Новотный и Хехт, Основы нанооптики

Рис 4.12 Отклонение функции Эйри от функции Гаусса. для зашумленнои информаuии

отклонения пренебрежимо малы

Мы ограничимся рассмотрением частного случая аппроксимации двумерного raycco- ва распределения методом наименьших квадратов. Двумерное raYCCOBO распреде.1е­

ние очень хорошо описывает распределения интенсивности получаемых в оптической

микроскопии изображений субволновых излучающих объектов. И хотя функция Эйри является еще более приближенной к реальности моделью, все-таки по причине

не очень хорошего качества сигнала значительных систематических отклонений

одного метода от другого не возникнет. Однако в отдельных случаях, в зависимости

от характера задачи, приходится все-таки использовать более сложные моде.1И

Например, сложные распределения, возникающие в конфокальной микроскопии при

облучении образца пучком с кольцевым профилем интенсивности или еще бо.lее высокими модами. Разумеется, для аппроксимации надо использовать более слож­

ные модели [21]. Предлагаемый анализ может быть модифицирован применительно

к этим случаям.

Для двумерного raYCCOBa распределения интенсивности

(454)

необходимо определить пять параметров, таких как пространственные координаты

максимумов ХО и УО (т. е. положение пятен), амплитуду А, ширину ') и уровень

фонового излучения В. В некоторых случаях ширину функции рассеяния точки -

можно считать известной из независимых измерений. Это сокращает число подгоноч­

ных параметров и увеличивает точность оставшихся параметров примерно на 1ОУ! •

как будет показано ниже. Как правило, экспериментальные данные представляют

собой конечный набор точек (X 1 , Yi), например соответствующие пикселам сеD-чипа или координатам отсканированного изображения. Каждой точке (;l~" 1/1) ставится в соответствие уровень сигнала D(i, j) и значение ошибки, например в рамках

пуассоновой статистики фотоотсчетов.

Сумма квадратов отклонений полученных данных от модели, ,,:2, по всем точ­

кам (z, j) имеет вид

(455)

где N - число точек в направлении осей Х и у. Здесь С;.З - значения, получаемые

из модели в точке (Xi, Yi), lja;'J - весовой фактор, указывающий на то, что точки.

обладающие большей точностью, являются для нас более важными. Набор пара­

метров, минимизирующий х2, обозначим [XO.min, УО,щiп, I'miп, Alllill , Blllill ]. Очевидно;

что неопределенность по каждому параметру зависит от характера поведения \-

Рис 4 13 Две гауссовы кривые, сдвинутые на небольшую величину Очевидно. что основнои

вклад в разницу между кривыми (эта величина закрашена серым цветом) вносит отрезок.

имеющий самый большой наклон. Это отражено в (458)

4.5.2. Оценка ошибки подгоночных параметров. По мере роста .1. статисти­

ческая достоверность набора параметров снижается. Можно установить соответствие

между величиной .1. и статистической достоверностью, связанной с подгоночными

параметрами [22, 23]. Если установлена величина .1. для заданного в процессе под­

гонки доверительного уровня, можно, используя (4.58), найти ошибки подгоночных

параметров.

Нормированное распределение функции плотности вероятности для .1. в случае

набора из v подгоночных параметров задается в виде (см., например, [22]. Приложе­ ние В-4)

(4.59)

Если мы проинтегрируем Р(.1.2, У) от .1.а до бесконечности, то получим значение

интеграла, равное 0,317:

.:l.

и тогда вероятность 1 - 0,317 = 0,683 является вероятностью того. что параметры лежат внутри области параметров, для которой величина .1. не превосходит ~" и

которая соответствует доверительному уровню 10-. Величина .1." растет с ЧИСЛО~I

свободных параметров У, однако обычно существует корреляция между различными

параметрами. В табл. 4.1 показаны относительные величины .1." для различных набо­

ров параметров, число которых изменяется вплоть до семи, а доверительный уровень

соответствует 68,3 %. Другие значения могут быть подсчитаны с помощью (459)

и (4.60).

Например, для того чтобы оценить ошибку координаты 3:0, предположим, что все параметры, кроме этого. имеют оптимальные значения В таком случае в (458) все

Здесь мы ввели безразмерный параметр t = L/(2"Y), описывающий ширину об­

- так называемая функция ошибок. Из наших определений следует, что О ~ .%' ~ t

Теперь у нас есть все необходимое, для того чтобы получить определенные значение

ошибки в точке максимума ах/"У для данной экспериментальной ситуации (см зада­

чу 4.6). Очевидно, что сходный подход может быть применен для вычисления ошибок по другим параметрам, таким как ширина пятна (см. задачу 4.7). Для иллюстрации

зависимости нормированной ошибки от величины ar./"Y для различных параметров

мы построили графики зависимости аг. от количества ячеек, амплитуды сигнала,

На рис. 4.14, а-в мы видим, что может быть достигнута точность позиционирования

вплоть до нескольких нанометров за счет увеличения числа ячеек, увеличения сиг­

нала и понижения фоновых шумов. С другой стороны, увеличение размера области,

в которой происходит аппроксимация, для t ~ 2,5 уменьшает точность линейно, что

соответствует моменту, когда кривая F(t, 1,6) насыщается (см. рис. 4.14, г), если при этом число ячеек N не увеличивается. На ошибку также влияет число независи~IЫХ

параметров. Оценочно можно сказать, что увеличение числа параметров на единиц)

понижает точность всех параметров примерно на 10%.

И, наконец, сравним полученные нами прогнозы с результатами, имеющимися в литературе и связанными сотслеживанием перемещения отдельных флуоресцент­

ных молекул. Первый эксперимент связан с отслеживанием молекул липидов, флу­

оресцентно маркированных и находящихся в липидной двухслойной мембране [181

Смысл этого эксперимента в том, чтобы отследить быструю диффузию молеку., липидов. В эксперименте используется микроскоп с числовой апертурой 1,3 в со­ четании с чувствительной ССD-камерой, способной записывать последовательности изображения со скоростью 140 изображений/с. Краткость результирующего време­

ни усреднения и определяет ошибку позиционирования молекул. На рис 4 15, Q

показана серия фотоизображений, со временем экспозиции 5 мкс, С интерваЛО~1 в 35 мкс на площадке липидного бислоя размером 5,4 х 5,4 мкм, на которой нахо­

дятся маркированные молекулы липидов. На фотографии им отвечают отчетливые

~(j

со значениями стандартных вложенных отклонений. Такая точность в семь раз ниже дифракционного предела экспериментальной установки. Броуновское движение

отдельных липидов в липидной двуслойной мембране может быть исследовано путем

анализа более чем 500 траекторий, схожих с теми, которые показаны на рис. 4.15, б.

На врезке представлена результирующая линейная зависимость средних квадратов

С~lещений от промежутков времени.

Если время наблюдения больше (~0,5) с за счет высокого разрешения преды­

дущего эксперимента и при условии, что маркер является устойчивым к светово­ ~y воздействию, возможно значительное увеличение точности позиционирования

ВП.l0ТЬ до нескольких нанометров. Условия, которые должны выполняться, чтобы

осуществить такой режим измерения, можно сформулировать исходя из анализа

рис 4.16. а, б. Число ячеек N, необходимое для отображения и аппроксимации гауссова пика, должно быть большим, например около 16 при t ~ 5. Кроме того,

довольно большой должна быть амплитуда фотоотсчетов, например около 1000, в то вре~IЯ как фон должен удерживаться малым, около 100. Все эти условия выполнены

в работе [17]. Образцы полученных изображений приведены на рис. 4.16, а. Чет­

кость графика говорит о высоком качестве полученной за время измерения (0,5 с)

информации. Используя введенные выше параметры, (4.64) и х = 1,6, получим точность позиционирования менее 3 нм. В работе [17] исследовалась длина шага

~IOJlекулярного двигателя мышечного глобулина V. Для этой цели белок был марки­

рован и проводилось наблюдение за каждой маркирующей молекулой во времени при

каждом шаге молекулярного двигателя. Отдельные шаги вплоть до ~ 25 нм длиной отчетливо различимы, как показано на рис. 4.16, б, [17]. Характер отслеживания

снимков со временем экспозиции 5 мс, выполненных с интервалом в 35 МС, на которых Bf1.1Hbl

два флуоресцентных пика индивидуально маркированных липидов, находящихся в .~ИПИ.1НО~1

бислое Размер изображения 5,4 х 5,4 мкм2. б - Траектории обеих молеКУJl получены 11O.1rOH-

кой пиков на рис (а) (Врезка) Средний квадрат смещения каждой молекулы. усре:щеННЫII

по многим траекториям. Заимствовано из [18]

на рис. 4.16, б прекрасно демонстрирует тот факт, что точность позиционирования

находится именно в том диапазоне, оценка которого приведена выше.

Кроме приложений, связанных с вопросом отслеживания движения отдельных

молекул, высокая точность позиционирования может быть необходима для ответа на вопрос такого характера: являются ли связанными между собой две молекулы, кото­ рые различимы в определенных наблюдаемых переменных. Этот вопрос чрезвычайно

!JUO

8ОО

!700

"оОО

!1j

~

§ 500

с

трехмерное изображение единичного Су3-красителя, записанное за время 0,5 с ОПlеТИ~1 высокий уровень сигнала, до 3000 фотоотсчетов, и низкий уровень фона Различная величина амплитуд пиков обусловлена неравномерной засветкой, б - Смещение маркеров, закреПJ,енных на молекулярном двигателе мышечного глобулина V, от времени Хорошо виден ступенчатый характер движения Заимствовано из [17]

ва",ен. например при выделении из связанного образца отдельных молекул или их

неБО.1ЬШОГО количества [191.

Мы показали. что возможно получение нанометровой точности в основанных на "етодах оптической визуализации измерениях, связанных с позиционированием. Точность зависит от уровня шума и может достигать нескольких нанометров даже при детектировании отдельных флуоресцентных молекул. Необходимо вновь под­

черкнуть. что этот способ получения точных данных следует отличать от методов

ПО.lучения высокого разрешения, хотя он и может быть использован для простран­ ственного различения двух отдельных излучателей. Последний основан на получении некоторой априорной информации об исследуемой молекуле, т. е. если излученные

фотоны ~IOГYT быть связаны с тем или иным объектом на основании разницы

в значениях какой-либо наблюдаемой величины, характеризующей их, например энергии фотона. Таким образом, этот этот тип «увеличения разрешения.> попадает в категорию «литростей.>, обсуждавшихся в разд. 4.2.

4.6. Принципы микроскопии ближнего поля

До настоящего времени мы предполагали, что пространственные частоты (k r , ky ),

связанные с эванесцентными волнами. теряются в процессе распространения от

источника к детектору. Потеря этих пространственных частот ведет к возникновению

дифракционного предела и, следовательно, к другому критерию. накладываемому на

пространственное разрешение, т. е. к способности различить два разделенных между собой точечных объекта. Центральной идеей оптической микроскопии ближнего поля

ЯВ.lяется сохранение пространственных частот, связанных с эванесцентными полями,

и увеличение за счет этого ширины пространственного спектра. В принципе произ­

ВО.lыюе разрешение могло быть получено, если ширина пространственного спектра

бы.lа бесконечной. Однако получена она может быть только за счет сильной связи

\lежду источником света и образцом, что недостижимо в стандартной микроскопии,

где свойства источника света (например, лазера) оказывают пренебрежимо малое

В.lияние в смысле взаимодействия свет-вещество. В этом разделе мы не будем

заНИ~lаться механизмами установления подобной связи, а просто распространим идеи конфокальной микроскопии на оптическое ближнее поле.

Оптический микроскоп ближнего поля по сути является обобщением конфокаль­ нои установки, показанной на рис. 4.8, где один и тот же объектив использовался

и Д.1Я возбуждающего поля, и для фокусировки отклика. Если мы используем две lИНЗЫ. то получим ситуацию, показанную на рис. 4.17, а. В целом для оптического

разрешения нам необходимо пространственное удержание светового потока, идущего

через плоскость объекта Это удержание, или пространственная локализация, может jJассыатриваться как произведение локализации поля возбуждения и поля детекти­

рования. что следует из (4.49). Для получения сильно локализованных световых

потоков необходимо включать широкий спектр пространственных частот (kx , ky ), что

требует использования линз с высокой числовой апертурой. Однако в оптике даль­

него поля мы имеем жесткую границу отсечки пространственного спектра: только

свободно распространяющиеся плосковолновые компоненты с волновыми векторами

k < k (1.- = 1,2iГ/ л, /.:11 = /.:" = Jk~ + k~) попадают в спектр.

д,lЯ увеличения спектра пространственных частот нам необходимо включить

в раСС~lOтрение эванесцентные волны с волновым числом kll ~ k. К сожалению, они

не ~IOГYT свободно распространятся и, следовательно, не могут быть направлены

к образцу посредством стандартных оптических элементов. Эванесцентные волны привязаны к поверхности вещества или материальных структур. Это означает, что