтканинимишей, інфікованих вірусом геморагічної гарячки з нирковим синдромом, обробляють різними розведеннями парних сироватокхворого. Післявідмиваннянадлишкусироваткинапрепаратнаносятьфлуоресцуючі антитіла до глобуліну людини. Присутність антитіл у досліджуваній сироватці встановлюють за наявністю специфічної флуоресценції в інфікованих клітинах. Крім того, для виявлення приросту титру антитіл у парних сироватках застосовують РГНГА, ІФА і РІА.

Краснуха

Збудником хвороби є вірус краснухи, який належить до роду Rubivirus родини Togaviridae і не є арбовірусом, тому що його існування не пов’язане з членистоногими.

Віріон має сферичну форму, діаметром 60-70 нм. У центрі віріону розташованийікосаедричнийкапсид, усерединіякогоміститьсяоднонитчаста+ РНК, зовні капсид вкритий суперкапсидною оболонкою з двома типами глікопротеїнів Е1 і Е2, які утворюють шипики. Встановлено наявність двох антигенів – внутрішнього і зовнішнього. Внутрішній (нуклеокапсидний) виявляється в РЗК, зовнішній (суперкапсидний) – в РГГА, реакції затримки гемолізу та РН. Вірус має гемаглютинуючу, гемолітичну та слабовиражену нейрамінідазну активність.

Вірус краснухи порівняно нестійкий до дії хімічних і фізичних факторів, не зберігаєтьсятривалийчасузовнішньомусередовищі. Швидкоруйнуєтьсяпіддією органічних розчинників, формаліну, ультрафіолетового проміння.

Вірус культивується у великій кількості різноманітних культур клітин, однак у більшості з них не викликає цитопатичного ефекту. Цитопатичну дію вірусу можна спостерігати на перещеплюваних культурах ВНК-21, Vero, RK-21, а також в первинних культурах клітин, одержаних із тканин ембріона людини.

Джереломінфекціїєхворілюдитаособизбезсимптомнимиформамиінфекції. Основний механізм зараження – повітряно-краплинний, хоча відомі випадки передачі збудника через інфіковані предмети.

Проникнувши в організм, вірус уражує епітелій слизовоїоболонкирота, згодом епітелій верхніх дихальних шляхів, потрапляє в лімфатичні вузли, а звідти в кров. Вірусемія закінчується через 2-3 тижні після зараження при появі в крові специфічних антитіл і висипу на тілі хворого.

Характерним симптомом хвороби є поява висипу, який спочатку виникає на шиї та обличчі, в той же день розповсюджується на тулуб, розгинальні поверхні рук, сідниці, стегна. Його поява супроводжується підвищенням температури до 38 °С. Через 2-3 дні висип блідне й зникає.

Вірус краснухи має ембріотоксичну активність, викликаючи вади розвитку плода(глухоту, катаракту, серцевіаномалії). Томуособливонебезпечнимєінфікування вірусом краснухи вагітних у перші 4 тижні вагітності, проте небезпека розвитку таких явищ існує до 16-17 тижня вагітності.

Лабораторна діагностика. Для виділення вірусу в перші дні хвороби використовуютьзмиви із слизової носоглотки, кров і сечу, якими заражують перещеплювані культури клітин ВНК-21, Vero, RK-21, первинні клітини ембріона людини або кроля. При репродукції вірусу в цих клітинах спостерігається характерний цитопатичний ефект. На поверхні моношару появляються клітини з посиленим світлозаломленням, згодом виникають окремі вогнища змінених вакуолізованих клітин, які відпадають від поверхні скла. При зараженні інших культур клітин цитопатична дія вірусу не спостерігається. У такому випадку для індикації вірусу використовують феномен інтерференції, суть якого полягає в тому, що уражені вірусом краснухи клітини не заражуються іншими вірусами, наприклад, ЕСНО11, вірусом везикулярного стоматиту. Останні віруси завжди спричиняють цитопатичний ефект в інфікованих ними клітинах, за винятком того випадку, коли в цихклітинахзнаходитьсявірускраснухи. Ідентифікаціювірусупроводятьзвикористанням специфічної сироватки в РГГА, РН, РІФ. Набуває широкого використання ПЛР, яка дозволяє безпосередньо виявити нуклеїнову кислоту вірусу.

До прискорених методів виявлення вірусу краснухи відносяться латекс-аг- лютинація, ІФА, РІФ.

У практичних лабораторіях значно частіше використовують серологічні методи. Вивлення приросту титру антитіл у парних сироватках проводять у РГГА, РЗК, РН, ІФА. Віруснейтралізуючіантитілатаантигемаглютинінивизначаютьвже на 4-7 день після появи висипу, комплементзв’язуючі – пізніше (через 2-3 тижні).

ми печінки людини, мають жовтяничний або безжовтяничний перебіг і загальнотоксичні прояви. Збудниками їх є віруси гепатитів A, B, C, D, E, F, G та інші.

Гепатит А

Збудник епідемічного гепатиту А належать до родини Picornaviridae, роду Hepatovirus, типу 72. Він має сферичну форму, кубічний тип симетрії, діаметр зрілого віріона – 27-32 нм. У центрі віріона міститься однониткова лінійна плюснитка РНК. Поверхня капсиду створюється 32 окремими капсомерами, поверхневих виступів немає (рис. 94). Віруси мають чотири структурних білки – VР1, VР2, VР3, VP4.

Від інших ентеровірусів вірус гепатиту А відрізняється більш високою резистентністю до дії факторів зовнішнього середовища. Зокрема, він частково зберігає свою інфекційність у культурі клітин при 60 °С протягом 4-12 год, тижнями при кімнатній температурі, протягом кількох місяців при 4 °С. Ультрафіолетове випромінювання знищує його за 1 хв, при автоклавуванні (121 °С) – за 20 хв, дія сухого жару (180 °С) – за одну годину. Вірус чутливий до формаліну, хлораміну, хлорного вапна.

Зметоюлабораторноїдіагностикивикористовуютьвірусологічні, серологічні та експрес-методи.

Вірусологічна діагностика грунтується на виявленні самого збудника, або його антигенів після нагромадження його в спеціальних тест-системах. Матеріаломдлятакогодослідженняєфекаліїхворого, якіможнавикористати, починаючи з другого тижня інкубаційного періоду, і протягом 14-21 дня жовтяничного періоду. Їх піддають попередній підготовці, яка полягає в одержанні гомогенізованого уфосфатному буфері10-40 % фекальногоекстракту. Підчасцьогопроцесувіруси концентрують, використовуючи фільтрування матеріалу через сефарозу, а також центрифугування за градієнтом щільності хлориду цезію.

Одержаним матеріалом заражують культури клітин нирок ембріону макакрезус (FrhK-4, FrhK-6), первинної гепатоцелюлярної карциноми, лімфобластів людинитаінші. Слідвідзначити, щовірусамгепатитуАпритаманнийдовгийцикл репродукції, який триває 4-10 тижнів без по-

мітної цитопатичної дії.

У заражених клітинах віруси або їх антигени можна виявити за допомогою імунної електронної мікроскопії (ІЕМ), РІФ, РІА, ІФА.

Імуннаелектроннамікроскопія передба-

чаєзмішуваннясуспензіївірусівзвідповідною антисироваткою, відділення імунних комплексівзнаступнимдослідженнямостанніхпід електронним мікроскопом. В умовах негатив-

Рис. 94. Вірус гепатиту А ного контрастування можна виявити агрегати (за Хіллеманом). вірусів при концентрації менше 106 у 1 г