Индуцированный мутагенез

Раньше считали, что мутации возникают только под действи­ем внутренних факторов (внутренней среды организма), имею­щих место при синтезе ДНК, репродукции хромосом, делении клеток. Ошибки, или «опечатки», в строении генетического ма­териала, казалось бы, не зависели от условий внешней среды. Действительно, первые попытки вызвать мутацию искусственно были безуспешными. Однако уже в 1925 г. Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов наблюдали широкий спектр мутаций у грибов, вызванных воздействием лучами радия.

Широкий интерес у биологов вызвали сообщения Г. Меллера (1927), обнаружившего мутационное действие рентгеновых лучей у дрозофилы. В дальнейшем у нее при облучении стали получать

166

самые разнообразные мутации, что способствовало изучению строения генетического материала, взаимодействия мутантных генов и др. В начале 30-х годов В. В. Сахаров, М. Е. Лобашов открыли мутагенное действие отдельных химических веществ. И. А. Рапопорт в России и Ш. Ауэрбах в Англии обнаружили хи­мические соединения с сильным мутагенным действием. В ряде работ, начало которых, очевидно, положено С. М. Гершензоном, открывшим мутагенный эффект при включении экзогенной ДНК в геном дрозофилы, показана возможность индуцирования ген­ных и хромосомных мутаций у животных биологическими агента­ми, среди которых вирусы, бактерии и другие объекты.

Роль репарирующих систем в мутационном процессе. Повреж­дения в ДНК, возникающие спонтанно или индуцированно, не всегда реализуются в виде мутаций. Часть из них устраняется или исправляется с помощью специальных репарирующих фер­ментов, содержащихся в клетках. Известно несколько основных механизмов репарации:

45. фоторепарация (фотореактивация). Процесс протекает подвлиянием видимого света и фотореактивирующего фермента;

46. репарация в молекуле ДНК путем механизма «вырезание —застройка» (темновая репарация);

47. эксцизионная (пререпликативная) репарация;

4) репарация однонитевых разрывов в ДНК при действиилигаз;

5) пострепликативная, или рекомбинационная, репарация.

Наиболее изучены первые два механизма репарации. Так, ме­ханизм фоторепарации заключается в устранении видимым све­том димеров тимина, часто возникающих под действием ультра­фиолетовых лучей. Это происходит с помощью особого фоторе­активирующего фермента. Видимый свет активирует молекулу фермента, она отделяется от димера тимина и разъединяет его на два отдельных тимина. Так восстанавливается нормальная струк­тура ДНК.

Темновая репарация протекает с помощью нескольких фер­ментов, под действием которых последовательно происходят надрезание, выщепление, расширение бреши, репаративная реп­ликация и сшивание концов молекулы ДНК (рис. 37). Эти два механизма репарации устраняют дефекты в ДНК в основном до стадии репликации.

Изучен механизм удаления (эксцизии) измененных участков ДНК у мутантов с дефектами систем репарации. Это происходит следующим образом (В. А. Ратнер, 1983):

48. при утрате основания. Утрата основания может быть вос­полнена по комплементарной матрице либо ферментом инверта-зой, либо путем разрыва дефектной цепи (инцизия), вырезанияфрагмента репарационной застройки бреши и замыкания связи;

49. при замене, модификации основания и структурном дефек-

167

3'OH

I I I I Mi I I I I I I I I I I I I I I I I I

1111111II111 I

I I I I I I I I I I I I I

Рис. 37. Схема темновой ре­парации (по В. Н. Сойферу):

I I |Ж I i i i

Ill I I I I I I I

|MI| II

i

я —исходная ДНК; б—повреж­денная ДНК; в — репарированная ДНК; /—надрезание; II—вы-щепление; ///—расширение бреши; IV— репаративная репли­кация; V— сшивание концов

ЭНДОНУКЛЕАЗА

I I I I I

I I I I I

Т~Г

I I I

I I I

ЭНДО- ИЛИ ЭК30НУКЛЕАЗА

TTT

I I I

II¹¹!

I I I I I

ЭКЗОНУКЛЕАЗА

III

I I I

ПОЛИМЕРАЗА

IV

те. Дефект основания и структурный дефект репарируются одина­ковыми механизмами: а) одноцепочным раз­рывом вблизи дефект­ного фрагмента специ­фичной эндонуклеа-зой; б) эксцизией дефекта экзонуклеа-зой; в) •застройкой бреши репарационной ДНК-полимеразой и г) замыканием фосфоди-эфирной связи лига-зой.

ЛИГАЗА

l i

i i i i i i i

i i

Поврежденные, на­пример, ультрафиоле­товыми лучами моле­кулы ДНК могут реп­лицироваться и производить такие же поврежденные участки ДНК. Однако после репликации количество поврежденных участков ДНК уменьшается вследствие замены их фрагментами, взятыми от неповрежденных молекул.

Процесс пострепликативной репарации выражен не только после облучения ультрафиолетовыми лучами, но и после воздей­ствия химическими мутагенами.

Спонтанные и индуцированные мутации фиксируются в клет­ках в случаях повреждений в системах репарирующих ферментов. Первичные мутационные повреждения систем репарации и свя­занных с ними систем репликации и рекомбинации, возникшие в результате ошибок ферментов, получили название ошибок ре­параций. Этот источник составляет существенную долю спонтан­ных первичных повреждений. Многие мутагены действуют не прямо на ДНК, а через компоненты систем репарации, реплика­ции и рекомбинации (В.А. Ратнер, 1983).

Установлены генетические различия в активности репарирую­щих систем ферментов, направленных против разрушающего действия мутагенов.

168

Однократное действие мутагенов может быть зафиксировано в ряде поколений клеток. Такое явление продленного мутагенеза носит название реплицирующей нестабильности. Причинами гене­тической нестабильности, по мнению Н. П. Дубинина, могут быть структурные мутации хромосом, действие генов-мутаторов и др.

Естественные механизмы защиты живых организмов от дейст­вия мутагенных факторов можно усилить искусственно создан­ными человеком специальными протекторами, или антимутаге­нами.

ПРОБЛЕМЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ ГЕНЕТИКИ ЖИВОТНЫХ

Открытие явления индуцированного мутагенеза привело к об­наружению целого ряда факторов, веществ и агентов, способных изменять наследственный материал клеток. В соответствии с их природой их подразделяют на три класса мутагенов: физические, химические и биологические.

1. Физические мутагены. Основными мутагенами этого класса являются ионизирующие излучения, ультрафиолето­вые лучи и повышенная температура. К группе ионизирующих излучений относят рентгеновы лучи, у-лучи и р-частицы, прото­ны, нейтроны и другие факторы.

Ионизирующие излучения, проникая в клетки, на своем пути вырывают электроны из молекул, что приводит к образованию положительно заряженных ионов. Освободившиеся электроны присоединяются к другим молекулам, которые становятся отри­цательно заряженными. В результате облучения клеток образу­ются свободные радикалы водорода (Н) и гидроксила (ОН), ко­торые тотчас дают новые соединения, в том числе активный пероксид водорода (Н2О2). Такие превращения в молекулах ДНК и кариотипе в итоге приводят к изменению функций генетичес­кого аппарата клеток, аберрациям хромосом и возникновению точковых мутаций. Экспериментально установлено, что частота мутаций, индуцированных ионизирующими излучениями, прямо пропорциональна дозе радиации. Под действием ионизирующих излучений чаще всего возникают структурные перестройки хро­мосом и реже — генные мутации. Так, при облучении морских свинок и домашних свиней И. Л. Гольдман и С. Фотиева обна­ружили различный спектр аберраций хромосом.

Транслокации и инверсии наблюдали в соматических клетках поросят, полученных при осеменении свиноматок облученной спермой. Опыты показывают, что при облучении половых клеток часть их оказывается совсем нежизнеспособной или с умеренны­ми нарушениями. Из последних образуются зиготы, которые обычно скоро отмирают вследствие сильных изменений в гено­типе («доминантные летали»).

169

В опыте Фриса и Странцингера у свиноматок, осемененных облученной спермой при дозе 600 Р, было в среднем 7,7 поро­сенка, а при дозе 800 Р — 5,4 против 9,7, полученных при осеме­нении нормальной спермой.

Ионизирующие облучения могут нарушить процессы деления в соматических клетках, вследствие чего возникают нарушения и злокачественные образования. Сильное облучение может вызвать смерть.

Источником радиации могут быть прежде всего излучения, возникающие при взрывах атомных и водородных бомб.

2. Химические мутагены. Это вещества химическойприроды, способные индуцировать мутации. Выраженными му­тагенными свойствами обладают отдельные химические вещест­ва, используемые в промышленности и сельском хозяйстве. Кнаиболее сильным из них относят алкилирующие соединения(диметил- и диэтилсульфат, иприт и его производные, нитрозо-метил и нитрозоэтилмочевину, этилметансульфонат, фотрин,фосфемид)- Мутагенный эффект алкилирующих соединений свя­зан с введением в ДНК метиловых, этиловых, пропиловых идругих радикалов, в результате чего происходят реакции метили­рования, этилирования. Сильно выраженным мутагенным эф­фектом обладают аналоги азотистых оснований и нуклеиновыхкислот (5-бромурацил, 5-бромдезоксиуридин, 5-фтордезоксиури-дин, 8-азогуанин, аминопурин, кофеин и др.), акридиновые кра­сители (акридин желтый и оранжевый, 5-аноакридин, профла-вин и др.), а также азотистая кислота, гидроксиламин, формаль­дегид, пероксиды, уретан и т. д.

Мутагенным действием обладают пестициды, гербициды, ис­пользуемые в агрономии для борьбы с сорными растениями и вредными насекомыми. Мутации могут быть индуцированы ми­неральными удобрениями, прежде всего нитратами, которые превращаются сначала в нитриты, а затем в активные нитрозо-амины.

Химические мутагены индуцируют как генные, так и хромо­сомные мутации. Особенности их — аккумуляция и передача при делении клеток в последующей генерации, более высокая частота индуцирования генных мутаций, чем аберраций хромосом. Хими­ческие мутагены дают широкий спектр видимых хромосомных аберраций. Например, в экспериментах С. Ш. Исамухамедова по изучению действия фотрина, фосфемида и проспидина на карио-тип свиней обнаружены хроматидные и изохроматидные делеции, а также хроматидные обмены и гэпы (бреши). Гэп —хромосомная аберрация, заключающаяся в частичном разрушении хроматиды и образовании ахроматического пробела, а также в отсутствии одно­го или нескольких нуклеотидов в одной из цепей ДНК.

3. Биологические мутагены. Простейшие живыеорганизмы, вызывающие мутации у животных, составляют класс

170

биологических мутагенов. К ним относятся вирусы, бактерии, а также гельминты, актиномицеты, растительные экстракты и др. Мутагенное действие вирусов открыто генетиком Н. И. Шапиро. Мутагенными свойствами обладают живые вакцины. Мутагенное действие этих организмов связано с проникновением в клетки чужеродной ДНК. Биологические мутагены вызывают широкий спектр мутаций в клетках животных. Например, при изучении кариотипа клеток телят, ягнят и поросят, зараженных вирусом свиной лихорадки, были обнаружены различные типы аберра­ций — делеции, хромосомные разрывы, фрагментация, пульвери­зация, полиплоидия и эндоредупликация хромосом. Установле­но, что уровень аберраций хромосом зависел от дозы и продол­жительности действия вируса.

Исследования показывают, что многие лекарственные пре­параты, используемые в медицине и ветеринарии (сульфанила­миды, производные тиазинового ряда, нитрофураны и др.), обла­дают мутагенными свойствами. Такой же эффект возможен вследствие использования антибиотиков, а также некоторых кор­мовых добавок и консервантов, особенно при их передозировке.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И ЗАЩИТА ЖИВОТНЫХ ОТ МУТАГЕНОВ

Последние десятилетия характеризуются интенсификацией производственных процессов в промышленном и сельском хо­зяйстве. В результате этого в окружающей среде — воздухе, почве, воде — накапливаются огромные количества веществ, часть из которых обладает мутагенной и тератогенной активнос­тью. Среди них особое значение имеют химические мутагены — ДДТ, гексахлорбензол и другие пестициды из класса хлорирован­ных углеводородов, которые способны накапливаться в живых организмах. В районах интенсивного сельского хозяйства источ­ником мутагенов являются нитраты.

Перевод животноводства на промышленные технологии в нашей стране сопровождался концентрацией поголовья живот­ных на ограниченных территориях ферм и комплексов, что вы­зывает повышение концентрации микрофлоры, в том числе воз­будителей различных болезней.

Вирусы, непосредственно внедряясь своим генетическим ап­паратом в геном клеток животных или через свои биологические субстраты, обладающие антигенными свойствами, могут стать сильным фактором индуцированного мутагенеза. Для профилак­тики и лечения бактериальных и вирусных инфекций, инвазий используют инактивированные, а также живые вакцины, сыво­ротки, широкий арсенал синтезированных фармакологических средств, что, безусловно, дает положительный эффект. Однако следует оценивать и побочные результаты ветеринарной терапии,

171

что может проявляться в повышении частоты нарушений хромо­сом и ДНК в половых и соматических клетках ^самих животных, изменениях программы развития их эмбрионов*

Вместо повышения жизнеспособности из-за такого рода мута­ций будут происходить ослабление резистентности, снижение продуктивности животных и т. д.

Особенно серьезную опасность представляют химические за­грязнения среды разведения животных. Если всего три десятиле­тия назад основным удобрением полей был перегнивший навоз, то сейчас в основном используют химические удобрения. Это приводит к концентрации в кормах нитритов и нитратов, вред­ное действие которых на организм известно. Второй фактор — борьба с вредителями полей, садов и огородов. Она основана также на применении химических соединений — пестицидов, ко­торые обладают очень сильными мутагенными свойствами. От­мечается, что большинство пестицидов устойчивы к химическо­му и биологическому разложению и имеют высокий уровень токсичности. Перечень вредных химических веществ, с которы­ми контактируют животные, огромен.

В этой связи важное значение имеет экологический мониторинг среды разведения животных, предусматривающий определение ха­рактера и уровня химических веществ в почве, воде, кормах и теле животных. Необходимо создание экологических карт хозяйств и ре­гионов, на которые наносится соответствующая информация.

Авария на Чернобыльской АЭС привела к радиоактивному загрязнению огромных территорий РФ, Украины и Белоруссии. Возникла глобальная проблема оценки генетических последствий этой катастрофы на различные биологические объекты, в том числе сельскохозяйственных животных.

Нами проведен анализ хромосом у коров швицкой породы в совхозе «Труд» Клинцовского района Брянской области. Хозяйство относится к зоне сильного загрязнения окружающей среды радио­нуклидами. В исследованных метафазах обнаружено 38,94 % аберра­ций. Соотношение разных типов аберраций было следующим:

63,96

31,54

9,90

19,81

2,71

36,04

7,25

23,42

5,37

Аберрации хромосомного типа, % В том числе парные фрагменты ацентрические кольца кольцевые хромосомы дицентрические хромосомы Аберрации хроматидного типа, % В том числе одиночные фрагменты межхромосомные обмены межхроматидные обмены

Радионуклиды, как отмечено выше, сами по себе являются мощным фактором индукции мутаций, прежде всего повреждая целостность хромосом и вызывая аберрации.

172

Но оказалось, что они при взаимодействии с химическими му­тагенами способны усугублять ситуацию. Во НИИ ветеринарной генетики и селекции (НИИВГиС) проводятся комплексные иссле­дования по эколого-ветеринарной генетике. Это раздел ветеринар­ной генетики, изучающий влияние различных экологических фак­торов на наследственность животных, устойчивость к заболевани­ям, сопряженную эволюцию микро- и макроорганизмов, генетическую обусловленность накапливать или выводить из орга­низма вредные вещества, генетически детерминированные реакции животных на лекарственные препараты и т. д. Одна из задач эко­лого-ветеринарной генетики — селекция животных на устойчивость к вредным физическим, химическим и биологическим факторам. Сотрудники НИИВГиС установили негативное влияние радиации и химических загрязняющих веществ на хромосомную нестабиль­ность, иммунный ответ к некоторым антигенам, гормональный статус и накопление химических элементов в тканях крупного рогатого скота. Проводится цитогенетический, иммуногенетичес-кий, иммунологический, химический и биохимический монито-ринги популяций сельскохозяйственных животных в экологически чистых и загрязненных районах Западной Сибири.

Неблагоприятная экологическая среда, характеризующаяся возрастанием уровня ионизирующей радиации, интенсивным ультрафиолетовым излучением и особенно действием токсичес­ких химических соединений, которыми сейчас в ряде регионов перенасыщены воздух, вода, почва и растения, повышенная кон­тактность животных с ретровирусами приводят к снижению уровня иммунитета и увеличению нестабильности генетического аппарата животных. Это может проявляться в форме образова­ния мобильных генетических элементов, способных к трансфор­мации в вирусы иммунодефицита — СПИДа у человека и анало­гичные им у животных.

Ученые подчеркивают, что проблема СПИДа (и родственных ему заболеваний, вызываемых ретровирусами — автономными генами, которые во многом сходны с вирусом иммунодефицита у человека) — это совершенно новая биологическая ситуация, с которой начинается широкое распространение приобретенной генетической патологии. При этом резкое ухудшение экологи­ческой ситуации можно считать ведущей причиной того, что именно во второй половине XX в. стали выходить из-под кон­троля процессы образования подвижных генов.

Методы эколого-генетического мониторинга в животноводстве. Увеличение частоты ранее известных или появление новых мутаций в последующих поколениях животных — показатель возрастающего действия мутагенов среды. В условиях конкретной экологической среды разведения животных важное значение имеет определение мутагенной активности как отдельных факторов, так и всего их комплекса. Здесь речь может идти о генетической активности лекар-

173

ственных препаратов, применении нетрадиционных кормовых до­бавок, гормональных обработок животных. Главное внимание, очевидно, должно уделяться анализу влияния на'стабильность ге­нома того или иного уровня загрязнения окружающей среды.

В настоящее время рекомендуется использовать следующие тесты генетической активности веществ: 1) генные мутации; 2) хромосомные аберрации; 3) обмены между сестринскими хрома­тидами; 4) микроядерный тест и др.

Для оценки частоты новых и старых возникших ранее (гене­тический груз) мутаций рекомендуется использовать цитогенети-ческий метод, анализ мономорфных систем белков, учитывать частоту врожденных аномалий, спонтанных абортов и мертво-рождений, соотношение полов в потомстве животных. Образова­ние хромосомной аберрации или необычного типа белка, кото­рых не было у родственных животных, служит доказательством вновь образовавшейся мутации.

Анализ частоты сестринских хроматидных обменов в лимфо­цитах крови дает возможность установить наличие генетической активности при воздействии на организм того или иного химичес­кого агента. Этот метод в 1972 г. предложили А. Ф. Захаров и Н. А. Еголина. Сущность его состоит в том, что в культивируемые in vitro лимфоциты, стимулированные для прохождения митозов фитогемагглютинином, вводят аналог тимидина 5-бромдезокси-уридин (БДУ). В зависимости от времени его добавки в среду (первый или второй клеточный цикл) он включается в одну или обе сестринские хроматиды. При соответствующей обработке пре­паратов и использовании красителя Гимзы под микроскопом можно видеть хромосомы с одной окрашенной (БДУ включился) и с другой неокрашенной хроматидами. В отдельных хромосомах наблюдают дифференциальную окраску хроматид — чередование темных и светлых участков. Это значит, что произошли измене­ния, т. е. обмены между сестринскими хроматидами (СХО). Вы­сокая частота СХО свидетельствует о мутагенном действии изуча­емого вещества, с которым контактировали клетки крови.

Этот метод дополняют анализом частоты разрывов хромосом, других аберраций, полученных от тех же животных, но лучше при сплошной окраске.

В последнее время предложен еще один чувствительный метод выявления мутагенности факторов среды — так называе­мый микроядерный тест. Дело в том, что дополнительные ма­ленькие ядра (микроядра) на окрашенных мазках крови образу­ются за счет целых хромосом или их фрагментов, которые при делении не включаются в основное ядро из-за повреждений. Наблюдается возрастание числа микроядер в эритроцитах млеко­питающих при воздействии мутагенов. Для этих же целей аде­кватные результаты может дать анализ частоты нерасхождений хромосом в клетках костного мозга на стадии анафазы.

174

Возрастание частоты злокачественных новообразований, в том числе и лейкозов у человека и животных, ученые обоснованно связывают с загрязнением окружающей среды. Установлено, что многие мутагены одновременно являются и канцерогенами — факторами, ведущими к злокачественной трансформации клеток. Следовательно, распространение в среде разведения животных генетически активных агентов может приводить не только к повышению частоты мутаций, но и к возрастанию частоты зло­качественных новообразований.

Эта проблема в ветеринарии — одна из актуальных и очень непроста для решения. Исследования ученых показали существо­вание РНК-содержащих или ретровирусов, способных при ин­фекции встраиваться в геном клеток животных и нарушать их генетическую программу. С другой стороны, в нормальных клет­ках млекопитающих признано существование участков ДНК, сходных по строению с РНК ретровирусов. Это так называемые протоонкогены, принимающие участие в контроле клеточного цикла. Последние, как полагают ученые, превращаются в онкоге­ны, что приводит к нарушению их экспрессии и развитию раково­го процесса. Толчком этого события могут быть вирусные инфек­ции, действие на организм физических и химических мутагенов.

Генетическая резистентность организмов при этом имеет зна­чение. Одни животные остаются только инфицированными рет-ровирусами, что обнаруживают по реакции иммунодиффузии или с помощью ДНК-зондирования, у других вскоре развивается лей­коз или другая форма рака. Для выявления устойчивости живот­ных к лейкозам важное значение имеет оценка стабильности ге­нома. Одними из таких критериев могут быть частота полиплои­дии, разрывов хромосом, изменчивость хромоцентров. По нашим данным, последний показатель у крупного рогатого скота, пред­расположенного к лейкозу, достоверно отличается от нормы.