Новотный и Хехт, Основы нанооптики
.pdfГлава 4
ПРОСТРАНСТВЕННОЕ РАЗРЕШЕНИЕ И КАЧЕСТВО
ПОЗИЦИОНИРОВАНИЯ
Качество позиционирования определяется точностью, с которой объект может
быть локализован в пространстве. С другой стороны, пространственное разреше ние - это способность системы воспринимать два разделенных точечных объекта как два объекта, а не как один объект. Оптическое разрешение жестко ограничено
.1ифракционным пределом до величины световой длины волны. До возникновения
оптики ближнего поля было принято считать, что дифракционный предел пред ставляет собой непреодолимую преграду и что законы физики строго запрещают
получение разрешения, существенно меньшего >"/2. Однако впоследствии стало ясно,
что этот предел не является фундаментально строгим, как считалось ранее, и что
различными изощренными способами можно добиться использования эванесцентных мод пространственного спектра. В этой главе будем рассматривать понятие дифрак ционного предела и обсуждать принципы альтернативных способов визуализации с разрешением вблизи или ниже дифракционного предела.
4.1. Функция рассеяния точки
Функция рассеяния точки (ФРТ) - это мера разрешающей способности опти
ческой системы. Чем уже функция рассеяния точки, тем лучше будет разрешение.
Как следует из названия, функция рассеяния точки определяет характер распро
странения излучения точечного источника. Если имеется излучающий точечный
источник, то его изображение будет иметь конечный размер. Уширение является ПРЯМЫМ следствием фильтрации пространственных частот. Точка в пространстве
\lOжет быть описана дельта-функцией, которая имеет бесконечно широкий спектр
пространственных частот k.I , k y . При распространении от источника к изображению высокочастотные компоненты отфильтровываются. Как правило, финальный спектр
/ ) |
/.») |
/') |
определяется |
U |
К |
роме того, не все плос- |
Ih'; |
+ h' y |
> h'- |
потереи эванесцентных волн. |
|
КОВО.1Новые компоненты спектра собираются в пространстве изображения, что ведет к еще большему сужению спектра. Суженный спектр не позволяет точно воспро извести исходный точечный источник, а его изображение имеет конечный размер.
Стандартный вывод функции влияния точечного источника проводится в рамках ска
.1ЯРНОЙ теории и параксиального приближения. Но во многих оптических системах высокого разрешения эта теория оказывается уже неприменимоЙ. Таким образом, задавая характер рассмотрения через «угловой спектр», мы будем готовы приступить
К строгому изучению процесса формирования изображения в оптических системах. Рассмотрим ситуацию, показанную на рис. 4.1, которая была изучена Шеппардом
и Уилсоном (Sheppard апd Wilson) [1], а затем, позднее, Эндерляйном (Enderlein) [2].
И.1еальныЙ точечный источник электромагнитного излучения находится в фокусе
безаберрационной линзы с высокой числовой апертурой и фокусным расстоянием f. Эта линза собирает лучи, исходящие из точечного источника, затем вторая линза
с фокусным расстоянием f' фокусирует поле на плоскость изображения z = О. Ситуа
ция напоминает задачу, представленную на рис. 3.18. Единственное различие состоит
94 |
Гл. 4 Пространственное разрешение и качество позиционирования |
в том, что в качестве источника выступает точечный источник, а не отраженное от
поверхности поле.
....
~----------------~
|
|
|
(}' |
|
|
|
I |
n |
sin{} |
j' |
I |
\ |
|||
"'! |
sin{}' |
= 7 |
'j' |
Рис. 4.1. Схема измерения функции рассеяния точки. Источник представляет собой произ вольно ориентированный диполь с электрическим дипольным моментом JI. Излучение ДИПО.1Я собирается при помощи безаберрационной линзы с высокой числовой апертурой, а второй линзой фокусируется на плоскость изображения z = О
Мельчайшим объектом, способным излучать электромагнитное поле, является диполь. В оптическом диапазоне большинство частиц, имеющих субдлинноволно
вой размер, излучает подобно электрическим диполям. В то же время небольшие
отверстия излучают как магнитные диполи. В микроволновом диапазоне магнит ные переходы возникают в парамагнитных веществах, а в инфракрасном диапазоне наблюдается магнитодипольное поглощение в мелких металлических частицах, вы званное создаваемыми магнитным полем вихревыми токами свободных носителей
Тем не менее мы можем ограничить наше рассмотрение электрическим диполем. т к
поле магнитного диполя полностью совпадает с полем электрического диполя, если
поменять местами магнитное и электрическое поля по правилу: Е ~ Н и Н - -Е В наиболее общем виде электрическое поле произвольно ориентированного дипо
ля с моментом JL, находящегося в точке ro, взятое в точке r, определяется диадной
<->
функцией Грина G(r, ro) (см. гл. 1):
(,} ....
E(r) = - 2 G(r, ro) . J.L. |
(4.1 ) |
еос |
|
Мы предполагаем, что расстояние между диполем и объективом много больше. чем длина волны излучения. В этом случае нет необходимости рассматривать эва несцентные компоненты поля диполя. Пусть, кроме того, диполь находится в точке ro = О и окружен однородной средой с....показателем преломления n. В этом случае мы
можем использовать функцию Грина G для свободного пространства в приближении дальнего поля, которая в сферических координатах имеет вид (см. Приложение г)
+-+ |
( |
|
О) _ ехр(zkr) |
|
|
|
|
|
|
|
|
G |
|
r, |
- |
4 |
х |
|
|
|
|
|
|
DC |
|
|
|
|
|
|
|
||||
|
|
|
|
7ГТ |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
х [ |
(1 |
- сов2 Фsin2 (}) |
- |
sin ФСО!:!Фsin2 {} |
- |
СО!:!ФHill {} сон(J ] |
|
|
|
|
|
- siпфсоsфsiп2 {} (1 |
- sin2 Фsin2 (}) |
- |
Hill Ф Hill (J сон (J . |
(4.2) |
|||
|
|
|
|
|
- |
сов Ф sin {} сов {} |
- |
sin Фsin {} со!:!{} |
|
Hi1l2 (J |
|
Таким |
образом, |
мы |
видим, что |
это |
просто матрица |
|
(3 х 3). которая, |
чтобы |
|||
получить электрическое поле, должна быть умножена на вектор ДИПОЛЬНОГО момента
4 1 Функция рассеяния точки |
95 |
~ = (JI,./I!I./I:) 1). Для описания преломления на вспомогательной сфере радиуса 1
мы должны спроецировать вектор электрического поля вдоль векторов Пв и ПФ, как
уже было проделано в разд. 3.5. После преломления поле распространяется как
ко.lлимированныЙ пучок в направлении второй линзы, с фокусным расстоянием f',
на |
которой |
он вновь преломляется. Для |
диполя, ориентированного вдоль |
|
оси х |
|||||||
(~ = 11, П,), |
поле непосредственно за второй линзой будет иметь вид |
|
|
|
||||||||
E1')(lI |
|
) = _V}/l, cxp(tkJ) |
Х |
|
|
|
|
|
||||
х |
и.О |
|
.) |
8 j |
|
|
|
|
|
|
||
|
|
|
|
с()('- |
1г |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Х [ |
(1 + СОI> ОСОI> О') - (1 - совОсовО') СОl>2ф ] |
nсов()' |
|
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
-( 1 - сов О сов О') sin 2ф |
|
(4.3) |
|||
|
|
|
|
|
|
|
n' сов() |
, |
||||
|
|
|
|
|
|
|
|
2 сов Ф Bin О' сов Ф |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
||
где |
|
|
|
Hill о' = f, |
|
|
совО' = g(O) = J1 - (1/1')2 Bin2 О. |
|
|
|
||
|
|
|
|
нiпО, |
|
|
(4.4) |
|||||
|
Множитель (еон о'/ СОI> О)1/2 |
является следствием закона сохранения энергии, как |
||||||||||
бы.l0 |
показано в |
разд. 3.5. В |
пределе 1 « |
l' вклад сов О' может быть отброшен, |
||||||||
но ('он О отброшен быть не может, т. к. мы рассматриваем линзу, имеющую высокую
числовую апертуру. Аналогичным образом может быть записано поле для диполей J.Ly
и /1: А поле произвольно ориентированного диполя представляет собой просто
суперпозицию всех трех полей:
|
Е |
ос |
(О ф) = Е(Х) + Е(У) + E(Z) |
(4.5) |
|||
|
|
t |
ос |
Х |
00· |
|
|
Для получения поля Е |
вблизи |
фокуса |
второй линзы мы |
подставили поле Ех |
|||
в соотношение (3.47). Так |
как мы |
предположили, |
что 1 « |
1', это позволяет нам |
|||
воспользоваться приближением (3.106). Интегрирование по Ф может быть проведено
аналитически, а результат записан в виде
у} +-+ |
|
Е(р, '1'. z) = - 2 GpSF(p, '1', z) .~, |
(4.6) |
сос |
|
где диадная функция рассеяния точки (PSF) 2) задается выражением |
|
- |
_ |
k' j |
|
[ |
(Уоо + io2 СОВ2'1') |
io2 sin 2'1' |
-2z~1 СОВ'Р ] |
~ |
|||
,(Af-k'f') |
- . |
- |
- |
сов2'1') |
.- |
Bin'P |
|||||
G P'i F |
- |
87r~ j' (' |
|
102 SШ2'1' |
(100 - |
102 |
-2il01 |
V~ . |
|||
|
|
|
|
|
о |
|
о |
|
о |
|
(4.7) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
3;J.eCb интегралы 100 - 102 определяются следующим образом:
lоо(р.:)= Н'Г(СОНО)I/2НinО(1+cosO)Jo(k'psinOI/I') х
о
х ехр (ik' z[1 - 1/2(1/1')2 sin2 О]) dO, (4.8)
1) В приближении дальнего поля электрическое поле диполя в точке r для диполя, располо женного в точке ГО, может быть также записано в виде Е = -у/р.о[г х r х 11] ехр(tkт)/47rТЗ -
При:.tеч авm
2) От англ point-spread tunction - Прuм.еч. пер
96 Гл 4 Просmрансmвенное разрешение и качество позиционирования
101 (р,z) = е,г(совО)1/2 sin2OJ1(k' рsin Оj / j') х
о
х ехр (ik' ;;[1 - 1/2и/ !')~ Hil1~ О]) (Ш. (49)
1о2(Р,z) = О'Г(СОБо)1/2SillO( 1 - |
СОБ0)J2(k'pHin Оf! j') х |
|
||
|
о |
|
|
|
|
|
|
х exp(zk'z[1-1/2(J/!,)~нil1~Н])(lf} |
(410) |
Первый |
столбец |
в G pSF |
означает пол~ ДИП..9ля 1/,. вторая колонка - |
ПО.lе |
диполя JlII' |
третья - |
диполя J.Lz. Интегралы 100 - 102 похожи на интегралы 100 - 10:2. |
||
описанные в связи с вопросом фокусировки гауссова пучка (см. (358)-(3.60))
Основное отличие заключается в отсутствии в данном случае продольного поля. что
обусловлено нашим требованием, чтобы j « 1'.
Соотношения (4.6)-(4.10) описывают распределение поля произвольно ориенти рованного диполя от источника до изображения. Результат зависит от числовой
апертуры начальной линзы
(4 11)
а также от коэффициента (поперечного) увеличения 111 оптической системы, который
мы определим как
(4 12)
в дальнейшем для обозначения функции рассеяния точки будем использовать
величину IEI2 , Т. к. именно она может быть привязана к данным, получаеМЫI\I от
оптических детекторов. Сначала рассмотрим ситуацию, когда диполь ориентирован
перпендикулярно оптической оси системы. Без потери общности рассуждений можно
задать ось х вдоль оси диполя, т. е. JI. = JI.хПх. Для линз с низкой числовой апертурой величина Ошах достаточно мала, чтобы мы могли применить приближение {'ОН О ::::: 1.
а Hin О ~ О. Далее, пусть в плоскости изображения (z = О, iJ = 7r /2) экспоненциальные
множители в интегралах равны единице, а функция Бесселя второго порядка ./2
настолько мала по причине малост~О, что интегралом 102 можно пренебречь. В TaKO~1
случае остается только интеграл 100, который может быть вычислен аналитически.
если использовать соотношение |
JxJo(x)dx = xJI(X), |
|
|
|
|
|||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
(4 13) |
||||||
Итак. параксиальная функция рассеяния точки |
в плоскости изображения Д.1Я |
|||||||||||||
диполя, ориентированного вдоль оси х, может быть записана в виде |
|
|||||||||||||
. |
1 ( .. |
~ - |
|
)12 - |
4 |
о |
4 |
|
|
|
_ ,) |
- |
N:1 fI |
|
О |
7r |
J1,~ |
NA |
[ |
2 |
Jl(2 |
7rfJ )]- |
(4 14) |
||||||
lШl |
Е Х,у, .. - |
- |
-"-/6-,-2 |
|
2 |
- |
Р = |
АГ):,' |
||||||
ешdх 4;:.1Г/2 |
|
|
|
|
с:оnn |
>. |
J.I |
|
|
7rp |
|
|
|
|
Функциональная |
зависимость заключена в квадратные скобки и известна как |
|||||||||||||
функция ЗЙри. На |
рис. |
4.2, а |
она |
обозначена |
сплошной |
кривой. Пунктирная и |
||||||||
точечная кривые воспроизводят результат точного расчета функции рассеяния точки
для случая линзы с числовой апертурой N А = 1,4, |
произведенного в соответствии |
с соотношениями (4.7)-(4.10). Пунктирная кривая |
выстроена вдоль оси .1' (в на- |
|
-1 |
1 Функция рассеяния точки |
|
|
97 |
|
праВ,lении оси |
ДИПОJlЯ), а точечная - вдопь оси |
у. Вдопь |
обеих осей |
поле |
имеет |
|
опреJ.еленную |
ПОJlяризацию |
(cos2<? = ±l, Si1l2,? |
= О), но |
ее ширина |
вдопь |
оси х |
60,lьше Это оБУСJlОВJlено интеграJlОМ [02, который в одном СJlучае вычитается из [00,
а в J.PyrO~1 - прибаВJlяется к нему. В реЗУJlьтате мы ПОJlучаем пятно ЭJlJlиптической фОР:\1Ы С ростом ЧИСJlОВОЙ апертуры степень его ЭJlЛИПТИЧНОСТИ возрастает. Тем не
\1енее. как ни удивитеJlЬНО, параксиаJlьная функция рассеяния точки является очень
хорошим приБJlижением и ДJlЯ линз С высокой ЧИСJlОВОЙ апертурой! А еСJlИ взять cpeJ.Hee между кривыми вдопь осей х и у, то параксиальная функция рассеяния
ТОЧКИ станет почти идеаJlЬНОЙ аппроксимацией.
в |
Г 1\ 2=0 |
|
лJ |
\ |
\л |
|
|
-1 -О,') |
О 0,5 |
1 1,5 |
|
|
" |
|
|
|
|
pNA/M>. |
|
||
Рис 4 2 а - ФУНКЦИЯ |
рассеяния ТОЧКИ в плоскости изображения |
(z |
= о) |
для диполя, |
об,lа.1ающего моментом 11 |
= 11, П, Сплощная кривая представляет собой |
параксиальное при |
||
б,lижение, а пунктирная и точечная кривые - результат точного расчета для линзы с числовой
апертурой .\'.1= 1,4 (11 = 1,518) Пунктирная кривая вычислена вдоль оси х, а точечная - BJO,lb оси ,Ij. б - ФУНКЦИЯ рассеяния точки, вычисленная вдоль оси z Сплощная кривая -
параксиа.lьное приближение, пунктирная - результат точного расчета для линзы с числовой
апертурой .\'.1 = 1,4 в - ФУНКЦИЯ рассеяния точки в плоскости изображения (z = о) дЛЯ
.1I1ПО.1Я. обладающего моментом 11 = J1оПz. Сплошная кривая - параксиальное приближение, п~ нктирная - результат точного расчета для линзы с числовой апертурой N А = 1,4. Рисунки
по"азывают. что параксиальная ФУНКЦИЯ рассеяния точки является хорошим приближением для линз с высокой числовой апертурой!
Ширина функции рассеяния точки ~:т обычно вводится как радиаJlьная ширина,
при !,оторой ее значение обращается в нуль, или
Л1>' |
(4.15) |
~x = 0,6098]vA' |
Эта ширина также называется радиусом диска ЭЙри. Она очень простой зависи
\IOстью связана с ЧИСJlОВОЙ апертурой, длиной волны и коэффициентом увеличения
систе~1Ы
Мы ввеJlИ функцию рассеяния точки так, чтобы она была пропорционаJlьна ПJlОТ
ности энергии, т. е той величине, к которой чувствительны оптические детекторы.
Так как магнитное ПОJlе Н просто пропорционально электрическому, повернутому на уго., 900 вокруг оси .:, то функция рассеяния точки для магнитного поля также
повернута на 900 по сравнению с функцией рассеяния точки ДJlЯ ЭJlектрического ПО.1Я Следовательно. ПОJlная плотность энергии и усредненный по времени вектор
Пойнтинга обладают вращатеJlЬНОЙ симметрией относительно оси z.
Теперь рассмотрим напряженность поля вдоль оптической оси z, которая связана с аксиаJlЬ~ОЙ функцией рассеяния точки. Единственным неисчезающим интегралом
остается 10О, что подразумевает то обстоятеJlЬСТВО, что поле вдопь всей оси z остается
~ ,1 HOHOTllblii. Б Хехт
98 Гл 4 Пространственное разрешение и качество позиционирования
поляризованным вдоль оси диполя х. Интегрируя в параксиальном приближении 100.
получим следующий результат:
1· |
jE( |
|
=0 |
|
=0 |
|
42 |
А4 |
'(;;'12 |
_ |
NA2 ;; |
(4 16) |
|||
х |
, у |
, Z |
)j2=_1Г_/-Lх~[SШ1ГZJ] |
|
21/' м2>. . |
||||||||||
lnl |
|
|
|
2' |
>. |
6 |
111 |
2 |
- |
:; = |
|
||||
{)ШRх«:'1Г/2 |
|
|
|
|
|
|
с:оnn |
|
|
1ГZ |
|
||||
Сравнение этого результата с результатом точного расчета показано на рис 42(6)
для N А = 1,4. Кривые идеально перекрываются, указывая на то обстоятельство.
что параксиальный предел является очень хорошим приближением даже для боль
ших N А. Расстояние дZ, на котором аксиальная функция рассеяния точки зануля-
ется, равно
л |
21м2>. |
(4 17) |
uZ = |
n -- |
NA2
и называется глубиной поля. В отличие от диска Эйри, Д,:; зависит от показате
ля преломления окружающего пространства. Кроме того, глубина поля зависит от квадратов Лl и N А. Таким образом, как правило, глубина поля гораздо больше. чем
радиус диска ЭЙри. Для типичного микроскопа с параметрами М = 60х, NA = 1.4
и для длины волны 500 нм мы получим: Дх = 13 мкм, а дZ = 1,8 мм.
До сей поры мы рассматривали диполь, ось которого перпендикулярна оптической
оси системы. В случае если диполь будет параллелен оптической оси, Т.е. 11 = //:n:. ситуация в корне меняется. Фокальное поле оказывается симметричным относитель но оси вращения, радиально поляризованным и равным нулю на оптической оси В параксиальном пределе получим
1· |
jE( |
~=0)j2= |
1Г4 |
/-L~NАб |
[2J2(21Гр!]2 |
_ N,4 р |
(4 18) |
||||
1т |
|
Х, у, '" |
2' |
б |
м |
2 |
2 |
- |
Р = liТЛ' |
|
|
{)шах«:'1Г/2 |
|
|
с:оn/3n |
>. |
|
|
|
1Гр |
|
||
см. рис. 4.2, в. Сравнение с результатом точного расчета для N А = 1,4 вновь пока |
|||||||||||
зывает, что параксиальное выражение |
является хорошей аппроксимацией |
Так как |
|||||||||
поле на оптической оси равно нулю, ввести такую величину, как ширина функции рассеяния точки, для диполя, ориентированного вдоль оптической оси, оказывается затруднительно. Однако сравнение рис. 4.2, б и рис. 4.2, в показывает. что ширина изображения для диполя /-lz больше, чем для диполя M~.
Часто в эксперименте бывает необходимо определить дипольную ориентацию
и напряженность источника излучения. Это обратная задача, которая в нашей cxe~le
может быть решена путем исследования распределения поля в плоскости изобра
жения с использованием, например, CCD-камерbI, [3, 4]. При помощи уравнений
(4.6)-(4.10) мы можем произвести ряд обратных вычислений и определить пара
метры источника излучения. Эту процедуру можно выполнить более эффективно.
если разделить собранное излучение по двум ортогональным поляризациям и зате~1 сфокусировать на разнесенные детекторы. Детектирование и описание отдельных
молекул, основаные на полученных от них диаграммах направленности излучения
ипоглощения, будут в дальнейшем обсуждаться в гл. 9.
Взаключение этого раздела подытожим вышесказанное. Вывод состоит в TOl\I. что функция рассеяния точки определяющим образом зависит от ориентации ди польного момента излучающего точечного источника. Для диполей, направленных перпендикулярно оптической оси системы, мы наблюдаем превосходное согласие со знакомой нам параксиальной функцией рассеяния точки, которое не исчезает даже
для больших значений N А.
4 2 Предел разрешения |
99 |
4.2. Предел разрешения
Теперь, когда мы исследовали вопрос о том, как излучение одиночного излучателя
распространяется от источника к изображению, попытаемся дать ответ еще на
один вопрос: насколько четко мы можем различить два излучателя, находящиеся
на расстоянии Дrll = (дх2 + ду2)1/2 в плоскости объекта? Каждый из этих двух
точечных источников будет характеризоваться своей функцией рассеяния точки, имеющей определенную ширину. Если мы начнем сближать излучатели на плоскости объекта, их функции рассеяния точки в плоскости изображения начнут перекры ваться и в какой-то момент станут неразличимы. Утверждается, что две функции
рассеяния точки являются различимыми, если их максимумы отстоят друг от друга
на величину, не меньшую ширины одной из них. Таким образом, чем уже функция
рассеяния точки, тем лучшее разрешение мы можем получить.
Мы уже упоминали в разд. 3.1, что разрешающая способность оптической систе
~lbI зависит от спектральной ширины спектра пространственных частот Дrll = (дх2 + + ~.1/)1/2 излучения, проходящего через оптическую систему. Одно из простейших
С.lедствиЙ формализма спектров Фурье дает соотношение
(4.19)
аналогичное соотношению неопределенностей Гейзенберга в квантовой механике.
Произведение величин дkll и Дrll минимизируется в том случае, когда их распре
деления гауссовы. Гауссово распределение является аналогом волновой функции, :\Iинимизирующей принцип неопределенности в квантовой механике.
В оптике дальнего поля верхняя граница для дkll задается величиной волнового вектора k = (w/ с)n = (271"/л)n в среде объекта, т. к. мы отбросили пространственные
частоты, связанные с эванесцентными полями. В этом случае разрешение не может
превышать |
= 2 |
Л |
|
rnin [rll] |
(4.20) |
||
7rn . |
|
Плоскость объекта |
Плоскость изображения |
Рис 4 3 Иллюстрация понятия .предел разрешения•. Два одновременно излучающих точеч ных источника, разнесенные на величину ~rll в плоскости изображения, создают в плоскости изображения объединенную функцию рассеяния точки. Два точечных источника могут быть оптически разрешены, если могут быть разрешены их изображения
Однако на |
практике мы не имеем возможности восстановить полный спектр дk = |
|
= [о...., k], |
а верхняя граница будет определятся числовой апертурой системы, т. е. |
|
|
rniП[дrll] = 27r~A' |
(4.21) |
100 |
Гл 4 Пространственное разрешение и качество позиционирования |
Такова картина в лучшем случае, на деле выражения для пределов разрешения.
принадлежащие Аббе и Рэлею, не столь оптимистичны.
Формулировка Аббе предполагает, что рассматриваются в параксиальном преде.lе (см. (4.14) два диполя, оси которых перпендикулярны оптической оси системы.
Расстояние между диполями в плоскости объекта Дrll отображается в расстоя ние ]1.1Дrll в плоскости изображения. Аббе утверждает, что минимальное расстояние min [АfДrll] соответствует расстоянию между функциями рассеяния точки. распо
ложенными таким образом, что максимум одной совпадает с первым МИНИМУМОМ
другой. Это расстояние задается радиусом диска Эйри, определяемого (4.15) Таким образом, в соответствии с формулировкой Аббе [5]
1 Аббе (1873): |
mill [rll] = 0.6098 :А·1 |
(4.22) |
Этот предел примерно в 3,8 раз хуже, чем задаваемый (4.21). |
Он основан на ис |
|
пользовании параксиального приближения и относится к частному случаю. когда оси
диполей перпендикулярны оптической оси. Для диполей, параллельных оптической
оси, все выглядит совсем иначе. Мы видим, что имеет место некоторая произволь ность в определении предела разрешения. Это же можно сказать и о критерии
Рэлея [6], основанном на перекрытии двух функций рассеяния точки в двумерной
геометрии. Критерий Рэлея был сформулирован для задачи о спектрометре на основе
дифракционной решетки, а не для оптического микроскопа, однако он может быть перенесен и в область оптической микроскопии.
В пределе разрешения по Аббе расстояние между двумя точечными источниками
искажается при возникновении ситуации неравных дипольных моментов Причина
заключается в том, что в этом подходе мы рассматриваем именно перекрытие
максимума одной функции и минимума (нуля) другой. Конечно, мы можем про
изводить дальнейшее перекрытие, сохраняя при этом возможность различать два источника. На самом деле в системе без шумов мы всегда имеем возможность провести обратную свертку совместной функции рассеяния точки, даже если мы не можем наблюдать два различных максимума этой функции. Однако даже если оба источника, оптический инструмент и детектор, являются безшумовыми, в систе~Iе всегда присутствует дробовой шум, связанный с квантовой природой света, что
накладывает ограничение на эту идеализированную картину понятия разрешения.
В соответствии с (4.19) нет предела для оптического разрешения. в случае ес.1И
спектр дkll неограниченно широк. Однако превышение порога, задаваемого (4.20).
требует вовлечения эванесцентных компонент поля. Именно этот вопрос является
предметом оптической микроскопии ближнего поля и будет обсуждаться в последую
щих главах.
Для того чтобы растянуть предел разрешения, существуют также некоторые
хитрости, основанные на исходной информации о точечном источнике, которой мы
располагаем. Например, для использования критерия Аббе необходимо обладать
предварительным знанием об ориентации диполей. Если вдобавок к предпо.lО
жению Аббе нам известно, что эти диполи взаимно перпендикулярны, т е ори
ентированы как /-t:r И /-ty, расположение поляризатора на пути детектора может
еще больше увеличить разрешение. Предварительное знание может касаться также
KOrejeHTHbIX свойств двух наших излучателей, т. е. того, как соотносятся величины
IEll + IE212 и IEI + Е212. В любом случае предварительное знание о свойствах
образцов снижает количество возможных конфигураций системы и улучшает ее разрешение. Восстановление объекта исходя их знания его свойств является цен тральным вопросом задачи обратного рассеяния. Во флуоресцентной микроскопии
4 2. Предел разрешения |
101 |
предварительное знание может быть основано на знании вида молекул, используемых
J..1Я маркировки биологических образцов. Знание излучательных и поглощающих свойств этих молекул позволяет существенно повысить разрешение системы. Общая
теория оптического разрешения должна содержать количественную меру исходной
информаllИИ об объекте, однако, поскольку эта информация может существовать
во ~IНожестве различных форм, предложить обобщающее понятие представляется
затруднительным.
4.2.1. Повышение предела разрешения путем селективного возбуждения.
При обсуждении предела разрешения мы предполагали, что имеются две излучаю
щие точки, разнесенные на расстояние .6.rll в плоскости объекта. Но источники не
из.lучают без внешнего возбуждения. Если, например, мы можем каждый из диполей
заставить излучать в определенное время, то детектируемое в плоскости изображе ния поле мы сможем соотнести именно с тем диполем, который излучает в данное
время Затем мы можем возбудить второй диполь и таким же образом получить его
изображение. То есть мы получим возможность совершенного распознавания двух объектов вне зависимости от того, насколько близко друг к другу они находятся. Однако эта идея разрешения требует некоторой корректировки.
На практике точечные источники возбуждаются при помощи источника возбуж J.ения Е""., обладающего конечной протяженностью в пространстве. Именно эта протяженность определяет, возможно ли при определенной величине .6.rll возбудить
только один диполь. Критерий разрешения, сформулированный выше, предполагает, что мы освещаем поверхность образца широким излучением, заставляющим все
точечные источники излучать одновременно. Это значит, что для реализации указан
ной идеи нам необходимо ввести понятие профиля возбуждения. В общем виде мы ~lOжем сделать это, рассматривая взаимодействие между возбуждающим полем Ее"с
иисследуемым диполем,
J1" = J[свойства среды, Еехс(гв - r 1l )], |
(4.23) |
где Г" представляет собой (постоянный) радиус-вектор диполя J1", а гв - (пере \lенный) радиус-вектор источника возбуждающего поля. Вторая координата может
\Iеняться в пределах плоскости объекта для селективного возбуждения отдельных
J.иполеЙ С учетом (4.23) функция рассеяния точки начинает зависеть от возбуж
J.ающего поля и характеристик взаимодействия света с веществом. Разрешение оптической системы, таким образом, также будет зависеть от этого взаимодействия, что увеличивает число параметров, подлежащих рассмотрению. Задача становится
еше более сложной, если нам придется учесть взаимодействие между диполями.
д.1Я того чтобы существенно продвинуться дальше, мы должны ограничить наше
раСОlOтрение какими-то определенными рамками.
Предположим, что взаимодействие между диполем и возбуждающим полем зада
ется следующим общим нелинейным соотношением:
J111 (w·. 2,.:.... ; г" г,,) = п(.<})Еш(w, г.• |
- гn) + |
+ ,1(2w)Eexc (w, г.. - rn)Eexc(w, Г., - гn) + |
|
+ , (3ш)Еехс(w, Г.• - |
г")Eexc(w, г.. - г")Eexc(w, гs - г,,) + ... , (4.24) |
где произведения между векторами поля представляют собой векторные произведе
ния В наиболее общем виде поляризуемость Q представляет собой теНЗ0р второго
ранга. а восприимчивости ;1 и , являются тензорами третьего и четвертого рангов
102 |
Гл 4. Просmрансmвенное разрешение и качество позиционирования |
Пространство
изображения
Рис. 4 4 Схематическое изображение экспериментальной установки, использующей лока.1И зованный источник возбуждения образца. Дипольный момент 11" зависит от возбуждающего поля Е.хс Функция рассеяния точки, задаваемая полем Е в плоскости изображения. зависит
от характера взаимодействия J1" и Е"с, а также от разницы координат IrlI - r,1
соответственно. Удобно рассматривать различные нелинейности отдельно, записывая
(425)
с помощью диадной функции рассеяния точки для диполя, находящегося в точ ке гn В плоскости объекта, фокальное поле в точке г как функция координаты г, возбуждающего пучка может быть записана в виде
Е(г,гn,г.ч;nW) = (ru.v~2GpSF(rn,rS;nw) ·!1"(lIW,r,,,r,). |
(426) |
соС |
|
Если диполей несколько, необходимо проводить суммирование по 11 Уравнение (4.26) показывает в наиболее общем виде характер влияния источника
возбуждения на функцию рассеяния точки. Конструирование функций рассеяния
точки получило название инженерии рассеяния точки. Оно играет важнейшую РО.1Ь
вконфокальной микроскопии высокого разрешения. Поле в уравнении (426) зависит от координат источника возбуждения, координат диполя в плоскости объекта и коор динаты, в которой поле рассматривается в плоскости изображения. Удобно зафикси
ровать координату возбуждающего пучка, а также сфокусировать, после определен ной пространственной обработки, полную интенсивность в плоскости изображения
(интегрируя по г). Тогда сигнал на детекторе будет зависеть исключительно от коор динаты диполя гn. Аналогично, поле в плоскости изображения можно рассматривать
вточке, находящейся на оптической оси. Именно это и делается в конфокальной
микроскопии, которую мы будем рассматривать в следующем разделе. ОтмеТИ~I.
что поле Е зависит не только от пространственных координат системы, но и от
свойств вещества через восприимчивости 0:, f3 и "(. Таким образом. любое оптическое
изображение образца содержит в себе информацию как о спектроскопических. так и о пространственных свойствах системы.
4.2.2. Осевое разрешение. Для описания положения излучающего дипо.1Я
в конфокальной микроскопии используют относительную координату г" - Г., между
возбуждающим пучком и положением диполя. Изображение формируется путем присваивания каждой точке координатного множества г" - г, определенного зна-