Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

Уражуються спочатку слизова оболонка рото- і носоглотки, шкіра, особливо навколоанальної зони. Пізніше процес переходить у лімфатичні вузли та внутрішні органи (легені, печінка, шлунок, селезінка). Досліджують гній, харкотиння, грануляції, виділення нориць, біоптати тканин і органів.

Для лабораторної діагностики використовують ті самі методи, що й при північноамериканському бластомікозі. В уражених тканинах гриби мають сферичну або овальну форму дріжджоподібних клітин діаметром 30-60 мкм, які мають двокамерну оболонку з великою кількістю дрібних бруньок на поверхні у вигляді корони, що є важливою диференціальною ознакою збудника (рис. 101).

Рис. 101. Paracoccidioides brasiliensis: 1 – клітини; 2 – колонії; 3 – старі спори.

Чисті культури виділяють на кров’яному і сироватковому агарі з антибіотиками. P. brasiliensisростеповільно. Удріжджоподібнійфазікультивуютьпри37 °С (гладенькі або гірозні колонії). Під мікроскопом видно крупні, овальні або круглі клітини з бруньками або без них.

Міцелярніформивиростаютьприкімнатнійтемпературі(колоніїскладчасті, покритібілувато-сіримабожовтуватим пушком). Примікроскопії виявляють розгалужений міцелій іовальні конідії. Здіагностичною метоюдосліджуваний матеріал вводять у паренхіму яєчок лабораторних тварин, потім виділяють збудника з уражених ділянок.

Упізністрокизахворюваннядосліджуютьсироваткукровінанаявністьантитіл у реакціях зв’язування комплементу та преципітації в гелі. Алергічну пробу вважають специфічною. Для її постановки використовують алерген із тканинної форми гриба.

Гістоплазмоз – широко розповсюджений хронічний системний мікоз. Збудник американського гістоплазмозу – Histoplasmа capsulatum, африканського – H. duboisii. Гриби мають тканинну (дріжджову) і культуральну (міцелярну) форми. Тканинна форма розташовується всередині макрофагів, лейкоцитів, гігантських клітин селезінки, печінки, лімфатичних вузлів.

Спочатку процес розвивається в носоглотці, гортані й легенях, пізніше уражуються майже всі тканини і органи.

При лабораторній діагностиці досліджують гній, харкотиння, спинномозкову рідину, сечу, пунктати лімфатичних вузлів і кісткового мозку, біоптати лімфа-

тичних вузлів і органів. Для серологічних реакцій беруть кров. Етіологію гістоплазмозу встановлюють шляхом мікроскопічного і мікологічного дослідження, постановки біопроби та імунологічних реакцій.

Мікроскопія патологічного матеріалу дає змогу виявити гістоплазми – грампозитивні овальні або круглі клітини, що брунькуються, оточені капсулою. Характерне їх внутрішньоклітинне розташування. H. duboisii можуть виявлятись і позаклітинно. ПрепаратизабарвлюютьзаметодомГрамаабоРомановського-Гімзи. Для гістологічного дослідження виготовляють препарати-зрізи з уражених тканин і фарбують їх за Грамом-Вейгертом.

Мікологічні (культуральні) дослідження проводять в умовах суворого режиму, прийнятого для особливо небезпечних інфекцій. Клінічний матеріал сіють на середовище Сабуро, сироватковий або кров’яний агар з антибіотиками, а також заражуютькурячіембріони. Посівиінкубуютьпри25-30 °Сі37 °Спротягом2-3-х тижнів. При температурі 25 °С виростає міцелярна форма гриба, при 37 °С – дріжджова.

Колоніїміцелярноїформисірувато-білогоабокоричневогокольору, пухнасті, вростаютьвагар. Примікроскопії міцелійрозгалужений, септований, збоковими мікроконідіями; макроконідії округлої або грушеподібної форми.

Колоніїдріжджоподібноїформигладенькі, блискучіабоматові, білувато-сірі, м’якої консистенції, містять округлі клітини, що брунькуються, часто розташовані ланцюжками.

Длясерологічноїдіагностикинайбільшефективнимивважаютьреакціюпреципітації в гелі та РЗК. Хороші результати дає постановка біологічної проби на білих мишах або золотистих хом’ячках. Патологічний матеріал вводять у черевну порожнину і через місяць від тварин виділяють та ідентифікують чисті культури грибів. Для виявлення алергічного стану ставлять внутрішньошкірну пробу з гістоплазміном. Але останні методи мають лише допоміжне значення.

Кокцидіоїдоз – гострий або хронічний глибокий системний особливо небезпечний мікоз людей і тварин, що викликається Coccidioides immitis. Хвороба ендемічна для США і Латинської Америки. Уражуються шкіра, підшкірна клітковина, легені та інші внутрішні органи і кістки. Збудник знаходиться в грунті. Зараження відбувається при вдиханні пилу. Від людини до людини цей мікоз не передається. Досліджуваним матеріалом служить харкотиння, гній, ліквор, біопсійний матеріал, взятий під час операції.

Лабораторна діагностика базується на проведенні мікроскопічного, культурального, біологічного та імунологічного дослідження. Патологічний матеріал мікроскопують в нативних препаратах або забарвлених за Грамом-Вейгертом і Мак-Манусом. При цьому виявляють великі (до 200 мкм), округлі, товстостінні сферули, наповнені дрібними спорами.

Виділення чистих культур і всі маніпуляції з ними проводять у лабораторіях суворого режиму як із збудниками особливо небезпечних інфекцій. Для цього гриба характерний диморфізм: при 37 °С виростає дріжджоподібна форма (гладенькі без повітряного міцелію колонії), а при 25 °С – міцелярна форма

Для виділення чистих культур використовують також внутрішньоочеревинне або інтратестикулярне зараження гвінейських свинок, хом’ячків, білих мишей і щурів. У тварин виникають гранульоматозні ураження, в яких виявляють типові тільця дріжджоподібних форм.

Із серологічних методів найчастіше ставлять реакції аглютинації (особливо латекс-аглютинації), преципітації і зв’язування комплементу. В усіх реакціях антитіла виявляють у високих титрах. Досить ефективним методом діагностики є постановка алергічних проб із споротрихіном.

Хромомікоз (тропічний бластомікоз) – хронічне захворювання шкіри,

підшкірної клітковини і внутрішніх органів, яке супроводжується утворенням бородавчастих, папіломатозних розростань, дрібних і великих абсцесів та гранульоматозних вогнищ. Найчастіше хромомікоз викликає Phialophora verrucosa, значно рідше – інші види дейтероміцетів. Даний мікоз зустрічається переважно в країнах із тропічним і субтропічним кліматом; в Україні реєструється рідко.

Лабораторну діагностику хромомікозу проводять за допомогою мікроскопії гною, зскрібків або біоптатів уражених тканин у краплі 10 % КОН або в розчині спирту з гліцерином під покрівним скельцем. Досліджують і забарвлені за методом Романовського-Гімзи і Ціля-Нільсена препарати. Тканинні форми гриба ма- ютьвиглядвеликих(5-15 мкм) округлихклітинбурого, зеленуватогоабоянтарножовтого кольору. Цей метод мікроскопічного дослідження дає найдостовірніші результати.

Чисті культури грибів виділяють на середовищі Сабуро, інкубуючи посіви при 25-28 °С. Колонії опуклі, оксамитово-пухнасті, сірувато-оливкового кольору. Міцелій септований, хламідоспори інколи розділені на 2-4 клітини (рис. 103).

Рис. 103. Phialophora verrucosa: 1 – тканинна форма; 2 – колонії; 3 – міцелій.

Ідентифікуютьвиділенікультуризаморфологічнимиознакамиколонійіособливостями спороутворення. При потребі чисті культури можна виділити шляхом інтратестикулярного зараження самців гвінейських свинок.

Часомпроводятьпостановкуреакційпреципітаціїтазв’язуваннякомплементу, атакож алергічну пробу, але вони не маютьсуттєвого значення в діагностиці хромомікозу.

Плісняві (цвільові) мікози

До цієї групи мікозів належать різноманітні грибкові захворювання легень, шкіри, нігтів, внутрішніх органів тощо. Залежно від збудника, їх називають аспергільозами, пеніцилінозами, мукорозами та ін. Вони виникають, як правило, у людей з імунодефіцитами або мають професійний характер (борошномели, пивовари, робітники пеніцилінових заводів тощо).

Аспергільоз – мікоз, який викликають різні види грибів роду Aspergillus. Ос-

новнимзбудником єAspergillus fumigatus, іншівиди–A. niger, A. flavus, A. nidulans –

зустрічаютьсярідше. Улюдейаспергілиуражуютьшкіру, легені, бронхи, приносові пазухи, рогівку очей, нігті, зовнішніслуховіпроходи, внутрішніорганиітканини.

Досліджують харкотиння, гній, пунктати, випорожнення, лусочки шкіри і нігтів, біопсійнийматеріал. Використовуютьмікроскопічний, культуральний, біологічний та імунологічний методи діагностики.

Виявлення аспергіл у закритих вогнищах ураження (інфільтрати, абсцеси), а тим більше виділення з них чистих культур є важливоюосновою для встановлення діагнозу. Під мікроскопом спостерігають нитки міцелію з характерними органами плодоносіння у вигляді конідієносців із кінцевим здуттям, стерігмами і ланцюжками конідій.

МолодіколоніїA. fumigatus наагаріСабуроокруглі, вовнисті, білогокольору. При старінні вони стають порошкоподібними, сизо-зеленуватими або чорними. Мікроскопічне дослідження колоній виявляє септований міцелій з характерними органами плодоносіння (рис. 104).

Рис. 104. Aspergillus fumigatus: 1 – тканинна форма; 2 – колонії; 3 – міцелій.

Діагностикааспергільозупривідкритихураженняхчасто утруднена. Клітини грибів у харкотинні або промивних водах бронхів у більшості випадків відсутні, або поодинокі. Виділення чистих культур, навіть таких якA. fumigatus, неможе бутидоказомнаявностіасперільозувідкритихповерхонь. Адже всівиди аспергіл є сапрофітами. У вигляді спор вони розповсюджені в повітрі й люди можуть вдихати їх. Окрім того, аспергіли вегетують на слизових оболонках здорових людей як представники нормальної мікрофлори. Отже, в таких випадках необхідно робити повторні дослідження з обов’язковим посівом для кількісного

визначення збудника в патологічному матеріалі. Ще краще діагностику аспергільозу проводити виключно серологічними методами. Для цього використовують реакції преципітації за Оухтерлоні та зв’язування комплементу. Позитивна реакція на антитіла є специфічною для всіх видів аспергіл, що викликає необхідність повторного тестування з антигенами різних видів грибів цього роду. ДіагностичнезначеннямаєтакожвиявленнявисокоготитруIgE всироватцікрові хворих. Для уточнення діагнозу має значення постановка внутрішньошкірної або інгаляційної алергічної проби.

Окремі представники аспергіл здатні продуктувати афлатоксини, які мають високу отруйність і канцерогенну дію. Виділені культури грибів перевіряють на токсигенність шляхом введення фільтратів бульйонних культур кроликам або гвінейським свинкам.

Пеніциліноз – опортуністичний мікоз, при якому спостерігаються ураження шкіри, нігтів, слизовоїоболонкиротоглотки, зовнішніхслуховихпроходів, легень таіншихвнутрішніхорганів, спричиненихрізнимивидамигрибівродуPenicillium: P. crustosum, P. notatum, P. glaucum та ін. Всі вони ще менш патогенні, ніж аспергіли, і тому дуже рідко викликають захворювання, здебільшого у осіб із різними імунодефіцитами.

Лабораторна діагностика пеніцилінозу має значні труднощі, оскільки вказанівидигрибівширокорозповсюдженівбактеріологічнихлабораторіяхієзвичними контамінантами живильних середовищ у процесі бактеріологічних досліджень.

Патологічним матеріалом служить гній, харкотиння, пунктат закритих вогнищ, лусочки шкіри і нігтів, зскрібки слизових оболонок, вушна сірка.

Беззаперечнимдлявстановленнядіагнозуєвиділеннячистоїкультуригрибів припосівібіопсійногоабоіншогоматеріалу, взятогоіззакритоговогнища(абсцес, закрита порожнина, уражена тканина), а також гістологічне дослідження забарвлених зрізів уражених тканин.

Досліджуванийматеріалобробляють10 % КОНабосумішшюспиртузгліцериномівиготовляютьпрепаратнадавленоїкраплі. Підмікроскопомвиднокороткі розгалужені септовані гіфи та китички пеніцилу з ектоспорами-конідіями.

Культуральнийметоддіагностикипроводятьшляхомпосівуматеріалунаагар Сабуро з наступним вивченням характеру колоній та їх мікроскопічного дослідження.

P. сrustosum утворює плоскі бархатні колонії, китички дво-, три- і багатомутовчасті, конідії круглі або еліпсоподібні. P. glaucum має світло-голубі або зелені колоніїзрадіальнимиборозенками, конідієносціодиничні, спорикруглійовальні (рис. 105). P. notatum ростеувиглядісиньо-зеленихпластівчастихколоній, китички у них несиметричні, спори овальні.

Серологічні реакції преципітації та зв’язування комплементу з антигенами відповідних видів грибів, а також алергічні проби не мають вирішального діагностичного значення.

Мукороз (фікомікоз) – хронічний глибокий мікоз, що викликається різними видами грибів родини Mucoraceae: Absidia corymbifera, Mucor mucedo, Rhisopus

Рис. 105. Penicillium glaucum: 1 – тканинна форма; 2 – колонія; 3 – органи плодоносіння.

nigricans. Захворювання супроводжується ураженням шкіри, підшкірної клітковини, органів дихання, вух, очей і центральної нервової системи.

Для лабораторного дослідження направляють харкотиння, слиз із носа, гній, пунктати закритих вогнищ ураження, біопсійні й автопсійні матеріали, лусочки шкіри, навколонігтьових валиків, виділення із слухових проходів.

Діагностика мукорозу вимагає ретельної оцінки отриманих результатів. У харкотиння і на слизову оболонку носа спори грибів можуть потрапити з повітря й вести себе як сапрофіти. Але можна й при явній клінічній картині не виділити збудника. Утакихвипадкахнеобхіднодослідитизабарвленігістологічнізрізиуражених тканин.

Звичайно ж у патологічному матеріалі виявляють несептований розгалужений міцелій шириною 15-20 мкм. У харкотинні часто знаходять спорангії діаметром до 60 мкм з овальними ендоспорами.

На середовищі Сабуро A. corymbifera росте у вигляді пухнастих, спочатку білих, апотімтемнішихколоній. Розміриспорангіївколиваютьсявід40 до60 мкм. Спори овальні, безбарвні, гладенькі, рідше шорсткі.

M. mucedo утворює субстратний міцелій. Спорангієносці закінчуються жов- тувато-бурими спорангіями, що наповнені овальними спорами. Спорангії видимі навіть неозброєним оком.

R. nigricans на поверхні агару має химерно переплетений міцелій, від якого пучками відходять спорангії, які спочатку мають коричневий, а пізніше чорний колір. Вони містять еліпсоподібні або неправильної форми шершаві спори.

Длявизначенняпатогенностівиділенихкультурчасомпроводятьінтраназальне або внутрішньоочеревинне зараження гвінейських свинок і курей спорами грибів.

Серологічнітаалергічніметодидотеперщенедостатньорозробленіі, яквважають спеціалісти, вони можуть мати лише допоміжне значення.

Пневмоцистоз – класичний опортуністичний мікоз, що супроводжується розвитком інтерстиціальної пневмонії. Збудник захворювання – Pneumocystis carinii – донедавна відносили до найпростіших. Тепер встановлено, що він є дріжджовимгрибомкласуBlastomycetes. Хворобарозвиваєтьсянафоніпригнічення імунологічної реактивності. Особливо частовона виникає при ВІЛ-інфекції і є

408 Частина V. Мікози

однієюзголовнихпричинсмертізахворілих. Пневмоцистозрозвиваєтьсяпридовготривалому вживанні імунодепресантів, цитостатиків, кортикостероїдів і антибіотиків.

Основний метод діагностики – мікроскопічний. Збудник не росте на штучнихживильнихсередовищах, алеєспробиотримати культуризадопомогоюлегеневої моделі на білих мишах, яким попередньо вводили кортизон.

Найкращимматеріаломдлядослідженняєлегеневатканина, взятаприбіопсії на відкритих легенях або через бронхи, а також трансторакальні аспірати. Останні особливо рекомендують при діагностиці пневмоцистозу у дітей. Харкотиння менш придатне для дослідження, за винятком ВІЛ-інфекції.

Проби тканин, взятих при відкритій легеневій біопсії, проглядають макроскопічно для виявлення уражених вогнищ. Із ущільнених ділянок відбирають маленькі шматочки й виготовляють “роздавлені мазки” та заморожені гістологічні зрізи. Фрагменти тканин, отриманих при трансбронхіальній біопсії, дуже малі длявиготовленнявказанихпрепаратів. Утакихвипадкахдля“роздавленихмазків” необхідно взяти 3-4 біоптати. Бронхоальвеолярний лаваж може бути корисним у хворих на СНІД, у яких P. carinii значно більше.

Мазки і гістологічні зрізи найчастіше забарвлюють за методом Грама-Вей- герта або Романовського-Гімзи. Найбільш ха-

лені варіанти реакцій імунофлуоресценції та схем імуноферментного аналізу, але відповідні тест-системи практично недоступні для рутинних мікробіологічних лабораторій. З метою серологічної діагностики запропоновані реакції зв’язування комплементу, імунофлуоресценції та ензиммічених антитіл.

лення, висушують поступово і не фіксують. Мазки забарвлюють 40-45 хв фарбою Романовського (1 крапля робочого розчину фарби на 1 мл нейтральної (рН 7,0) води, а товсту краплю – 4-5 % водним розчином фарби протягом 20-25 хв. Препарати ретельно промивають водою, висушуютьувертикальномуположеніймікроскопують під імерсійним об’єктивом.

Мазки з ліквора і пунктатів готують так само, як і мазки крові, фіксують і забарвлюють за методом Рома- новського-Гімзи.

Зскрібки з інфільтратів шкіри роблять так: уражену ділянку протирають спиртом, стискають між двома пальцями і гострим скальпелем роблять поверхневий надріз шкіри. Тим же скальпелем роблять зскрібок із дна і країв надрізу, швидко наносять тонким шаром на предметне скло, фіксують у суміші Никифорова й за-

барвлюють за Романовським-Гімзою. Забарвлення залізним гематоксиліном за Гейденгайом використовують для виявлення тонкої структури ядра і цитоплазми найпростіших.

Мазки із вагінальноговмісту роблять при підозрі на трихомоноз. Нанесену на предметнесклокраплюматеріалунакриваютьпокрівнимскельцемівідразумікроскопують. У такій надавленій краплі виявляють рухливі форми найпростіших. Ви- сушенітафіксованімазкизабарвлюютьзаметодомГрамаабоРомановського-Гімзи. Останній має переваги, оскільки дає змогу легко ідентифікувати трихомонади.

Длявиявленнянайпростішихукишечномутрактіготуютьмазкиіздуоденальноговмістуівипорожнень. Придуоденальномузондуванніберутьвсітрипорції(А, В, С) так, щоб не було домішки шлункового соку. Отримані порції окремо виливають у чашки Петрі, відбирають слизові грудочки і готують препарат надавленої краплі. Порції жовчі центрифугують, з осаду роблять мазки, які досліджують спочатку під малим, а потім під великим збільшенням. У дуоденальному вмісті можна виявитивегетативніформилямблій. Рекомендуютьпроглядати10-20 препаратівнадавленої краплі.

Нативні препарати з фекалійготують так: напредметне скло наносять краплю ізотонічногорозчину хлориду натріюіпорядтаку ж кількість розчинуЛюголя. Дерев’яною або скляною паличкоюберуть частинку випорожнень і розтирають окремо в обох краплях, які потім накривають покрівними скельцями і розглядають при малому і великому збільшенні мікроскопа. Дуже добрі результати отримують при дослідженніживихнайпростішихпідфазово-контрастнимабоаноптральниммікро- скопом.

Якщо неможливо негайно дослідити випороження, їх консервують і направляють до лабораторії. Для цього використовують консерванти Барроу або Сафарлієва, налиті у пеніцилінові флакони приблизно до половини. До них додають свіжі фекалії в об’ємі, що складає третину консерванта. При цьому морфологічні