Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

комплементу, гемаглютинаціїтапостановкиалергічнихпроб. Імунологічніреакції мають особливо важливе значення у випадках ураження пацієнтів двома і більше видамимікозів. Окрімтого, серологічнедослідженнявиявляєтьсяціннимприкандидозах і аспергільозах, коли мікологічний метод може лише виявити кандиди і аспергіли, але неспроможний доказати їх етіологічну роль. Адже ці гриби часто виділяють і у здорових людей. Однак слід пам’ятати, що результати імунологічних реакцій часто можуть бути сумнівними внаслідок перехресного реагування антитіл з антигенами різних видів грибів. У зв’язку з цим жодна із серологічних реакційнемаєвирішальногозначенняпридіагностицівідповіднихмікозів. Виявленнявисокихтитрівантитілвсироватцікрові, особливометодомпарнихсироваток, дозволяє раніше поставити діагноз, ще до отримання результатів культивування грибів.

Найчастішевикористовуютьреакціїлатекс-аглютинації, імунофлуоресценції, преципітації (за методом Оухтерлоні або зустрічного імуноелектрофорезу), зв’я- зування комплементу, непрямої гемаглютинації та імуноферментний аналіз. Методика постановки цих реакцій така сама, як і при діагностиці бактеріальних інфекцій.

Для виявлення мікотичної алергії проводять постановку епікутанних, скарифікаційних і внутрішньошкірних проб з відповідними алергенами (убиті культури грибів, їх фільтрати, білкові або полісахаридні фракції з клітин чи оболонок відповідних збудників). Результати проб враховують через 20 хв (негайні) і через 24-48 год (уповільнені). Вони проявляються у вигляді почервоніння, набряку, рідше – некротизації у місці введення алергену. У окремих осіб можуть виникати нездужання, незначне підвищення температури, зміни з боку крові. Позитивна проба на кокцидіоїдин і гістоплазмін у регіонах, ендемічних відносно кокцидіоїдомікозу, вказує на давно минулу або недавню інфекцію. Однак у країнах, де такі мікози зустрічаються дуже рідко, позитивна алергічна реакція має певну діагностичну цінність.

Алергізацію організму негайного типу до грибів можна виявити і за допомогою імунологічних тестівin vitro: реакції дегрануляціїтканинних базофілів, базофільнийтестШеллітаін. Длявиявленнягіперчутливостіуповільненоготипуставлять реакції бласттрансформації лімфоцитів і гальмування міграції фагоцитів.

Біологічний метод використовується при глибоких і особливо небезпечних мікозах для виділення культури збудника, визначення його патогенності, ідентифікації тканинних форм грибів. При зараженні тваринвикористовують як патологічний матеріал від хворого, так і виділену культуру. Найбільш придатними тваринами є лінійні білі миші та золотисті хом’ячки. Окрім них, біопроби можна ставитинагвінейськихсвинках, щурах, кроликах, собакахікотах. Досліджуваний матеріал вводять нашкірно, внутрішньошкірно, підшкірно, внутрішньом’язово, внутрішньоочеревинно, інтраназально, інтратрахеально, інтрацеребрально, через рот. Внутрішньошкірне зараження найчастіше проводять дерматофітами, інтраназальнеівнутрішньоочеревинне– особливонебезпечнимигрибами, інтрацеребральне – при криптококозах, кладоспоріозах, кандидозах. Розроблені також спе-

Мікробіологічна діагностика кандидозів включає мікроскопію патологічногоматеріалу, виділеннячистихкультургрибів, проведеннясерологічнихреакційі постановку алергічних проб. При локальних і системних формах захворювання матеріал для дослідження беруть з уражених ділянок – лусочки шкіри, зскрібки з нігтів, слиз, гній, харкотиння, сечу, жовч, ліквор, випорожнення; при генералізованих – кров, пунктати абсцесів, біопсійний матеріал; від трупів – кров із серця, шматочки паренхіматозних органів.

Мікроскопічнедослідження. Підзвичайнимсвітловим, фазово-контрастним або аноптральним мікроскопом вивчають нативні (незабарвлені) препарати чи мазки. Щільний патологічний матеріал (шкірні лусочки, зскрібки з нігтів, некротизовані тканини тощо) вносять у краплю 10 % розчину гідроксиду калію або натрію на предметному склі, обережно підігрівають над полум’ям газового пальника протягом 1 хв і накривають покривним скельцем. Матеріал рідкої консистенції досліджують у суміші спирту з гліцерином і водою у співвідношені 2:1:2, або в розчині Люголю подвійної концентрації в препаратах надавленої краплі без підігрівання. Мікроскопування проводять спочатку за допомогою об’єктиву 8× , а потім40х. Принаявностівдосліджуваному матеріалікандидунативнихпрепаратах виявляють круглі або овальні дріжджові клітини, що брунькуються, і псевдоміцелій (рис. 96).

Рис. 96. C. albicans: 1 – мазок із матеріалу; 2 – колонії; 3 – псевдоміцелій і хламідоспори (за П.Н. Кашкіним і В.В. Лісіним, 1983).

Гриби кандиди зустрічаються на шкірі, слизових оболонках і у здорових людей, але, якправило, вневеликійкількості. Томудлябільшдостовірноїдіагностики кандидозу важливе кількісне визначення кандид у досліджуваному матеріалі. Виявлення великої їх кількості в патологічних виділеннях (особливо при значних розведеннях) вказує на можливість кандидозу.

Кращірезультатидаєдослідженнязабарвленихпрепаратів. Висушенийтонкий мазокнапредметному склі фіксуютьметиловимспиртомабовсумішіНикифорова й забарвлюють метиленовим синім (1-3 хв), генціановим фіолетовим (2-3 хв), фуксином Пфейфера (1-2 хв). Ще краще фарбувати мазки складними методами. При забарвленні за Грамом кандиди мають темно-фіолетовий колір, за Цілем-

Нільсеном– синійізрожево-жовтуватимивключеннямиліпідів, заРомановськимГімзою – рожево-жовтий із фіолетовими включеннями волютину.

Кандиди можна виявити й при гістологічному дослідженні зрізів із уражених тканин, забарвлених за методом Грама-Вейгерта або Шабадаша. При ранніх строках ураження можна застосувати прямий метод флуоресценції при обробці мазків ізотіоціанатом флуоресцеїну, який дає яскраве золотаво-зелене світіння.

Більш надійно діагноз кандидозу встановлюють за допомогою виділення чистої культури C. albicans.

Мікологічнедослідження. Будь-якийпатологічнийматеріалсіютькількісним методомнащільнесередовищеСабуроабосусло-агар, атакожуглюкознийМПБ. До стерильних середовищ перед посівом добавляють пеніцилін і стрептоміцин для пригнічення росту супутньої бактеріальної флори. Посіви вирощують при температурі 30 °С. При рості більше 1000 типових колоній з розрахунку на 1 г досліджуваного матеріалу роблять висновок, що кандиди є етіологічним агентом захворювання.

Ізольовані колоніїC. albicans на агарі Сабуро круглі, білувато-кремові, блискучі, гладенькі, з рівними краями, нагадують краплі майонезу. Вони глибоко вростають у середовище. Для виявлення псевдоміцелію колонії відсівають у одне з рідких середовищ – глюкозний МПБ, картопляну воду або моркв’яно-рисовий відвар. Спочатку з’являється каламуть або осад, рідше – плівка на поверхні середовища. Псевдоміцелій виявляють на 3-5 день або пізніше при мікроскопічному дослідженні надавленої краплі, користуючись об’єктивом 8× .

Диференціально-діагностичніознакиC. albicans маютьважливезначеннядля ідентифікації, оскільки цей вид є основним збудником кандидозу. На термінальних нитках псевдоміцелію C. albicans утворюються хламідоспори – двоконтурні кругліструктуридіаметром10-20 мкм, бластоспориз’являютьсяврезультатібрунькування, розташовуються нерегулярно з обох боків псевдоміцелію.

Прикультивуванні в сироватці або яєчному білкові при 37 °С через 2-4 годбластоспори утворюють характерні “ростові трубки” або RB – фактор. Ті штами, які затакийкороткийстрокненабувають“ростовихтрубок”, якправило, невірулентні.

ДляідентифікаціївидівгрибівродуCandіda використовуютьтакожїхферментативну активність. C. albicans розкладає глюкозу, мальтозу і галактозу до кислотийгазу, С. tropicales – розкладаєтіжвуглеводиідодаткову сахарозу, аC. krusei – лише лактозу.

Серологічна діагностика проводиться здебільшого при вісцеральних формахкандидозів. Прицьомувикористовуютьреакціїаглютинації, зв’язуваннякомплементу, преципітації, непрямої гемаглютинації, зустрічного імуноелектрофорезу та метод ІФА з парними сироватками з використанням загальноприйнятих методик. Результати вважають позитивними при наростанні титру відповідних антитіл у 4 і більше разів. Для постановки реакції аглютинації, преципітації та зв’язування комплементу краще використовувати антигени з культур, виділених від даного хворого (автоштами). Для більш надійної серологічної діагностики кандидозу краще використовувати не одну з названих реакцій, а дві-три.

Біологічнапробавикористовуєтьсяпринеобхідностівизначитипатогенність і вірулентність C. albicans. Виділену від хворого культуру вводять внутрішньовенно білим мишам або кроликам. Патогенними визнають ті культури, які в дозі 1 млн клітин викликають загибель мишей протягом п’яти діб, а кроликів – через дев’ять діб.

Шкірні алергічні проби проводять шляхом внутрішньошкірного введення кандида-алергену. Вякостіалергену можна використовуватиполівалентну вакцину, що містить 200 млн клітин в 1 мл. Після нагрівання вакцини при 80 °С протя- гом2-хгодїївводятьвоб’ємі0,1 млвнутрішньошкірно. Позитивнуреакцію(гіперемія, набряк, папула) враховуютьчерез 24-48 год. Алергічна проба при кандидозахмалоспецифічна, оскількисенсибілізаціядогрибковихантигенівзустрічається дуже часто й повсюдно.

Дерматомікози

Грибкові захворювання шкіри, її придатків і підшкірної клітковини мають загальнуназвудерматомікози(дерматофітії). Залежновідродуівидузбудниківта реакції організму на їх проникнення розрізняють такі види дерматомікозів: епідермофітія, руброфітія, трихофітія, мікроспорія і фавус (парша).

Епідермофітія. За клінічною картиною і найчастішою локалізацією патологічного процесу виділяють дві форми цього захворювання: пахвинна епідермофітія і епідермофітія стопи. Пахвинну форму викликає Epidermophyton floccosum

(син. E. inguinalе). Збудником епідермофітії стоп є Epidermophyton interdigitalе

(син. Trychophyton mentagotophytes). Обидві форми захворювання зустрічаються лише у людей і поширені в усіх країнах світу.

При пахвинній епідермофітії уражається шкіра пахвинних, міжсідничних і пахвових складок, ділянки шкіри під молочними залозами, інколи й нігтьові пластинки. При епідермофітії стоп у міжпальцевих проміжках злущується епітелій, часто приєднується ураження нігтів.

Лабораторна діагностика обох форм епідермофітії подібна. Залежно від локалізації патологічного процесу для дослідження беруть шкірні лусочки, клапті мацерованого епідермісу, кришечки пухирців, зскрібки з нігтьових пластинок.

Для мікроскопічного дослідження патологічний матеріал подрібнюють, вносять у краплю 10 % розчину КОН або NaOH на предметному склі, підігрівають до появи парів і залишають на 15 хв, а зскрібки з нігтів – на 1-2 год. При мікроскопії надавленої краплі виявляють короткий (2-4 мкм) переплетений розгалужений міцелій і артроспори прямокутної форми, які розташовані у вигляді ланцюжків.

Мікологічнедослідженнядаєможливістьвиділитичистукультуруівизначити рід та вид збудників. Для цього подрібнений патологічний матеріал сіють на щільне середовище Сабуро з антибіотиками в пробірках. На поверхню агару наносять 4-5 шматочків матеріалу в кожну пробірку. Оптимальна температура для культивування становить 27 °С, але хороший, хоч і повільний ріст грибів можливий і при кімнатній температурі.

шая. Хронічні форми трихофітії супроводжуються ураженням нігтів, глибоких шарів шкіри і навіть внутрішніх органів.

Улусочкахшкіриінігтьовихпластинкахзбудникзнаходитьсяувиглядігіллястого міцелію, у волоссі розташовується за типом “ендотрикс”. Спори однакові, крупні, овальні, рідко квадратні, знаходяться всередині волосини у вигляді довгастих ланцюжків.

При посіві на агар Сабуро T. violaceum починає рости на 4-5 день у вигляді білого або ледь жовтуватого горбика. Дозріла колонія щільна, суха, порошкопо-

гічномуматеріалівиглядає підмікроскопомякіпопереднійвид. ПрипосівінасередовищеСабурозріліколонії

появляються через 25-30 днів. Поверхня їх складчаста, матова або масляниста, з чітко окресленими краями блідо-бузковогоабофіолетовогокольору, рідко безбарвні. Примікроскопії колоніїметодомнадавленої краплівиявляють тонкий, малосептованийміцелійзбоковимирозгалуженнями. Виднотакож малійкрупнікінцевіта вільні хламідоспори.

Мікроспорія– хронічне захворювання шкіри і волосся, яке викликають дерматофіти родуMicrosporum. Дуже рідко уражуютьсянігті. Найчастішимизбудниками є антропофільні гриби Microsporum audouinii, M. ferrugineum і зоофільний – M. canis. Всі вони характеризуються високою контагіозністю і викликають захворювання переважно у дітей ясельного тадитсадкового віку, а також у школярів. У місціпроникненнязбудниканашкіріпоявляютьсячіткоокресленізапальніплями округлої або овальної форми з характерним висівкоподібним злущуванням. При ураженні волосистої частини голови виникають 1-2 осередки ушкодження, де волосини обламані до 5-8 мм над шкірою і вкриті білим чохлом із спор грибів.

Для лабораторної діагностики мікроспорії використовують мікроскопічні й мікологічнідослідження. Прививченішкірнихлусочокізураженоїділянкишкіри під мікроскопом гриби мають вигляд тонких розгалужених гіфів з невелекою кількістючіткоокресленихперетинок(септ). Можназустрітиланцюжкиміцелію, що розпадаються на спори. При мікроскопії ураженого волосся видно велику кількість круглих спор, які оточують волосину суцільним шаром. У фолікулярній

398 Частина V. Мікози

частині волосини можна виявити септоватий міцелій. Уражені пушкові волоски мають спори лише всередині.

При посіві патологічного матеріалу (лусочки, волосся) на агар Сабуро спостерігають повільний ріст круглих, плоских, пухнастих, сіруватих або кремуватих

Фавус (парша) – хронічне грибкове захворювання шкіри, волосся і нігтів. Зустрічається в усіх країнах світу, в Україні останнім часом реєструється дуже рідко. У переважній більшості випадків збудником є антропофіл Trichophyton schonleini (Achorion schonleini). Найхарактернішою ознакою фавуса є утворення скутул (фавозних щитків) – круглих, плоских або блюдцеподібних структур діаметром 2-3 см, спаяних зі шкірою. Вони мають жовтий колір, крихку консистенцію, складаються з уражених епітеліальних клітин і елементів грибів. Уражені волосини міцно з’єднані в товщі скутули, але залишаються довгими і сухими, набувають сірого кольору.

Примікроскопіїлусочокзураженихділянокшкіривиднорозгалуженийсептований міцелій, часто з артроспорами. Елементи грибів у волоссі розміщені всередені. Це поліморфний (тонкий і більш широкий) септований міцелій із заокругленими або загостреними кінцями. Тут же зустрічаються ланцюжки і купки круглих і багатогранних спор, бульки повітря, крапельки жиру.

Виділення чистих культур грибів проводять шляхом посіву на щільне середовище Сабуро. Колонії починають рости з 3-4 дня у вигляді сіруватого горбика. На 10-й день вони досягають розмірів 1-2 см, ще пізніше стають зморшкуваті, ніздрюваті, сухі, подібні на гриб сморж або губку, мають різноманітний колір: білий, жовтий, кремовий, коричневий.

При мікроскопічному дослідженні молодих колоній у препараті надавленої краплі виявляють тонкий, ніжний, чітко сегментований міцелій; пізніше він стає грубшим, на ньому появляються бокові веретеноподібні здуття і розгалуження на кінцях, щонагадуютьканделябри, рогипівнічнихоленівтощо. Увеликійкількості видноінтеркаларнійкінцевіхламідоспори. Макроконідіїмножинні(по5-8 штук), тонкосептовані, їх розміри коливаються від 6-10 мкм до 30-80 мкм.

(0,05 мл) абовчеревнупорожнину(0,5 мл). Двохіззараженихмишейдосліджують через 2 тижні, а двох інших – через 1-2 місяці. Гомогенізовані шматочки печінки, селезінки і мозку висівають на середовища й ідентифікують виділені культури.

При підозрі на криптококоз проводять також серологічні дослідження, спрямовані як на визначення антигенів збудника, так і антитіл у сироватці крові. Для виявлення антигенів використовують реакцію латекс-аглютинації, імуноелектрофорезтаімуноферментнийаналіз. Антитілавизначаютьзадопомогоюреакціїаглютинації, преципітації, непрямоїгемаглютинаціїтазв’язуваннякомплементу. Рідко проводять внутрішньошкірні проби. Серологічні й алергічні реакції мають не вирішальне, а лише допоміжне значення.

Північноамериканський бластомікоз – антропозоофільний мікоз з уражен-

нямшкіри, слизовихоболонок, внутрішніхорганівікісток, ендемічнийдляКанади і США. Збудник – Blastomyces dermatitides. Для лабораторної діагностики використовуютьгній, харкотиння, сечу, спинномозковурідину, пунктатлімфовузлів, кров для серологічних реакцій. Проводять мікроскопічні, культуральні та імунологічні дослідження.

Доставлений матеріал обробляють 10 % розчином гідроксиду калію, проглядають у нативних препаратах методом надавленої краплі в суміші спирту з гліцерином. Використовують сухі об’єктиви (20× , 40× ). Бластоміцети виглядають як крупні (до 20 мкм) дріжджоподібні клітини круглої чи овальної форми з двоконтурною стінкою та однією брунькою, яка зв’язана материнською клітиною широкою основою. Псевдоміцелій відсутній. Це так звана дріжджова фаза гриба. Досліджують також мазки, забарвлені за методом Грама або Романовського-Гімзи.

Для виділення чистої культури патологічний матеріал сіють на щільне середовищеСабуро, сусло-агаріглюкознийМПА. Культивуютьприкімнатнійтемпературі. При цьому гриби можуть виростати у дріжджовій або міцелярній фазі. Дріжджові колонії мають округлу форму, білуватий колір, сметаноподібну консистенцію. У мазках із таких колоній видно круглі або овальні клітини розміром 8-12 мкм із бруньками.

Колонії з міцелярної форми гриба маютьокруглу форму, пухнасту поверхню сіруватого кольору. При мікроскопії таких колоній видно клітини з капсулами, розгалужений септований міцелій з товстими стінками та великою кількістю бокових конідій круглої, овальної, рідше грушоподібної форми. У старих культур появляється велика кількість хламідоспор діаметром 10-18 мкм.

Виділити чисту культуру з одночасним визначенням її патогенності можна також шляхом зараження білих мишей з наступним висівом матеріалу з тканин і органів на живильні середовища.

Для досить ефективного серологічного дослідження в пізні періоди захворювання використовують реакції аглютинації, зв’язування комплементу, ІФА. Високої оцінки заслуговує і алергічна проба з алергеном бластоміцином.

Паракокцидіоїдоз (південноамериканський бластомікоз) – хронічний гли-

бокий мікоз, розповсюджений в країнах Південної Америки. Частіше хворіють людивід30 до50 років. Збудникомєдвофазний грибParacoccidioides brasiliensis.