Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

матеріалу. Однакузв’язкузвеликоютрудоємністю, цейметодупрактичнихлабораторіях не використовується.

Реакціюімунофлуоресценціїможнавикористатиіпридослідженнібіоптатів печінки. При прямій імунофлуоресценції користуються міченим флуоресцеїнізотіоцианатом IgG, виділеним із сироваток реконвалесцентів. Цінність методу полягає в тому, що він дозволяє знайти окремі клітини, які містять антиген.

Радіоімунний та імуноферментний аналізи в твердій фазі. Ці методи найрозповсюдженіші в діагностиці, мають однакову високу чутливість і специфічність. Вони мають один і той же принцип постановки з тією різницею, що в РІА використовують специфічні імуноглобуліни (IgG), мічені 125І, а в ІФА – ферментом пероксидазою.

Наявність вірусів у фекаліях є 100 % підтвердженням діагнозу, однак відсутність їх за даними серологічних реакцій не виключає гепатит А.

У окремих випадках матеріалом від хворого можна заражати лабораторних тварин. Найчастіше у високоспеціалізованих лабораторіях використовують мавп шимпанзе, мармозет, павіанів та інших.

Пізніше в матеріалі від тварин виявляють віруси гепатиту А або його антигени вищеописаними способами.

Експрес-діагностика гепатиту А спрямована на безпосереднє визначення вірусів у випорожненнях хворого. З цією метою використовують сучасні методи імунної електронної мікроскопії, радіоімунний аналіз, реакцію ензиммічених антитіл. Останній є достатньо чутливим і ефективним. Генетичний аналіз базується на ПЛР.

Серологічнедослідження. Однимізспособівдоказуетіологічноїналежності виділеного від хворих вірусу є виявлення в парних сироватках крові зростання титру специфічних антитіл. При захворюванні антитіла з’являються рано, їх синтезпочинаєтьсящевінкубаційномуперіоді, атитррізкозростає. Узв’язкузпізнім поступленням хворих у стаціонар чотирикратне діагностичне збільшення титру антитіл виявити практично неможливо. Тому цей метод діагностики не знайшов широкого застосування.

Антитіла проти вірусу гепатиту А в інкубаційному періоді й на початку гостроїфазизахворюванняпредставленікласомIgM. Поступовознижуючисьутитрі, вони циркулюютьпротягом 6-8, а деколи й 12-18 місяців. Анти-ВГА IgM синтезуються у всіх хворих, незалежно від форми інфекції. Знаходження їх – ранній тест діагностики, який дозволяє не тільки підтвердити або заперечити клінічний діагноз, але й виявити стерті, безсимптомні форми хвороби, що має вирішальне значення в епідеміологічих дослідженнях. У подальшому їх заміщує IgG. Імуноглобуліни класу М можна знаходити в крові протягом 3-6 місяців після перенесеного захворювання, в той час як IgG – протягом усього життя. Антитіла виявляють за допомогою РІА або ІФА.

Крім визначення анти-ВГА IgM, для діагностики в гострому періоді захворювання в сироватці виявляють анти-ВГА IgA, які також є ранніми антитілами і

зростають паралельно з IgM, проте зниження їх титру відбувається значно швидше. Секреторні анти-ВГА IgA знайдено також у фекаліях.

Найчастіше для визначення титру антитіл використовують ІФА, РІА, деколи – РЗК.

Гепатит В

Вірус гепатиту В (ВГВ) належить до родини Hepadnaviridae. Він представляє собою сферичної форми складнорганізований вірус діаметром до 42 нм (див. вкл., рис. 30). Зовні вірус вкритий білково-ліпідною суперкапсидною оболонкою. Капсид побудований за кубічним типом симетрії, складається з 180 капсомерів. Серцевина вірусу містить ДНК, що складається з 3200 нуклеотидних основ, ковалентно пов’язану з поліпептидом, ДНК-полімеразу, протеїнкіназу. ДНК має форму кільця, один з ланцюгів якої дефектний. У процесі репродукції вірусів ДНКполімераза добудовує дефектну ДНК.

ВГВ має декілька антигенів. Поверхневий антиген (HBsAg) високостійкий до дії фізико-хімічних факторів. Його виявляють практично в усіх біологічних рідинаххворих. Серцевиннийантиген(НBcAg) входитьдоскладунуклеокапсиду ВГВ. Цей антиген присутній в ядрах гепатоцитів хворихлюдей. HBeAg міститься між HBcAg і НВsAg. Його можна виявити в цитоплазмі та ядрах гепатоцитів людей, якіінфікованівірусом. Деякідослідникивисловлюютьприпущенняпроіснуваннящеодногоантигену– HВxAg, якийможемативідношеннядораковоїтрансформації гепатоцитів.

Віруси гепатиту В мають високу резистентність до дії різноманітних факторів зовнішнього середовища. Зокрема, вони витримують кип’ятіння протягом 15-20 хв, а при 60 °С – до декількох годин. Автоклавування при 121 °С інактивує вірус протягом 30 хв, сухий жар (160 °С) – за 60 хв, а при 180 °С – за 40 хв.

У зв’язку з тим, що вірус гепатиту В не репродукується ні в культурах тканин, ні в курячих ембріонах, можна виділити два основних напрямки лабораторних досліджень – серологічну та експрес-діагностику.

Експрес-діагностика спрямована на виявлення у крові хворого антигенів вірусугепатиту– HBsAg, HBcAg іHBeAg. УрутиннійлабораторнійпрактицінайчастішевизначаютьHBsAg. Вінз’являєтьсявкровіхворихщепротягомінкубаційного періоду, за декілька тижнів до появи основних клінічних симптомів хвороби і зростання активності печінкових ферментів трансаміназ. Як правило, у сироватці крові поверхневих антигенів у декілька сотень або тисяч разів більше, ніж самих вірусів. Розроблено декілька методів, що дозволяють виявити в сироватці хворої людини або вірусоносія ці антигени: реакція преципітації в гелі, реакція зворотної непрямої гемаглютинації, зустрічний імуноелектрофорез, РІА, ІФА. Останні дві реакції за своєю чутливістю значно перевищують попередні. HBeAg можна виявити за допомогою ІФА, РНГА, РНЗГА, РЗК, а HBcAg – ІФА, РІА та інших.

Серологічні дослідження. З цією метою досліджують сироватку крові хворих на наявність антитіл проти різних антигенів вірусів гепатиту В. Сучасні серо-

логічні методидозволяютьвизначитивкровіантитілапротирізноманітних вірусних антигенів: анти-HBs, анти-HBc і анти-HBe.

Найзручніші методи, що використовуються, – ІФА, РІА. Однак антитіла проти HBsAg можна знайти ще за допомогою реакції преципітації в гелі, реакції непрямої гемаглютинації тощо.

Визначеннявзаємозв’язкуміжвіруснимиантигенами, щоз’являютьсявкрові хворих або вірусоносіїв, та відповідними антитілами IgM i IgG, які нагромаджуються в сироватці крові, є вкрай важливим з діагностичної точки зору, оскільки дозволяєслідкуватизадинамікоюхворобитапрогнозуватиїїперебіг. Ціантигени і антитіла названі маркерами вірусного гепатиту В. До них, таким чином, нале-

жать у першу чергу HBsAg, HBсAg, HBeAg, анти-HBs, анти-HBe, анти-HBs IgM і

сумарний пул антитіл проти цього антигену.

HBsAg можна знайти в організмі людини приблизно через 3-5 тижнів після зараження. Про видужання після гострого гепатиту В свідчить повне зникнення HBsAg тапояваантитіл(анти-HBs) усироватцікрові. Останніможутьзберігатись протягом всього життя. Однак антитіла проти поверхневого HBsAg з’являються не відразу після його зникнення, а через деякий проміжок часу (від 2-4 тижнів до 1 року). У цей період маркером гепатиту виступають антитіла до HBсAg і, зокрема, IgM, а сам цей період називаєтьсякорівським вікном(відангл. core – серцевина). Ці антитіла існують у сироватці не тільки при гострій формі гепатиту, але й прихронічній. Неменшважливиммаркеромєанти-НВсантитіла, якіналежатьдо класу IgG. Ці імуноглобуліни вторинної імунної відповіді можуть бути знайдені в крові людини протягом всього життя.

ІншимдіагностичниммаркеромгострогоперіодухворобиєнаявністьHBеAg, який може циркулювати у крові до 7 тижнів. Його вважають маркером реплікації ДНКвірусу гепатитуВабоантигеномінфекційності, томущознаходятьйогонайчастіше разом з ДНК-полімеразою і ДНК вірусу гепатиту В. Хоча концентрація цих антигенів у крові нижча, ніж HBsAg, вони є майже у всіх хворих.

При гострому гепатиті В HBeAg можна виявити вкрові протягом6-8 тижнів. Пізніше там нагромаджуються антитіла проти них (анти-HBе), а вони самі зникають. ЯкщопривідповіднихдослідженняхухвороговиявляютьHBeAg після 9-10 тижня від початку захворювання, це може розглядатись як свідчення хронізаціїпроцесу. Утакихвипадкахцейензимнийантигенциркулюєвкровіпротягом декількох років.

Ретельне вивчення антигенної будови вірусу гепатиту В та системи генів, які його кодують, привернуло увагу до вірусних поліпептидів (антигенів), які кодуються геном env, зокрема, його зонами пре-S1 та пре-S2. Вважають, що наявність пре-S2 антигену в крові свідчить про її високі інфекційні властивості. У той же час у хворих, які одужали, в крові присутні антитіла до цього антигену. Пре-S1 антигени такожзасвідчуютьінфекційність крові, реплікаціювірусівворганізмі, а також достатньо високий ризик можливості вертикальної передачі вірусу гепатиту В від матері до дитини.

Гепатит С, Д, Е, G

Вірус гепатиту С належать до родиниFlaviviridae. Його відносять до складнихвірусів. Віріонмаєдіаметр30-60 нм. УцентріміститьсяодноланцюговаплюсРНК, що складається з майже з 9500 нуклеотидних основ. Зверху вірус вкритий суперкапсидною білково-ліпідною оболонкою. Віруси чутливі до ефіру, дезоксихолату натрію, УФ-опромінення, здатні витримувати нагрівання до 50 °С.

Лабораторна діагностика спрямована на виявлення анти-ВГС IgM і IgG за допомогоюімуноферментногоаналізу. Ціантитілаз’являютьсявкровіприблизно через 1 місяць після інфікування. У той же час розроблені тест-системи для іму- ноферментногоаналізу1-3-гопоколіньзвикористаннямрекомбінантнихантигенів вірусів, дозволяють визначати антитіла безпосередньо до антигенів.

Дослідити наявність вірусної РНК у крові хворої людини можна за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Вірус гепатиту D належить до роду Deltavirus. Він круглої форми, діамет- ром35-37 нм. УцентрівіріонаміститьсякільцеваоднонитковаРНК, розташована на HDAg. Вірус оточений суперкапсидною оболонкою, представленою HBsAg. Вірус гепатиту D є дефектним, оскільки його реплікація відбувається за рахунок геному ВГВ.

Вірус гепатиту D стійкий до високих температур, ферментів нуклеаз, однак легко руйнується лугами і протеазами.

З метою лабораторної діагностики вірусного гепатиту D проводять визначеннятакихйогомаркерівякHDAg, анти-HD IgM іIgG задопомогоюРІАтаІФА.

Підтверджує діагноз гепатиту D безпосереднє виявлення ВГD у сироватці крові або в гепатоцитах. HDAg з’являється в ядрах гепатоцитів у кінці інкубаційного періоду і зберігається протягом гострої фази захворювання. Однак методи його концентрування і отримання досить складні, тому доступні тільки для високоспеціалізованих лабораторій.

Серологічна діагностика використовується для визначення у сироватці крові антитілIgM іIgG протиHDAg. Анти-HD IgM з’являютьсявжечерез2 тижніпісля інфікування, а пізніше починає зростати титр анти-HD IgG.

Вірус гепатиту Е не знайшов ще свого остаточного положення в класифікаційній системі. Вважалось, що він є представником родини Caliciviridae. Збудник має сферичну форму, його діаметр становить 32-34 нм. Геном вірусу представлено однонитковою РНК, оточеною капсидом. Його поверхня має специфічні виступи та невеликі западини.

Достатньо ефективних методів діагностики цієї форми гепатиту ще немає. Є спробивиявитиінфекційніагентиуфекаліяххворихзадопомогоюімунноїелектронної мікроскопії, ПЛР. Серологічна діагностика спрямована на визначення сумарної кількості антитіл, які можна знайти, використовуючи відповідні системи для ІФА.

Вірус гепатиту G описано зовсім недавно (1995 р.). Це складний вірус, геном якого представлено однонитковою плюс-РНК. Зовні він оточений капсидною та суперкапсидною оболонками.

Основнийматеріал длядослідження – кровхворих. Унійможна виявити або вірусну РНК за допомогою ПЛР, або дослідити навність загального пулу імуноглобулінів проти інфекційного агента. З цією метою можна використати ІФА.

ВІЛ-інфекція

Віруси імунодефіциту людини (ВІЛ) входять до родини Retroviridae, роду

Lentivirus. Виділяютьдвавидизбудниківсиндромунабутогоімунодефіциту– ВІЛ-І іВІЛ-ІІ.

ВІЛ-1 має округлу форму, його розміри – 100-120 нм (рис. 94). Геном скла- даєтьсяздвохідентичних„плюс”-нитокРНК, асоційованихзревертазоютавнутрішніми білками. У геномі міститься 9 генів (3 структурних: gag, pol, env, і 6 неструктурних: tat, rev, vif, nef, vpr, vpu, якікодують внутрішнібілкивірусу, ревертазу, ендонуклеазу, протеазу і специфічні білки зовнішньої оболонки). Серцевина віріона оточена білками капсиду й набуває конусоподібної форми. З нею асоційовані білки р7, р9, р24. Вона відділена від зовнішньої оболонки ще одним шаром білків– матриксним(р17). Назовнішнійліпіднійоболонцірозміщені глікопротеїнові шипики, які складаються з двох субодиниць глікопротеїду (gp 41 i gp 120). У сукупності їх позначають як gp 160. У зв’язку з особливостями структури генома, ВІЛ має значну антигенну мінливість.

При нагріванні до 56 °Спротягом 30 хввірус інактивується. Він чутливий до дії спирту, ефіру, ацетону, іонізуючого й ультрафіолетового випромінювання.

ВІЛ-2 за своєю будовою принципово не відрізняється від ВІЛ-1, однак має певні відмінності в складі геному, білків тощо.

Діагностика СНІДу – складна і відповідальна. Вона ґрунтується на основних

вається в спеціалізованих лабораторіях з діагностики СНІДу, які розгортаються набазахсанепідстанцій, станційпереливаннякрові, поліклінік, диспансерів, інфекційних лікарень тощо.

Основним матеріалом для дослідження є кров. Її забирають із ліктьової вени в об’ємі 5 мл. Отриману пізніше сироватку можна зберігати при температурі 4 °С протягом 7 днів. Запропоновано також використання способу “сухої краплини”. Він полягає в тому, що за допомогою стерильної голки проколюють палець і декілька крапель крові наносять на стерильний диск, виготовлений з фільтрувального паперу. Висушені диски можуть зберігатись тривалий час (до 6 місяців) у поліетиленових пакетах. У разі потреби за допомогою фосфатного сольового розчину імуноглобуліни переводять у рідкий стан і досліджують.

Доведено, що антитіла проти ВІЛ можна виявити в сльозах, слині, грудному молоці (IgA), спинномозковій рідині (в осіб з енцефалопатіями або неврологічною симптоматикою), навіть у сечі. Допустимим вважається дослідження на наявність антитіл рідини склоподібного тіла в трупів.

ІФА(восновному, непрямий) дозволяєвизначити антитіла убудь-якому дослідженому матеріалі. Він є достатньо чутливим методом, що використовується у будь-яких лабораторіях світу. Антигени для цих тест-систем одержують або із заражених тканинних культур, або за допомогою рекомбінантних ДНК. В Україні використовують тест-системи “Антиген”, “Рекомбінант-ВІЛ”, “Скрин-ВІЛ”, “Комбі-ВІЛ”, фірми “Аbbott” та інші.

Слід відзначити, що антитіла у крові з’являються не зразу після попадання ВІЛ в організм, а не менш, ніж через 2-3 місяці, а деколи й довше (5-8 міс.), тому слід пам’ятати, що ІФА є малопридатною для діагностики вірусоносійства саме в серонегативний період. Одноразовий позитивний результат виявлення антитіл в крові не дає можливості підтвердити діагноз набутого імунодефіциту. Цю реакцію рекомендують повторити тричі. Діагностичними вважаються два позитивних результати в трьох повторах. Така схема постановки реакцій зумовлюється тим, щосучаснітест-системивсежтакиможутьдаватиякпсевдопозитивні, такіпсевдонегативні результати.

Зразки крові, які далидва позитивних результатизтрьохповторів, направляють у спеціалізовані лабораторії при науково-дослідних інститутах для підтвердження наявності ВІЛ-вірусоносійства за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу – вестернблоту або імуноблоту (від англ. blott – пляма), реакції непрямої імунофлуоресценціїї або радіоімунної преципітації. Ці методи дозволяють виявити антитіла до певних вірусних білків.

Метод вестернблоту передбачає попереднє електрофоретичне розділення вірусних білків у поліакриламідному гелізнаступним переносом їхнаспеціальні нітроцелюльозні мембрани. Після цього на фільтрах розганяються досліджувані зразки крові з подальшою ідентифікацією їх білків (антитіла проти певних структурних вірусних білків) за допомогою антивидових мічених сироваток. На нітроцелюльозних фільтрах з’являються кольорові смуги, що відповідають комплексам, утвореним вірусними структурними білками та антитілами сироватки віру-

соносія. Пропозитивнийрезультатреакціїможесвідчитинаявністьантитілпроти вірусних білків р24, p31, gp41, gp120/160.

При негативних результатах на фільтрах не видно характерних зон забарвлення.

Одним із ефективних способів визначення наявності антитіл проти ВІЛ у сироватці крові людини є використання реакції мікроаглютинації. Вона подібна до реакції непрямої гемаглютинації, однак замість еритроцитів, сенсибілізованих відповідним антигеном, тут використовують як основу частинки желатину або латексу. Увипадкупозитивногорезультатуспостерігаютьзапоявоюспецифічного осадувлункахпланшет. ДанареакціядаєподібнірезультатидоІФА, протезначно простішазаметодикоюпостановки, швидшевиконується, даєменшепсевдопозитивнихрезультатів.

Іншим методом виявлення антитіл проти ВІЛ є реакція непрямої імунофлуоресценції. Для постановки цієї реакції використовують антиген, який одержують з перещеплюваних ліній лімфоцитів, заражених вірусами імунодефіциту. З них готуютьпрепаратифіксованихклітин, якіможназберігатипротягом2 місяцівпри температурі -20 °С. У разі необхідності скельця з нанесеним антигеном обробляютьрозведенимидосліджуванимисироватками(1:10, 1:100, 1:1000 тощо), апотім люмінесцентною антисироваткою проти імуноглобулінів людини. Препарати додатково контрастують синькою Еванса і вивчають у люмінесцентному мікроскопі.

Більш чутливим є метод радіоімунопреципітації. Як і при будь-якій імунологічній реакції в його основі лежить взаємодія антигенів ВІЛ з антитілами проти них. У цій реакції як антигени використовують білки ВІЛ, мічені радіоактивними ізотопами 125I або 35S.

Реакціюпроводятьурідкійфазі, змішуючигомологічніантигени(віруснібілки gp120, gp41, p24, p17, p9 та інші) й антитіла (сироватка вірусоносія), внаслідок чогоутворюютьсяімуннікомплекси. Вонивзаємодіютьізспеціальноюсистемою, якаскладаєтьсязбілка АS. аureus, з’єднаногоізсефарозою, внаслідокчоговідбуваєтьсяпреципітація. Утворенийкомплексзадопомогоюультрацентрифугування осаджуютьупробірках, видаляютьнадосадовурідину, залишаючитількисубстрат антиген-антитіло-білок А-сефароза. На наступному етапі дослідження викликають дисоціацію комплексів додецилсульфатом натрію, піддають їх електрофорезу в поліакриламідному гелі і за допомогою авторадіографії визначають молекулярну масу мічених ізотопами білків. Це дозволяє встановити, які саме вірусні білки знаходяться в імунних комплексах, отже, до яких вірусних білків утворюються антитіла. Цей метод є чутливішим, ніж імуноблот, проте вимагає спеціального обладнання, тому не використовується широко в лабораторній практиці.

Підсумовуючи вищевикладене, можна таким чином підійти до підтвердження діагнозу ВІЛ-носійства. Одноразовий негативний результат на наявність антитіл, одержаний за допомогою ІФА, дозволяє зробити висновок про відсутність ВІЛ-інфікування. Двапозитивнихрезультатизтрьохповторнихдослідженьсироватокнедаютьзмогивстановитидіагнозвірусоносійства. Цеможназробититільки післяодержанняпозитивнихрезультатівпронаявністьантитілпротипевнихвірус-

них структурних білків за допомогою імуноблотингу або інших методів, що його замінюють.

Вірусологічна діагностика. Матеріалом для дослідження може бути кров, спинномозкова рідина, грудне молоко, сперма, біоптати при автопсії тощо. Для виявлення вірусу використовують електронну мікроскопію, зараження культур Т-лімфоцитів(CD4-клітини). Дляідентифікаціївірусівможливевикористаннявисокочутливих тест-систем ІФА, реакції непрямої імунофлуоресценції, характерної цитопатичної дії тощо.

ВажливимдлядіагностикиСНІДуєвизначенняпровірусувлімфоцитах, або вірусних нуклеїнових кислот у патологічному матеріалі. З цією метою широко використовують методи молекулярної гібридизації. Використання цього методу набуває важливого значення особливо через те, що серонегативний період при СНІДіможетриватидекількамісяців. Високачутливістьзапропонованогометоду дозволяє виявити навіть поодинокі вірусні частинки в крові (0,1-1,0 нг нуклеїнових кислот). Принцип його полягає в тому, що в умовах in vitro викликається процесгібридизаціїміжвірусноюнуклеїновоюкислотою(ДНК, РНК) таспеціальним зондом, який мічений радіоактивним фосфором 32Р. Утворений комплекс достатньо легко можна ідентифікувати за допомогою авторадіографії. Однак використання 32Р-зондів у певній мірі ускладнює цей метод, оскільки вони мають короткий (2 тижні) період напіврозпаду, вимагають дотримання суворих правил техніки безпеки при роботі з радіоактивними ізотопами тощо. Враховуючи це, перспективним напрямком є використання зондів, які можна виявити за допомогоюкольоровихферментативнихреакцій. Такоюміткоюєбіотин(біотиновийзонд).

Існують різноманітні варіанти молекулярної гібридизації, серед яких найчастіше застосовуються точкова гібридизація, блот-гібридизація, сандвіч-гібриди- зація, гібридизація in situ (в заражених тканинах).

Однимзваріантівмолекулярноїгібридизаціїрозглядаєтьсяполімеразно-лан- цюговареакція, восновіякоїлежитьампліфікаціягенів. ВикористанняДНК-полі- мерази, наприклад, з Thermophylus aquaticus дозволяє за кілька циклів ампліфікації значно збільшити кількість досліджуваних нуклеїнових кислот, внаслідок чогоїхможнавиявитибудь-якимивідомимиметодами– ІФА, електрофорезуполіакриламідному гелі тощо. Ця реакція суттєво перевищує чутливість попереднього методу (на декілька порядків), тому може бути використана при дослідженні мікрооб’ємів матеріалу або таких тест-об’єктів, де іншими методами віруси імунодефіциту не виявляються, наприклад, змиви з носоглотки, слина.

Крім описаних методів діагностики, допустимим визнається виявлення антигенемії, яка зумовлена білком р24. Цей р24-антиген можна визначити за допомогою модифікованих методів ІФА.

Одержання позитивного результату при застосуванні одного знаведених методів є достатнім аргументом для встановлення етіологічного діагнозу ВІЛінфекції.

Вірусологічна діагностика СНІДу – достатньо складний процес, доступний для виконання тільки у високоспеціалізованих лабораторіях, де створюються всі

необхідніумовидляроботи(захистперсоналувідзараженняпідчаскультивування, очищення та концентрування ВІЛ) і є висококваліфіковані фахівці.

Таким чином, при наявності ВІЛ-інфекції у вірусоносіїв або хворих на СНІД можна виявити такі вірусспецифічні маркери: антитіла до ВІЛ, безпосередньо інфекційний вірус, провірус у ДНК уражених імуноцитів, вірусний антиген у сироватці крові та інфікованих клітинах-мішенях.

Розділ 14

ШПИТАЛЬНІ ІНФЕКЦІЇ

Захворювання мікробної етіології, що виникають у госпіталізованих хворих під час перебування їх у стаціонарах або у медичних працівників під час роботи в них, називаються нозокоміальними або внутрішньолікарняними (шпитальни-

ми) інфекціями.

Зустрічаються вони в усіх країнах світу і є серйозною проблемою для ліку- вально-профілактичних закладів охорони здоров'я. Вони, як правило, приєднуються до основного захворювання або вперше виникають у новонароджених

Розрізняють такі основні групи нозокоміальних інфекцій: бактеріємії й септицемії, гнійно-запальні ускладнення ран і опіків, гострі кишкові, респіраторні, урогенітальні, посттрансфузійні інфекції та захворювання, обумовлені довготривалим лікуванням антибіотиками.

Збудниками цих захворюваньможутьбути найрізноманітніші видибактерій, вірусів, грибів і найпростіших. Однак провідна роль належить представникам кокової групи, бактероїдам, клостридіям та численним грамнегатавним паличкам Питома вага грамнегативних бактерій у виникненні шпитальних інфекцій з року в рік зростає.

Мікробіологічнадіагностикавнутрішньолікарнянихінфекціймаєсвоїособливості і труднощі Узв'язку з великою різноманітністю збудників потрібно застосовувати різні методи дослідження При бактеріологічній діагностиці гнійно-за- пальних захворювань часто виділяють мікробні асоціації (стафілококи і грамнегативні бактерії, декілька видів ентеробактерій тощо) Коли ж виділяють умовно-патогенні мікроорганізми, важливо визначати їх кількість у досліджуваномуматеріалі. Критичнаконцентраціяскладає105-106 клітинв1 мл. Алекількість мікробів у досліджуваному матеріалі може дуже різнитися. Тому важливо проводити і видову ідентифікацію бактерій та визначати їх потенційні патогенні властивості. Необхідно також ставити відповідні серологічні реакції для виявлення специфічних антигенівукровіхворого, визначатиантитіла(особливонаростання їх титру) до автоштамів, і тим самим обгрунтовано підтверджувати діагноз.

Нижче наведені основні методичні прийоми мікробіологічної діагностики окремих госпітальних інфекцій, які найчастіше зустрічаються в лікарняних закладах.

Бактеріємії й септицемії, як одні з тяжких форм назокоміальних інфекцій, можутьспричинитипрактичномайжевсівидипатогеннихмікроорганізмів. Грампозитивні бактеріємії найчастіше викликають золотисті й епідермальні стафілококитастрептококи, аграмнегативнібактеріємії– ешерихії, клебсієли, псевдомонади, протей, серації, нейсерії. Збудниками септицемій найчастіше є бактероїди та клостридії.

Точний діагноз цих форм нозокоміальних інфекцій можна встановити лише після виділення гемокультури. Для проведення мікробіологічного аналізу беруть лишевенознукров(поможливостідоприйомуабочерез12-24 годпісляостаннього прийомуантибактеріальнихпрепаратів). Прицьомунеобхіднодотримуватись, жорстких правил асептики В місці венепункції шкіру обробляють 70 % спиртом, потім однимізантисептиків(йодоформ, хлоргексидин) ізновуспиртом. Обробленаповерхня повинна висохнути і лише через 1-2 хв беруть 10-20 мл крові (у дітей 3-5 мл).

Посіви проводять у 2 флакони (по 5-10 мл) із збагаченими живильними середовищами у співвідношенні 1:10 і швидко надсилають до лабораторії, не допускаючизаморожуванняОдинфлаконінкубуютьузвичайнихаеробнихумовах, другий – заливають вазеліновим маслом, щоб забезпечити ріст анаеробів Для виділення аеробних бактерій використовують “подвійне середовище” (скошений агар і цукровий бульйон у одному флаконі: посів крові проводять у бульйон і при інкубації періодично зрошують ним скошену частину агару, на якому потім виростають ізольовані колонії). Для анаеробних бактерій використовують тіогліколевий бульйон та середовище Кітта-Тароцці, для грибів – рідке середовище Сабуро.

Мікроскопічне дослідження крові, зазвичай, не проводять, оскільки виявити бактерії у мазках вдається дуже рідко.

Засіянісередовищауфлаконахвитримуютьутермостатіпри37 °Свпродовж 7 днів, контролюючи наявність росту макро- і мікроскопічно кожного дня, роблять висіви на відповідні щільні середовища з метою виділення та ідентифікації чистих культур, вивчення їх біологічних властивостей і чутливості до антибіотиків. При відсутності росту протягом тижня проводять повторне дослідження на 14-ийдень. Якщоростунемаєпротягомдвохтижнів, результатвважаютьнегативним. При виділенні бактероїдів дослідження може тривати три і більше тижнів.

Для підвищення частоти виявлення бактерій рекомендують брати кров для виділення гемокультури тричі впродовж доби.

Захворювання дихальних шляхів (риніти, фарингіти, бронхіти, пневмонії, абсцеси і гангрени легень та ін.) викликають паличка інфлуенци, пневмококи, мікоплазми, пневмоцисти, а також орто- і параміксовіруси, рино- і коронавіруси, адено- іреспіраторно-синцитіальнівіруси. Внутрішньолікарняніінфекціїдихальних шляхів (особливо пневмонії) домінують серед всіх інших захворювань.

Основним матеріалом для дослідження є мазки з носа, рото- і носоглотки, харкотиння та промивні води бронхів. Порівняно рідко досліджують біоптати ле-