Практична мікробіологія - Климнюк С. І. - 2004

розеольозно-папульозним висипом і відносно доброякісним перебігом. Людина заражається від гризунів аліментарним шляхом, або хвороба передається блохами, значно рідше кліщами.

Збудник – Rickettsia typhi – за своїми розмірами, морфологією і антигенними властивостями дуже подібний до рикетсій Провачка. R. typhi добре розмножується в жовтковому мішку курячих ембріонів, викликаючи їх загибель через 6-8 діб після зараження, патогенна для гвінейських свинок і білих мишей. Зараження останніх через ніс викликає смертельну пневмонію з нагромадженням великої кількості збудника в легеневій тканині, що легко виявити за допомогою бактеріоскопії.

Узв’язкузтим, щоклінічнакартина щурячоговисипноготифудужеподібна до легких форм епідемічного вошивого тифу, основне значення в лабораторній діагностиці й диференціації обох нозологічних форм мають серологічні реакції.

Серологічна діагностика. Надійне розмежування ендемічного й епідемічного висипного тифів найчастіше проводять за допомогою реакцій аглютинації, зв’язування комплементу, непрямої гемаглютинації та імуноферментного аналізу. Кожну з цих серологічних реакцій проводять паралельно з антигенами рикетсій щурячоготифуірикетсійПровачека. Увипадкуендемічноговисипноготифудіагностичний титр сироватки хворого буде у 3-4 рази більшим із R. typhi, ніж із рикетсіями Провачека, і навпаки. Якщо різниця між титрами антитіл у реакціях із рикетсіями Провачека і рикетсіями ендемічного тифу незначна, проводять біологічне дослідження.

Біологічна проба. Гвінейських свинок-самців заражують внутрішньоочеревинно кров’ю хворого. Поява у тварин гарячки і рикетсіозного періорхіту (скротального феномену) безумовнопідтверджуєдіагнозендемічноговисипноготифу, особливо якщо в зскрібках з оболонок уражених яєчок мікроскопічно виявляють велику кількість рикетсій.

Ку-гарячка

Ку-гарячка(пневморикетсіоз) – гостраприродно-вогнищевазоонознаінфекцій- на хвороба, що характеризується гарячкою, поліморфною клінічною картиною і частимзапаленнямлегень. Відіншихрикетсіозіввідрізняєтьсявідсутністювисипу.

Збудник – Coxiella burnetii – строгий внутрішньоклітинний паразит, добре розмножуєтьсявжовтковомумішкукурячогоембріонаівкультурахфібробластів курки, мишачих клітин L та ін. Серед лабораторних тварин найбільш чутливі до рикетсій Бернета гвінейські свинки.

Людизаражуютьсявідвеликоїімалоїрогатоїхудоби, смугастихщурів, інших гризунів і птахів різними способами: водним, аерогенним, аліментарним (молоко і м’ясо), значно рідше через укуси кліщів.

КлінічнадіагностикаКу-гарячкиутруднюєтьсярізноманітністюпроявівхво- роби, тому лабораторні дослідження особливо перших випадків мають вирішальне значення.

Матеріалом для дослідження служить кров, харкотиння, сеча, спинномозкова рідина. Для виділення збудника проводять внутрішньоочеревинне зараження гвінейських свинок, білих мишей або курячих ембріонів чи культур клітин. Рикетсії Бернета потім виявляють мікроскопічним методом при забарвленні мазків за Романовським-Гімзою або за Здродовським. Для їх ідентифікації використовують специфічні сироватки. Виділення збудника забезпечує найбільш точну діагностику Ку-гарячки. Для виявлення рикетсій Бернета в організмі людей, тварин та інших біологічних об’єктах останнім часом створені діагностичні тест-систе- ми на основі імуноферментного аналізу.

Серологічна діагностика зводиться до постановки реакцій зв’язування комплементу, аглютинації й непрямої гемаглютинації. Найчастіше використовують РЗК. Комплементзв’язуючіантитілапоявляються вкрові вженаприкінці першого тижня хвороби, досягають найвищої концентрації через 3-4 тижні. Діагностичним титром РЗК вважають 1:8-1:16, а через місяць від початку хвороби він підіймається до 1:128-1:256 і зберігається дуже довго.

Реакція аглютинації рикетсій Бернета менш чутлива. Аглютиніни в діагностичному титрі (1:20 і вище) з’являються на10-20-йденьхвороби. Важливоставити реакцію методом парних сироваток для виявлення кратності наростання титру антитіл у динаміці.

Реакція непрямої гемаглютинації значно чутливіша від попередніх. Методикаїїпостановкитакасама, якпривисипномутифі, тількизамістьеритроцитарного діагностикуму з рикетсій Провачека використовують еритроцити з адсорбованим на їх поверхні антигеном із рикетсій Бернета.

Алергічна проба. З діагностичною метою, а також при проведенні епідеміологічних обстежень ставлять алергічну внутрішньошкірну пробу. Реакція стає позитивною вже з 3-8-го дня хвороби. Корпускулярний або розчинний алерген із рикетсій Бернета вводять внутрішньошкірно в дозі 0,1 мл на внутрішньому боці передпліччя. Припозитивномурезультатічерез24-48 годвиникаєхарактернагіперемія, набряк розміром більше 1 см із центрально розташованим щільним інфільтратом. Позитивна алергічна реакція зберігається у перехворілих протягом багатьох років.

Північноазіатськийрикетсіоз

Кліщовийвисипнийтифсибіру– гостраприродно-вогнищевазоонознаінфек- ційна хвороба, яку викликає Rickettsia sibirica. Вона характеризується гарячкою, наявністю первинного афекту, регіонарного лімфаденіту, рясного поліморфного розеольозно-папульозноговисипу. Перебігзахворюваннядоброякісний; передається воно іксодовими кліщами. Збудник містить антиген, спільний з антигеном про-

тея ОХ19.

Для лабораторної діагностики цього рикетсіозу використовують біологічні й серологічні дослідження.

Біологічна діагностика. R. sibirica патогенна для мавп, кролів, гвінейських свинок, пацюків і білих мишей. Для виділення збудника від хворого у спеціальних лабораторіях заражують внутрішньоочеревинно самців гвінейських свинок кров’ю хворих, узятою в ранній період захворювання. У заражених тварин виникає гарячка і запалення яєчок (скротальний феномен) із нагромадженням великої кількостірикетсійумезотеліїїхоболонок. Можнакультивуватизбудниказаметодом Кокса в 4-5 добових курячих ембріонах при температурі 32-34 °С або в культурах клітин. Рикетсії добре забарвлюються за методом Здродовського і, як правило, локалізуються в ядрах клітин.

Серологічна діагностика. Найчастіше ставлять реакції зв’язування комплементу та непрямої гемаглютинації. Обидві реакції проводять як з гомологічним антигеном (R. sibirica), так і з гетерологічними (R. conori, R. prowazekii, R. akari)

длядиференціаціїсибірськогорикетсіозувідмарсельськоїгарячки, висипноготифу і везикульозного рикетсіозу. Як РЗК, так і РНГА є досить чутливими і високоспецифічними реакціями, стають позитивними з 5-го дня хвороби, а після 10-го дня виявляютьсямайжев100 % випадків. ДіагностичнітитриРЗК– 1:20-1:60, РНГА –

1:200-1:3200.

Як додаткову в діагностиці захворювання можна використати реакцію Вей- ля-Фелікса з протейним діагностикумом ОХ19, яка випадає позитивною у 75-90 % хворих.

Для ранньої діагностики запропонована реакція непрямого гемолізу, яка полягаєвтім, щоеритроцитибарана, сенсибілізованірикетсіознимдіагностикумом, лізуються в присутностіспецифічної сироватки і комплементу. Ця реакція виявилась високоспецифічною і чутливішою ніж РЗК. За її допомогою антитіла в сироватці крові хворого виявляють на 4-6-й день хвороби. Реакцію непрямого гемолізу можна використати як експрес-метод діагностики, адже вона дає відповідь через 1-1,5 год від початку дослідження. Окрім того, вона відрізняється простою методикою і мінімальною затратою компонентів.

Останнім часом важливого діагностичного значення набула реакція імунофлуоресценції. Вона поєднує в собі серологічний та морфологічний методи і дозволяє швидко (протягом 1-2-хгод) виявити й ідентифікувати рикетсії, їх антигени й антитіла.

Гарячка цуцугамуші

Японськарічковахвороба(цуцугамуші) – гостраприродно-вогнищеваінфек- ція, характеризуєтьсянаявністюгарячки, первинногоафекту, лімфаденіту, рясного макуло-папульозноговисипу, ураженнямнервовоїісудинноїсистем. Заклінічною картиною подібна до висипного тифу.

Збудник – Rickettsia tsutsugamushi – мало чим відрізняються від інших рикетсійкліщовоїгрупи, поганофарбуєтьсяфуксином, оскількилегкознебарвлюється кислотою. При забарвленні за Романовським-Гімзою мають пурпурний колір і розташовуються вцитоплазмі мононуклеарних клітин. Існує5 сероваріврикетсій

нимивошами, характеризуєтьсяповторними5-денниминападамигарячки, розеольозним висипом, болями в кістках і м’язах, особливо в гомілкових.

Збудник має вигляд коротких паличок, дещо крупніших від збудника висипного тифу. На відміну від інших рикетсій R. quintana може рости на сироватковокров’яномуагарі, утворюючикруглі, напівпрозорі, слизовіколонії, якіпоявляються через 12-14 днів після посіву. Ніколи не виявляються внутрішньоклітинно. В антигенному відношенні однорідні. Спільні антигени з іншими рикетсіями і протеєм не виявлені. Гвінейські свинки і білі миші до збудника волинської гарячки нечутливі.

Для мікробіологічної діагностики захворювання використовують біологічні й серологічні дослідження.

Біологічна діагностика пароксизмального рикетсіозу грунтується на виділенні рикетсій із крові хворого шляхом зараження платтяних вошей з наступним виявленням збудника в кишечнику цих комах, забарвленням мазків за методом Романовського-Гімзи. Алетакийспосібможназдійснитилишевспеціальнооснащених лабораторіях досвідченими співробітниками. У звичайних практичних лабораторіях він не використовується. Замість цього можна посіяти досліджуваний матеріалнаживильнісередовищаівиділитичистукультуру. Впершихгенераціях рикетсії ростуть повільно. Наступні субкультури виростають через 3-5 днів.

Серологічна діагностика. Більш простим і поширеним методом лабораторногодослідженняприп’ятиденнійгарячцієпостановкареакціїзв’язуваннякомплементу і непрямої гемаглютинації. РЗК ставлять із специфічним рикетсіозним антигеном. Реакція стає позитивною на 15-20-й день захворювання, діагностичні титри 1:32-1:256. Більш чутливою є реакція непрямої гемаглютинації. Широке використання цих реакцій обмежене відсутністю або слабкою якістю антигенних препаратів. Реакція аглютинації Вейля-Фелікса з усіма протейними антигенами (ОХ2, ОХ19, ОХК) дає негативні результати.

Хламідіози

Інфекційні захворювання, що викликаються хламідіями, дістали загальну назву хламідіози. До них належить трахома, орнітоз (пситакоз), респіраторний та урогенітальний хламідіоз. З кожним роком ці захворювання зустрічаються все частіше. Рід Chlamydia містить три патогенних для людини види: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniaе.

Трахома

Трахома – хронічна інфекційна хвороба очей, що характеризується запаленням кон’юнктиви й рогівки з утворенням специфічних фолікулів і наступним їх рубцюванням. Хламідії трахоми мають 15 сероварів, 4 з них викликають трахому, 8 – кон’юнктивітізвключеннями(абобленореязвключеннями), решта– запалення сечостатевих органів і венеричний лімфогранулематоз.

Зараження трахомою відбувається від хворої людини через забруднені руки, рушники, платки, посуд тощо. Бленорея новонароджених із включеннями передається дитині під час пологів від матері, у якоїC. trachomatis зберігається в слизовій сечостатевих органів.

Для лабораторної діагностики трахоми після анестезії ока ватним тампоном видаляютьслизігній, тупимкінцемскальпелязіскрібуютьепітелійкон’юнктиви. Основні стандартні методи діагностики такі: мікроскопічний (виявлення тілець Провачека-Хальберштедтера в уражених клітинах), флуоресцентний (виявлення антигенів хламідій за допомогою РІФ), бактеріологічний (виділення збудника зараженням курячих ембріонів або культур клітин), серологічний (визначення специфічних антитіл у сироватці крові). Останнім часом створені й успішно використовуються тест-системи для проведення полімеразної ланцюгової реакції з метою виявлення збудника.

Бактеріоскопічне дослідження. Зскрібки (не мазки!) із кон’юнктиви наносять на предметні скельця, фіксують рідкими фіксаторами, забарвлюють за Рома- новським-Гімзою протягом 3-4-х год і мікроскопують. В епітеліальних клітинах видно кокоподібні включення розміром до 10 мкм. Можна досліджувати й нативні препаратипідфазово-контрастнимчианоптральниммікроскопом. Щекращевикористатиметодпрямоїабонепрямоїімунофлуоресценції. Дляцьогомазкиіззскрібок фіксуютьухолодномуацетоніпротягом15 хв, обробляютьфлуоресцентнимиантитілами й досліджують під люмінесцентним мікроскопом. При наявності хламідій трахоми видно острівці специфічного світіння в цитоплазмі клітин.

Бактеріологічне дослідження. Культивування збудника трахоми є золотим стандартом лабораторної діагностики захворювання в більшості країн світу. Для виділення хламідій досліджуваним матеріалом заражують курячі ембріони або культури клітин L-929, McCoy, Hela. При інфікуванні культур клітин використовуютьспосіб“примусовоїадсорбції” шляхомнизькошвидкісногоцентрифугування матеріалувпробіркахзмоношарамикультурклітин. Матеріалпопередньообробляютьгентаміцином, стрептоміциноміканаміцином. Зараженіембріониабокультури клітин інкубують 5-6 днів при 35-36 °С. Розвиток хламідій виявляють за допомогою фазово-контрастної мікроскопії або імунофлуоресценції, ставлять пробу на глікоген та ідентифікують в РЗК. Диференціацію різних видів хламідій проводять за спеціальними тестами (табл. 66).

Бактеріологічний метод діагностики трахоми досить трудомісткий, дорогий і вимагає підготовки кваліфікованих спеціалістів. Він можливий лише в спеціалізованих лабораторіях.

Більші можливості дає застосування імуноферментного аналізу. За його допомогою виявляють ліпополісахаридні антигени хламідій, які взаємодіють із специфічними моноклональними антитілами. Чутливість методу – 90 %.

Ще більшу ефективність при діагностиці трахоми, як і інших хламідіозів, дає використання полімеразної ланцюгової реакції. Цей метод дає позитивні результати в 90-100 % випадків, в той час як культуральні дослідження – в 60-80 %, а пряма імунофлуоресценція – в 55-75 %.

Серологічна діагностика. Імуноферментний аналіз є високоспецифічним і доступним методом серологічної діагностики трахоми. При наявності специфічниххламідійнихантигенів, адсорбованихнаповерхнілунокполістироловихпланшет, ІФА можна використовувати в будь-якій мікробіологічній лабораторії.

Реакція непрямої гемаглютинації також має високу чутливість. Вона проста за технікою постановки, але еритроцитарний хламідійний діагностикум може реагувати і з антитілами проти рикетсій Провачека. Притяжкій і середньої тяжкості формах захворювання РНГА випадає у високих титрах.

Реакція зв’язування комплементу практично майже не використовується, оскільки часто дає псевдопозитивні результати.

Орнітоз

Орнітоз (пситакоз) – гостра інфекційна хвороба птахів, тварин і людей, що спричиняється Chlamydia psittaci, характеризується розвитком пневмонії, грипоаботифоподібноїгарячки, м’язовогоболю, рідшекороподібноговисипу. Зараження людини відбувається при вдиханні висушеного посліду, пуху від птахів, а також при розробці туш.

Мікробіологічна діагностика зводиться до виділення збудника з крові або харкотиння (1-й тиждень хвороби), виявлення наростання титру антитіл (2-4-й тиждень), постановки алергічної проби.

Бактеріологічне дослідження. Для виявлення хламідій у хворого беруть 8- 10 мл крові в перші 2 тижні захворювання. З харкотиння збудника можна виділити до 25-го дня. Нативною кров’ю без попередньої її обробки заражають курячі ембріонивхоріоналантоїснуоболонку, порожнинуалантоїсуабожовтковиймішок. Харкотиння перед введенням в ембріон обробляють антибіотиками. Заражені ембріони інкубують у термостаті при 35-36 °С протягом 3-4-х діб. У мазках-відбит- кахзалантоїсноїоболонкиабовалантоїснійрідинівиявляютьелементарнітільця післязабарвленняакридиноморанжевимабозаРомановським-Гімзою. Примікро-

скопуванні у цитоплазмі клітин видно спеціальні включення, які мають яскравозеленесвітіння. Азур-еозинзабарвлюємолодіхламідіїучервоно-фіолетовийколір, а зрілі форми – у синьо-фіолетовий.

Досліджуваним матеріалом заражують також культури епітеліальних клітин первинних або перещеплюваних ліній різного походження: L-929, Hela, HЕp-2, курячі фібробласти. Після культивування протягом 48 год у цитоплазмі клітин виявляють специфічні включення за вище описаними способами. Найкращим із них є метод ідентифікації за допомогою прямої імунофлуоресценції.

Біологічне дослідження. Для виявлення хламідій орнітозу використовують біологічний метод – досліджуваним матеріалом заражають інтрацеребрально, інтраназально або в черевну порожнину білих мишей-сисунків. Через 3-5 днів вонигинутьвідпневмонії. Примікроскопічномудослідженнімазків-відбитківви- являють мікроколонії хламідій в цитоплазмі мононуклеарних клітин.

Серологічнедослідження. Основнимметодомсерологічноїдіагностикихвороби є постановка реакції зв’язування комплементу, гальмування гемаглютинації таІФАзістандартниморнітознимдіагностикумом. Комплементзв’язуючітайінші антитіла з’являються в крові хворих через 5-8 днів у невеликій кількості, потім їх титр наростає. Тому серологічні реакції краще ставити методом парних сироваток. Діагноз підтверджується при наростанні титру антитіл у 4 рази і більше. Хороші результати дає також реакція непрямої імунофлуоресценції.

Алергічна проба з орнітином (інактивована алантоїсна культура C. psittaci) ставитьсяякдляранньої(2-9-йденьхвороби), такіретроспективної діагностики. Облік реакції проводять через 24-48 год. Гіперемію та інфільтрат діаметром до 1 см розцінюють як слабопозитивну реакцію, до 2 см – позитивну, більше 2 см – різко позитивну. Висока специфічність алергічної проби залежить від ступеня специфічності алергену, оскільки можуть бути перехресні реакції за рахунок групових хламідійних антигенів.

Респіраторний хламідіоз

Хламідійна пневмонія – інфекційна хвороба, яка характеризується запаленням легень, катаром верхніх дихальних шляхів, загальною інтоксикацією. Збудник – Chlamydia pneumoniae. Від інших хламідій вона відрізняється грушоподібною формою елементарних тілець. Джерело інфекції – хворі люди. Збудник виділяється з носоглотки, механізм зараження – повітряно-крапельний.

У зв’язку з тим, щоC. pneumoniae погано розмножується в курячих ембріонах і культурах клітин, методи бактеріологічної діагностики не використовуються. Практичні лабораторії не мають реагентів і для серологічної діагностики респіраторного хламідіозу. Для виявлення та ідентифікації хламідій пневмонії в досліджуваному матеріалі використовують лише реакцію імунофлуоресценції із застосуванням моноклональних антитіл до високоспецифічного антигена збудника.

Сечостатевий хламідіоз

Патогенні хламідії, особливо C. trachomatis, досить часто викликають гострі або хронічні запалення уретри, вагіни, шийки матки. Урогенітальний хламідіоз впродовж останнього десятиріччя зустрічається частіше, ніж сифіліс і гонорея. Основний шлях передачі захворювань – статевий, значно рідше – побутовий.

Матеріалом для лабораторного дослідження служать зскрібки зі слизової уретри у чоловіків і жінок та зскрібки із шийки матки у жінок. Український НДІ дерматології та венерології розробив уніфіковані методи діагностики сечостатевих хламідіозів. Серед них важливе значення мають експрес-методи, виявлення морфологічних структур та антигенів хламідій у досліджуваному матеріалі, виділення хламідій в культурах клітин, виявлення хламідійних антитіл за допомогою серологічних реакцій та полімеразна ланцюгова реакція.

Експрес-методи. Ряд фірм США та Франції розробили спеціальні діагностичні тести для проведення імунохроматографічних експрес-методів, які можуть видати результат через 10-30 хв. Однак їх чутливість і специфічність значно менша, ніж при проведенні повномасштабних досліджень.

Мікроскопічні методи. Досліджуваний матеріал беруть у хворих, які протягом місяця не повинні приймати антибіотики. Зскрібки роблять одноразовим зондом (щіточкою, ложечкою Фолькмана, жолобкуватим зондом). Інфекційний матеріал наносять на поверхню 8 мм ямки спеціального предметного скла. Мазок висушують 20-30 хв і фіксують у холодному ацетоні протягом 5-10 хв, забарвлюють за методом Романовського-Гімзи 35-40 хв, обробляють підкисленим етанолом (3-5 крапель льодяної оцтової кислоти на 15-20 мл спирту) протягом 5- 10 с, промивають водою, висушують і мікроскопують. Ретикулярні тільця забарвлюються в синьо-фіолетовий колір, а елементарні тільця – в рожево-червоний. Зернисті структури хламідій розміщуються поблизу ядра. Виявлення 5-10 типових включень має діагностичне значення.

Антигени хламідій в інфекційному матеріалі виявляють за допомогою прямоїінепрямоїреакціїімунофлуоресценції. Сутьпрямогометодуполягаєуз’єднанні мічених флуорохромом антитіл із хламідійним антигеном і виявленні специфічного світіння при люмінесцентній мікроскопії. Люмінесцентна антихламідійна сироватка виготовляється в Харкові. Є багато закордонних діагностичних систем для проведення цього методу.

Суть непрямого методу полягає у з’єднанні комплексу антиген + немічені хламідійні антитіла з видовою (антиглобуліновою) міченою флуоресцеїном сироваткою.

Окрім мікроскопічних методів, антигени хламідій в інфекційному матеріалі можна виявити за допомогою імуноферментного аналізу. Принцип методу полягає у взаємодії моноклональних хламідійних антитіл, адсорбованих на твердій фазі, з антигеном хламідій, що знаходиться у досліджуваному матеріалі, й утворенніімунних комплексів. Матеріалом дляаналізу можутьбутизскрібкизіслизових оболонок, центрифугати сечі, секрети, біоптати тощо.